范業(yè)剛，曹利慧

（衡水學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河北衡水053000）

荷葉屬睡蓮科植物蓮的葉片，是國家衛(wèi)生部公布的既是食品又是藥品的植物。荷葉中富含多種具有生物活性的成分，如荷葉精油、荷葉生物堿、荷葉多糖及荷葉黃酮等，其中荷葉黃酮是其主要活性物質(zhì)。報道顯示，黃酮類化合物對治療血管病有很好的效果，具有抗氧化、穩(wěn)固血管、疏通血管、防止高齡人的血壓疾病等功效，對身體代謝和人體免疫也有重要作用。所以，針對影響荷葉總黃酮提取的因素進(jìn)行研究，選擇優(yōu)良的提取工藝，提高荷葉總黃酮的提取率，研究其總黃酮抗氧化性，對人體健康保護(hù)具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

荷葉樣品，河北衡水湖；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、HO、水楊酸，均為分析純；蘆丁對照品，含量98.7%，化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品，上海金穗生物科技有限公司。

722型可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；FA2004B型電子天平，上海衡平儀器儀表廠；FW100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；80-2型高速離心機，金壇市國旺實驗儀器廠；BL6-180A型超聲波清洗機，上海碧浪儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，鄭州長盛實驗儀器有限公司；GZH-DH-X型電熱恒溫干燥箱，鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司。

1.2 薄荷葉總黃酮提取的單因素實驗

將風(fēng)干的荷葉置于干燥的粉碎機，粉碎4 min 后，過60 目分樣篩，得到所需荷葉樣品，儲存于密封容器中，待用。

荷葉中總黃酮的提取流程：預(yù)處理后的荷葉粉→加入乙醇→超聲提取→冷卻至室溫→離心→收集上清液→測吸光度→計算黃酮含量。

1.2.1 料液比對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)備75%乙醇溶液，電子天平稱量1.00 g處理備用的荷葉粉末，依據(jù)料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14 分別混合，實驗時間25 min，溫度45℃，進(jìn)行總黃酮提取。然后將得到的提取液離心分離15 min（轉(zhuǎn)速5 000 r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25 mL，取1 mL清液進(jìn)行黃酮含量測定。

1.2.2 實驗溫度對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)備75%乙醇溶液，用電子天平稱量1.00 g處理備用的荷葉粉末，依據(jù)料液比1∶10 混合，實驗時間為25 min，分別在溫度為25℃、35℃、45℃、55℃和65℃的實驗條件下提取總黃酮。然后將得到的提取液離心分離15 min（轉(zhuǎn)速為5 000 r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25 mL，取1.00 mL清液進(jìn)行黃酮含量測定。

1.2.3 不同乙醇濃度對提取總黃酮提取率的影響

用電子天平稱量1.00 g處理備用的荷葉粉末，依據(jù)料液比1∶10，加入不同濃度（45%、55%、65%、75%、85%）的乙醇，實驗時間為25 min，溫度45℃，進(jìn)行總黃酮提取。然后將得到提取液離心分離15 min（轉(zhuǎn)速為5 000 r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25 mL，取1.00 mL清液進(jìn)行黃酮含量測定。

1.2.4 超聲時間對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)備75%乙醇溶液，用電子天平稱量1.00 g處理備用的荷葉粉末，依據(jù)料液比1∶10 混合，超聲溫度45℃，超聲提取時間分別為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min。然后將得到提取液離心分離15 min（轉(zhuǎn)速為5 000 r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25 mL，取1.00 mL清液進(jìn)行黃酮含量測定。

1.3 正交實驗

表1 正交因素水平表

綜合以上的單因素實驗再次進(jìn)行正交實驗，以確定提取荷葉總黃酮的最佳實驗方案。正交因素水平表見表1。

1.4 總黃酮含量測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將10 mg 蘆丁溶于75%乙醇中，小幅度地?fù)u晃，靜置后使用蒸餾水定容至10 mL，得到濃度為1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00mL、1.20 mL 蘆丁溶液放入20 mL 比色管中，量取1.0 mL濃度為5% NaNO溶液，加入試管，搖勻后靜置8 min；量取1.0 mL濃度為10%的Al（NO）溶液，加入比色管，輕晃后放置8 min；量取10.0 mL濃度為5%的氫氧化鈉溶液，加入比色管；向比色管中加入75%的乙醇至20 mL，輕晃，靜置18 min。510 nm 處測定各溶液的吸光度，做出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 黃酮含量的計算

準(zhǔn)確量1.2 所得的清液1.0 mL，按以上步驟在510 nm 的位置檢測其吸光度值。依照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出對應(yīng)的黃酮濃度，依照公式計算黃酮含量。

式中：a—稀釋倍數(shù)；c—黃酮濃度，mg/mL；V—提取液總體積，mL；W—甘草粉質(zhì)量，g。

1.5 荷葉總黃酮的抗氧化性

1.5.1 對DPPH自由基的清除能力

（1）配制所需濃度的DPPH溶液

用95%乙醇溶液對0.011 2 g的DPPH進(jìn)行溶解；將上述溶液加入到50 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶液定容。

（2）測試DPPH自由基本身的吸光值A(chǔ)

取配好的DPPH 溶液2.00 mL 于試管中；移取2.00 mL的蒸餾水加入比色管，定容，輕晃，陰暗處靜置18 min；測定溶液在510 nm位置的吸光值A(chǔ)。測試3次，取均值。

（3）測定加入黃酮后溶液的吸光值A(chǔ)

將不同濃度的樣品溶液2.00 mL 用移液管移至試管中；取配好的DPPH溶液2.00 mL，加入比色管，定容，輕晃，背光處放置18 min；測定510 nm 處的吸光值A(chǔ)。重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。

（4）測試黃酮本身的吸光值A(chǔ)

分別將不同濃度的樣品溶液用移液管移取2.0 mL至不同試管中；量取2.0 mL 蒸餾水放入比色管，定容，輕晃，陰暗處放置18 min；測定510 nm 處的吸光值A(chǔ)。重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。相同步驟測定相同濃度V標(biāo)準(zhǔn)液的清除能力為對照。

（5）計算DPPH·清除率：

1.5.2 對羥自由基（·OH）的清除作用

1.5.2.1 測試羥自由基本身的吸光值D

（1）量取2.00 mL蒸餾水放入比色管。

（2）量取2.00 mL 濃度為6 mmol/L 的FeSO溶液，加入比色管后搖勻，放置15 min。

（3）量取2.00 mL 濃度為6 mmol/L 的水楊酸，加入比色管后搖勻，放置15 min。

（4）量取2.00 mL HO溶液，加入比色管搖勻，放置15 min。

（5）測出溶液在510 nm下的吸光度值，記為D。

1.5.2.2 測定將荷葉黃酮提取液加入到羥自由基后溶液的吸光值D

將1.5.2.1（1）中2.00 mL 蒸餾水換為2.00 mL 不同濃度的荷葉提取液，按照1.5.2.1 的實驗流程，測出加入提取液后溶液的吸光度，記為D。

1.5.2.3 測試不同濃度荷葉提取液本身的吸光值D

1.5.2.4 相同步驟配制相同濃度的V標(biāo)準(zhǔn)液為對照

1.5.2.5 計算羥自由基的清除率

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)圖1 可看出，樣液濃度與吸光度值在0～80 mg/L 之間成正比，有良好的線性關(guān)系，樣液濃度越高，吸光值越大。

2.2 單因素實驗結(jié)果

圖2 料液比對黃酮含量的影響

2.2.1 料液比對總黃酮提取率的影響從圖2看出，料液比增大，黃酮含量緩慢增加，并且料液比為1∶10時黃酮含量最大，為1.45 g/100 g；當(dāng)料液比繼續(xù)增大時，黃酮含量不再增加，反而減小。這是因為，當(dāng)荷葉粉末的量不變，乙醇的量不斷增大，黃酮與乙醇接觸的可能性變大。當(dāng)黃酮完全溶解時，黃酮含量為定值，乙醇的量仍舊增大，從而出現(xiàn)沉淀，使黃酮含量減小。

2.2.2 實驗溫度對總黃酮提取率的影響

圖3 溫度對黃酮含量的影響

由圖3 可見，黃酮含量隨著溫度的增高而增加，并且在實驗溫度為45℃時黃酮含量達(dá)到最大，為1.28 g/100 g。當(dāng)實驗溫度超過45℃時，隨著溫度的升高黃酮含量不再增加，而是呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為從熱動力學(xué)角度來看，溫度升高會加速物質(zhì)的運動，還會加速溶劑與被提取物之間的物質(zhì)交換，從而提高荷葉總黃酮的析出；但是黃酮本身具有還原性，溫度過高會導(dǎo)致黃酮類化合物發(fā)生水解反應(yīng)，所以荷葉總黃酮的析出減少。

2.2.3 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

由圖4可見，乙醇濃度為75%時，黃酮含量最高，為1.56 g/100 g，乙醇濃度更高時，黃酮含量下降。造成這個現(xiàn)象的原因可能是因為在一定范圍內(nèi)所用乙醇濃度越大，溶劑極性就越小，而且黃酮類物質(zhì)極性偏低。根據(jù)相似相溶原理，溶劑極性小有利于荷葉總黃酮類化合物的析出；但是當(dāng)乙醇濃度超過一定范圍時，溶劑的極性不再減小，反而增大，所以荷葉總黃酮的析出減少。

圖4 溶劑濃度對黃酮含量的影響

圖5 超聲時間對黃酮含量的影響

2.2.4 超聲時間對總黃酮提取率的影響由圖5 可見，隨超聲時間增加黃酮含量逐漸上升。 60 min 時，黃酮含量出現(xiàn)峰值1.55 g/100 g。時間延長，黃酮含量下降。因為提取初期，超聲時間長利于荷葉總黃酮的析出，但是時間過長，加熱導(dǎo)致黃酮類化合物水解，黃酮含量下降。

2.3 最佳工藝條件優(yōu)化

表2 超聲波提取法正交實驗結(jié)果

根據(jù)正交表排列，進(jìn)行正交實驗，得到表2 所示結(jié)果。由表2 可知，影響總黃酮提取率的4 種因素的影響程度為：D＞B＞C＞A，即：溶劑濃度、溫度、料液比、時間。所以超聲提取荷葉總黃酮最優(yōu)的提取組合為：ABCD，即：提取溶劑為75%濃度的乙醇溶液，料液比選用1∶12（g/mL），超聲時間為45 min，提取溫度為45℃。

2.4 荷葉總黃酮抗氧化性研究

2.4.1 總黃酮對DPPH·清除能力測定

圖6 總黃酮和VC清除DPPH的能力

由圖6 可看出，荷葉總黃酮對DPPH 自由基的清除能力與總黃酮的濃度成正比例關(guān)系，當(dāng)黃酮含量達(dá)到0.400 mg/mL 時，清除率達(dá)到了58%，相比較V濃度為0.400 mg/mL 時清除率偏低。由此可以得出，荷葉總黃酮對DPPH的清除能力比較強，稍弱于V。

2.4.2 總黃酮對羥自由基清除能力測定

由圖7 看出，荷葉黃酮對羥自由基有一定的清除能力。隨著荷葉總黃酮和Vc 質(zhì)量濃度的增加，兩種物質(zhì)清除羥自由基的能力逐漸增加。當(dāng)黃酮的濃度與Vc 濃度相同時，對羥自由基的清除率分別為52.9%、59.5%。由此可得荷葉總黃酮清除羥自由基的能力比Vc稍弱。

圖7 總黃酮和VC清除羥自由基的能力

3 結(jié)束語

實驗通過對超聲波法提取荷葉總黃酮過程中的四種可能影響實驗結(jié)果的因素進(jìn)行研究與分析，并對總黃酮的抗氧化能力進(jìn)行測定，得出四種因素對總黃酮提取含量的影響大小順序為：乙醇濃度＞超聲溫度＞料液比＞超聲時間。通過單因素與正交實驗得出最佳的實驗方案為：超聲時間45 min，溫度45℃，料液比1∶12（g/mL），乙醇濃度75%。荷葉總黃酮具有一定的抗氧化性，且抗氧化性隨濃度的增大而增強，但比等濃度的V的清除能力要低，表明荷葉提取物可以作為有效的抗氧化成分來進(jìn)行開發(fā)研究。