陳頡

摘 要 在以科研實際應用為背景的高考命題中，PCR技術相關知識點的考查也層出不窮。PCR技術的操作與應用是學生普遍反映的基因工程考題的難點之一。高三一輪復習具有承上啟下的特點。在高三一輪復習中，針對PCR技術，教師可通過微視頻講解、數形結合、節(jié)選例題、引導學生小組討論等手段，夯實基本概念，探討條件優(yōu)化，拓展應用類型，層層遞進，突破教學重難點。

關鍵詞 高中生物 一輪復習 PCR

自20世紀80年代多聚酶鏈式反應（PCR）與熱穩(wěn)定型DNA聚合酶（Taq酶）被發(fā)現以來，DNA擴增技術有了突破性的進展，PCR技術在現代基因工程操作中的應用也越來越廣。在以科研實際應用為背景的高考命題中，PCR技術相關知識點的考查也層出不窮。學生普遍反映基因工程考題的難點之一為PCR技術的操作與應用。因此，筆者在一輪復習中就如何突破PCR技術的教學重難點作了以下的嘗試。

一、PCR技術的知識點架構

高三一輪復習具有承上啟下的特點。在復習中教師既要幫助學生對所學知識進行提煉，又要注重學生在學科核心素養(yǎng)方面的提升?；诰S果斯基的最近發(fā)展區(qū)理論，筆者把高中生物有可能涉及的PCR技術知識點做了如圖1所示的架構設計。在這個知識點架構中，“基本概念”和“條件優(yōu)化”兩部分間是遞進關系，都是重要的基礎性知識。只有深刻理解和掌握這兩部分內容，才能完成“應用類型”這一學生難于理解和運用部分的學習。而“應用類型”的知識點之間也是遞進關系。筆者通過適當選取與之相關的高考試題，依據這種遞進關系把一道試題拆解成梯度難度的多個問題，幫助學生突破這一難點。

二、PCR技術重難點的突破

在突破PCR技術重難點的教學實踐中，筆者是通過適當采用微視頻講解、數形結合、節(jié)選例題、引導學生小組討論等教學手段來達成的。

（一）夯實PCR技術基本概念

PCR的全稱、原理、原料、基本過程等，都是已經學習過的知識性內容，在課堂教學過程中，教師可采取由學生依據學案進行回顧作答即可。

由于教材對PCR反應的基本過程描述非常簡單，圖示為靜態(tài)圖示，導致部分學生理解困難。在視頻網站上有很多動態(tài)模擬視頻，筆者挑選了一段約80秒的微視頻，在課堂上連續(xù)播放兩次。筆者在第一次播放視頻的過程中，邊播放邊補充講解;在第二次播放視頻前，提醒學生注意其與細胞內DNA復制的區(qū)別，再讓學生自行觀看體會;之后引導學生分組討論，結合對細胞內DNA復制過程相關知識的回顧，完成比較與總結（見表1）。

有些學生會認為兩者所需的原料和能量不同：PCR反應的原料是dNTP，細胞內DNA復制的原料（按教材必修模塊所述）是游離的脫氧核苷酸，并且需要ATP供能。實際上，在這兩個過程中，dNTP既可作為原料，又起到供能的作用，而ATP可為細胞中的DNA解旋過程供能[1]。

（二）探討PCR技術條件優(yōu)化

在PCR反應中，溫度和時間的控制要求如下：①解旋溫度與加入Taq酶的時間會影響擴增的特異性;②退火溫度會影響產物的特異性，也會影響引物與模板的配對;③延伸溫度取決于Taq酶的活性，延伸時間與產物的特異性及產量有關[2]。其中，與高中生物知識具有關聯性的是退火溫度的選擇及原因。筆者選取2017年江蘇高考與之相關的部分試題為例（詳見例1）。

例1 PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。退火溫度過高會破壞___▲___的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關，長度相同但___▲___的引物需要設定更高的退火溫度。

參考答案：引物與模板;GC含量高。

在PCR反應中引物的設計要求如下：①引物自身及引物之間不應存在互補序列;②引物長度及GC含量合適，以保證合適的Tm值（一定條件下的寡核苷酸解鏈溫度）;③引物在模板序列中的特異性;④引物3′端的堿基選擇等[3]。其中，除了已經討論過的GC含量的影響外，如何避免引物互補及引物的特異性這部分內容與高中生物知識聯系較大。筆者選取2011年江蘇高考與之相關的部分試題為例（詳見例2）。

例2 設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物（只標注了部分堿基序列）都不合理（見圖2），請分別說明理由。

① 1組：___ ▲___; ?②第2組：___▲___。

參考答案：引物Ⅰ與引物Ⅱ局部互補配對而失效;引物Ⅰ′自身折疊后互補配對而失效。

（三）拓展PCR技術應用類型

PCR技術的應用非常廣泛，本課教學設計選取了與高中生物課程相關度比較高的六個類型。

1.僅擴增。“僅擴增”指已經獲得了目的基因全長序列，使用PCR技術擴增該序列的操作。筆者對2017年江蘇高考題的一幅圖片做了修改（見圖3）。該圖體現了模板單鏈之間、模板單鏈與引物之間、模板單鏈與新合成單鏈之間的反向平行關系。筆者要求學生根據該圖解答：以1個DNA分子為模板，進行n次PCR循環(huán)，①至少需要多少個引物？（2n+1-2）②形成的DNA分子中含多少個引物1？（2n-1）③含引物1的單鏈有多少條？（2n-1）④含引物1的DNA分子有多少個？（2n-1）以上思考有助于學生理解“僅擴增”PCR的過程，以及解答后續(xù)例題。

2.擴增且截取?！皵U增且截取”指目的基因位于模板DNA分子中間位置，從模板DNA中截取目的基因并擴增的操作。筆者展示圖3的原圖（圖4），要求學生比較兩圖的異同。

該過程的數量結果大部分與“僅擴增”相同，筆者引導學生對該圖繼續(xù)進行解答：①第幾輪產物中首次出現兩端等長的目的基因片段？（3）②第3輪產物中兩端等長的目的基因片段占所有產物的比例是多少？（1/4）③第n輪產物中兩端等長的目的基因片段的數量有多少？（2n-2n）通過比較圖3和圖4，學生能夠更準確地掌握PCR的兩種最基本的應用類型，為更好地理解后續(xù)其他應用類型打好基礎。

3.擴增且延長?！皵U增且延長”指在引物的5′端增加若干堿基，獲得比模板DNA更長的產物分子的操作。筆者選取2014年南通二模與之相關的部分試題為例（詳見例3）。

例3 如圖5，①過程從野生酵母菌染色體DNA中PCR擴增介導序列時，科研人員設計了如下一對引物：GAATTCGACCTCAAATCAGGTAGG和TTGCATTGACTTACACCTAGG，其中下劃線部分序列的設計依據是___▲___，方框部分序列的設計目的是___▲___。

參考答案：介導序列兩端的部分DNA序列;使擴增出的介導序列兩端含限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的識別序列。

筆者引導學生思考為什么把堿基添加在引物的5′端，提示學生聯系DNA的化學結構及DNA聚合酶的功能特點等知識。并適當補充通過設計引物來延長擴增產物長度的相關應用，如在目的基因前連接啟動子、連接兩段目的基因片段、添加保護序列等。

4.定點誘變。“定點誘變”指在引物中改變個別堿基，造成擴增產物發(fā)生基因突變的操作。筆者以2019年南通二模題為例（詳見例4）。

例4 如圖6，通過設計引物，運用PCR技術可以實現目的基因的定點誘變。下圖為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應體系中引物1和引物2的5′端分別設計增加限制酶a和限制酶b的識別位點。有關敘述正確的是（多選） ? ? ? ? ?。

A.引物中設計兩種限制酶識別位點有利于目的基因定向插入

B.在PCR反應體系中還需要加入4種游離核苷酸、解旋酶、Taq酶等

C.第3輪PCR，引物1能與圖中②結合并且形成兩條鏈等長的突變基因

D.第3輪PCR結束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2

參考答案：AC。

在該題所述的操作中，通過引物的設計，將模板DNA分子中的G//C堿基對，替換為擴增產物分子中的A//T堿基對。該題設置的選項恰好覆蓋了本課已復習內容，可起到隨堂檢測、學情反饋的作用。

在講解該題之后，筆者進一步追問：采用題述定點誘變方法，只能誘變目的基因兩端的位點，如果需要在目的基因靠中間的位置進行定點誘變，又該如何操作？由此引出重疊延伸PCR技術（圖7），該技術亦可用于擴增長片段DNA和融合基因構建[4]。

5.定量分析?！岸糠治觥敝冈赑CR反應體系中加入標記物，從而測算PCR產物或模板的量的操作。常用的標記物為熒光標記，通過PCR進行定量的方法稱為qPCR。近年又發(fā)展出了實時熒光定量PCR，稱為RT-qPCR。實時熒光定量PCR的標記方法又分為非特異性標記法和特異性標記法，其中前者比較容易理解。筆者從網絡上搜索到了一段約100秒的視頻進行播放，幫助學生初步理解qPCR。而對于后者，筆者選取2017年南通二模與之相關的部分試題為例（詳見例5）。

例5 如圖8～9，實時熒光定量PCR（qPCR）實現了PCR從定性到定量的飛躍。TaqMan探針是qPCR技術中一種常用探針（如圖8），其5′末端連接熒光基團（R），3′末端連接淬滅劑（Q）。當探針完整時，R發(fā)出的熒光信號被Q吸收而不發(fā)熒光。在qPCR擴增過程中，當Taq酶遇到探針時會使探針水解而釋放出游離的R和Q，R發(fā)出的熒光信號被相應儀器檢測到，熒光信號的累積與PCR產物數量完全同步（如圖9）。請回答下列問題：

（1）與質粒相比，TaqMan探針中除熒光基團、淬滅劑外，特有的化學成分是___▲___。

（2）根據TaqMan探針功能分析，探針中堿基序列的設計應主要依據___▲___，同時要避免與___▲___發(fā)生堿基互補配對。

（3）若每分子探針水解釋放的R基因熒光強度為a，加入的目的基因為b個，請根據圖示過程，使用數學公式表示反應體系中熒光信號強度（Rn）與擴增次數（n）之間的關系：___▲___。

參考答案：（1）核糖和尿嘧啶;（2）目的基因內部部分核苷酸序列、引物;（3）Rn=ab×（2n-1）。

例5涉及到遺傳物質的化學組成、PCR技術的操作要點、熒光定量PCR的數量關系等。其中第（3）小題對學生的綜合能力要求較高。為了幫助部分解題有困難的學生，筆者把問題拆解成以下4個：①每個模板分子的雙鏈都能與探針配對嗎？（只有一條單鏈與探針配對）②游離出的R基團數與新合成的單鏈數的關系？（是新合成單鏈數的一半，相當于每合成一個新的分子，會游離出一個R基團，即2n - 1）③以1個目的基因為模板，總的熒光強度為何值？④以b個目的基因為模板，總的熒光強度為何值？以上問題的設置，降低了思維跨度，幫助學生不斷達到自己的“最近發(fā)展區(qū)”。

6.反轉錄PCR?！胺崔D錄PCR”指以RNA為模板進行的PCR操作，可以聯合定量分析，也可以不定量。其應用的場景有：①檢測目的基因的表達量（mRNA的量）;②檢測RNA病毒的含量;③直接由mRNA獲得大量cDNA。其中場景①可與基因工程的檢測與鑒定聯系，場景②可與多種RNA病毒（新型冠狀病毒、禽流感病毒等）的檢測聯系，場景③可與構建cDNA文庫聯系。以上場景均來自學生已經學習的重要知識點或感觸頗深的社會熱點，有助于進一步提升學生的學科核心素養(yǎng)。反轉錄PCR與常規(guī)PCR相比，除了初始模板分子不同外，還需要多加入一種特殊的酶——熱穩(wěn)定型反轉錄酶，兩者的原料、過程、數量關系等，在目前高中生物知識范疇內均類似，本文不再展開。

三、教學反思

在本課的教學實踐中，筆者通過對試題的遴選、刪減、加工和重新編排，有的放矢地對相關知識點精講精練，幫助學生層層遞進地理解與掌握PCR技術，成功地突破了這一重難點，取得了較好的教學效果。近年來，基因工程及PCR技術的發(fā)展日新月異，有限的教學設計中無法囊括PCR技術的所有應用類型，特別是相對高中生而言比較復雜的巢式PCR、多重PCR等。但是相信經過這樣的訓練，學生在將來的學習、科研生涯中若遇到PCR技術在其他方面的應用，也能很快觸類旁通。

[參 考 文 獻]

[1]劉學廷.高中生對DNA復制過程的幾個認識誤區(qū)[J].中學生物教學，2016（1/2）：80-81.

[2]葉倩.PCR技術綜述[J].科技創(chuàng)新導報，2009（5）：5.

[3]尤超，趙大球，梁乘榜，等.PCR引物設計方法綜述[J].現代農業(yè)科技，2011（17）：48-51.

[4]李守宇.重疊延伸PCR技術及其在生物學中的應用[J].生物學教學，2013，38（4）：65-66.

（責任編輯：趙曉梅）