黃 策， 王祎龍， 劉海亮,2

(1. 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092； 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所，上海 200123)

哺乳動(dòng)物的衰老是一個(gè)復(fù)雜的包含細(xì)胞和組織多層次的系統(tǒng)性退化過(guò)程，在衰老的過(guò)程中多個(gè)組織器官表現(xiàn)出不可逆的類似熵增的功能性下降和結(jié)構(gòu)改變[1]，如與年齡相關(guān)的心肌細(xì)胞損傷導(dǎo)致的心臟組織纖維化，是心衰臨床病理的重要標(biāo)志[2]；伴隨年齡出現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元數(shù)量下降，則是導(dǎo)致阿爾茨海默病和其他神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素[3]，也因如此，衰老被認(rèn)為是人類死亡的最大風(fēng)險(xiǎn)元素。關(guān)于衰老的分子機(jī)制，目前存在多種假說(shuō)，包括“端粒假說(shuō)”“自由基假說(shuō)”“基因組不穩(wěn)定”“干細(xì)胞枯竭”“表觀遺傳學(xué)說(shuō)”等[4]，針對(duì)不同的衰老假說(shuō)發(fā)現(xiàn)的分子調(diào)控通路，研究人員致力于尋找靶向關(guān)鍵分子的抗衰老藥物，以期延緩衰老或減少年齡相關(guān)疾病的發(fā)生。目前陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了包括“二甲雙胍”“白藜蘆醇”“β-煙酰胺單核苷酸”等多種具有潛在抗衰老效果的藥物[5]。

而隨著聯(lián)體共生(parabiosis)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，研究人員開(kāi)始關(guān)注血漿內(nèi)源性分子在抗衰老中的作用[6]。2013年，哈佛大學(xué)Loffredo等[7]首次發(fā)現(xiàn)在小鼠血漿中，TGF-β超家族成員中的循環(huán)因子生長(zhǎng)分化因子11(growth differentiation factor-11,GDF11)，隨著年齡的增長(zhǎng)出現(xiàn)顯著下降，通過(guò)給老年小鼠補(bǔ)充GDF11至年輕小鼠水平，不僅逆轉(zhuǎn)了衰老相關(guān)的心肌肥大，同時(shí)增加了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生[8]，這顯示GDF11在多種組織器官中具有靶向修飾衰老的潛能，為血液循環(huán)因子抗衰老帶來(lái)了曙光。之后多個(gè)研究小組通過(guò)ELISA發(fā)現(xiàn)在小鼠與人體血液循環(huán)系統(tǒng)中的GDF11隨年齡增加出現(xiàn)相關(guān)性下降。而在2015年，Egerman等[9]開(kāi)始質(zhì)疑Loffredo等[7]在實(shí)驗(yàn)中使用的GDF11抗體的特異性，他們開(kāi)發(fā)了一種新的GDF11特異性免疫測(cè)定法，發(fā)現(xiàn)該測(cè)定法與肌生長(zhǎng)抑制素(又稱生長(zhǎng)分化因子8)(growth differentiation factor-8, GDF8)沒(méi)有交叉反應(yīng)。使用這種方法，隨著年齡的增長(zhǎng)，血液循環(huán)中的GDF11并不會(huì)減少。在2016年，Schafer等[10]使用LC-MS/MS對(duì)160名22～93歲健康人的血漿進(jìn)行檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)GDF11分子前結(jié)構(gòu)域和GDF11的成熟蛋白與年齡呈正相關(guān)。

因此，在衰老過(guò)程中GDF11的真實(shí)作用尚且存疑。目前GDF11的治療性作用主要使用GDF11的重組蛋白來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而GDF11重組蛋白能否發(fā)揮正常的功能目前依然存在爭(zhēng)議。像TGF-β超家族其他成員一樣，GDF11蛋白在合成過(guò)程中，首先被翻譯為無(wú)活性的前體蛋白同型二聚體，包括信號(hào)肽、N端前肽和C端成熟結(jié)構(gòu)域三部分。之后GDF11前體蛋白同型二聚體被弗林蛋白酶(Furin)進(jìn)行初始蛋白水解，從C端成熟域切割N端前肽。之后由BMP1/TLD蛋白酶介導(dǎo)第二步蛋白水解，切割N-末端前肽并釋放成熟的GDF11二聚體[11]。盡管GDF與GDF8的成熟體高度同源，這是眾多研究存在爭(zhēng)議的地方，但是他們的前肽在蛋白序列中僅有49%的同源性，究竟哪一部分具有延緩衰老的作用目前尚未可知。本研究分別構(gòu)建了包含C端成熟結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域和GDF11前體的質(zhì)粒，通過(guò)過(guò)表達(dá)相關(guān)結(jié)構(gòu)域，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)(Morris water maze, MWM)，分別從細(xì)胞和動(dòng)物水平來(lái)探索GDF11是否有延緩衰老，提高認(rèn)知水平的能力。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室；胎牛血清(FBS)，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和DMEM/F12的培養(yǎng)基中培養(yǎng)293T細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2～3天更換培養(yǎng)基。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

將GDF11-C端活性結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域和GDF11前體構(gòu)建于AAVS1 Donor載體上。使用LipoFiterTM3.0脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(漢恒生物科技有限公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 RNA提取與RT-qPCR

使用TRIzol試劑(Invitrogen公司)分離細(xì)胞總RNA，之后通過(guò)DNA酶處理和去除試劑盒(Ambion公司)進(jìn)一步純化RNA。使用SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis試劑盒(Invitrogen公司)，將RNA樣品(每個(gè)1 μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq和ROX(Bio-Rad公司)在7500或Q7實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems公司)上進(jìn)行RT-qPCR。引物信息如下。GDF11-N(5′→3′)： ACAGTGGACTTT-GAGGCTTTC(正向)，TAAGAGCAGCCACAGC-GAT(反向)；GDF-C(5′→3′)： GCCTTTGATC-CCAGTGGCACAGAC(正向)，AGTCCCAGCCGA-AAGCCTCAAAGT(反向)。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以1×104/孔接種于6孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，貼壁培養(yǎng)過(guò)夜后轉(zhuǎn)染48 h后，終止培養(yǎng)，用0.25% Trypsin EDTA消化細(xì)胞，離心(300×g，5 min),之后棄上清液，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次。用預(yù)冷的70%無(wú)水乙醇固定過(guò)夜，再加入碘化丙啶染色液200 μL，避光染色30 min，之后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用FlowJo軟件分析細(xì)胞周期。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次以上統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及尾靜脈高壓注射

C57BL/6 SPF小鼠(8月齡)從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司獲得。每個(gè)籠子中飼養(yǎng)5只小鼠，按12 h光照/黑暗時(shí)間表飼養(yǎng)，并自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)至15月齡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物研究委員會(huì)批準(zhǔn)。將小鼠按每組5只分為4組，通過(guò)尾靜脈高壓注射的方式注射質(zhì)粒，按小鼠體重10%計(jì)算質(zhì)粒注射溶液的體積，于5～7 s將100 μg/mL的質(zhì)?？焖偻迫胄∈篌w內(nèi)。

1.6 MWM

MWM用于測(cè)量基于海馬的空間記憶和學(xué)習(xí)功能。MWM設(shè)備由一個(gè)圓形池(直徑為1.2 m)組成，水溫保持在24～26 ℃。一個(gè)干凈的圓形逃生平臺(tái)(直徑11 cm)浸沒(méi)在水面以下約1.5 cm處。為了從水中逃生，小鼠不得不找到隱藏的逃生平臺(tái)。每次采集試驗(yàn)都是通過(guò)將小鼠放在面對(duì)水箱壁的水中進(jìn)行。培訓(xùn)方案為期5 d(每天進(jìn)行4次試驗(yàn))。對(duì)于每個(gè)試驗(yàn)，將動(dòng)物放在4個(gè)可能位置之一附近的迷宮中： 北、南、東南或西北。每個(gè)試驗(yàn)均隨機(jī)確定位置。在每次試驗(yàn)期間，給動(dòng)物60 s以定位浸沒(méi)平臺(tái)。如果小鼠沒(méi)有找到平臺(tái)，它將被輕輕地帶到平臺(tái)上。找到或被引導(dǎo)到平臺(tái)后，將動(dòng)物留在平臺(tái)上20 s，以熟悉其在視覺(jué)提示方面的位置。在5只小鼠的小隊(duì)中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)測(cè)試小隊(duì)中均代表所有治療組。每只小鼠的審判間隔大約為20 min。訓(xùn)練后24 h，對(duì)小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。在探測(cè)試驗(yàn)期間，將平臺(tái)移開(kāi)，讓小鼠在水池中游泳60 s。游泳池中央天花板上安裝了一個(gè)攝像頭，用于跟蹤小鼠的游泳路線。使用計(jì)算機(jī)化的動(dòng)物跟蹤系統(tǒng)(Etho Vision XT Base；英國(guó)諾丁漢Noldus公司)收集數(shù)據(jù)，該系統(tǒng)記錄了路徑長(zhǎng)度，游泳速度，在池的每個(gè)象限中花費(fèi)的時(shí)間，以及到達(dá)平臺(tái)所花費(fèi)的時(shí)間，在平臺(tái)區(qū)停留的時(shí)間。試驗(yàn)始終在下午1～5點(diǎn)進(jìn)行。

1.7 RNA測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

用TRIzol(Invitrogen公司)從細(xì)胞中提取總RNA，并用分光光度計(jì)(NanoDrop 1000; Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行定量，使用(260/280 nm>1.8)的樣品。本研究使用DNBSEQ平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)序，在數(shù)據(jù)分析前首先去除低質(zhì)量、位置堿基N含量過(guò)高的reads，以此保證結(jié)果的可靠性。使用Bowtie v2.0.6(bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2)構(gòu)建參考基因組的索引，并使用TopHatv2.0.9(ccb.jhu.edu/software/tophat)將配對(duì)末端的干凈讀數(shù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。基于基因長(zhǎng)度和映射到該基因的閱讀計(jì)數(shù)，并考慮測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)同時(shí)進(jìn)行的閱讀計(jì)數(shù)的影響，計(jì)算出每千個(gè)轉(zhuǎn)錄本的讀數(shù)。使用R(R-project.org)進(jìn)行WGCNA和KEGG富集分析，P<0.05具有顯著性。其他數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 2.0進(jìn)行分析，兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，單因素方差分析比較3組或3組以上之間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(測(cè)序數(shù)據(jù)可以根據(jù)需要聯(lián)系通信作者，將予以提供)。

2 結(jié) 果

2.1 GDF11C端成熟結(jié)構(gòu)域、N端前肽和GDF11前體質(zhì)粒構(gòu)建

如圖1A所示，GDF11蛋白在合成過(guò)程中，首先被翻譯為無(wú)活性的前體蛋白同型二聚體，包括信號(hào)肽、N端前肽和C端活性結(jié)構(gòu)域三部分。之后GDF11前體蛋白同型二聚體被弗林蛋白酶(Furin)進(jìn)行初始蛋白水解，從C端活性域切割N端前肽。之后由BMP1/TLD蛋白酶介導(dǎo)第二步蛋白水解，切割N-末端前肽并釋放出成熟的GDF11二聚體。因此，分別構(gòu)建了含有完整的GDF11序列的GDF11前體質(zhì)粒(GDF-FL)，只編碼C端活性結(jié)構(gòu)域(GDF11-C)和N端結(jié)構(gòu)域(GDF-N)的序列的質(zhì)粒載體。之后將3種質(zhì)粒以及空載質(zhì)粒(Vec)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的目的。如圖1B所示，在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，GDF11-FL和GDF11-N組相較于Vec組的GDF-N(P<0.001)表達(dá)水平顯著升高；GDF11-F和GDF11-C組相較于Vec組的GDF-C(P<0.001)表達(dá)水平也出現(xiàn)了顯著升高，以上結(jié)果說(shuō)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率極高，可用于之后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及小鼠尾靜脈高壓注射實(shí)驗(yàn)。

圖1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率檢測(cè)Fig.1 The efficiency of cell transfection of plasmidsA： GDF11蛋白在合成過(guò)程示意圖；B： 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后GDF11-FL、GDF11-N和GDF11-C的表達(dá)；*P<0.05，***P<0.01,****P<0.001

2.2 GDF11-C端成熟域增強(qiáng)細(xì)胞的氧化磷酸化

為了研究3種不同結(jié)構(gòu)域的GDF11對(duì)細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，對(duì)轉(zhuǎn)染了3種質(zhì)粒的293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并進(jìn)行了加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)。根據(jù)分層聚類樹(shù)(圖2A)，共得到6個(gè)非灰基因模塊，從圖中可以看出轉(zhuǎn)染GDF11前體序列質(zhì)粒的細(xì)胞與空白對(duì)照組和空載組表達(dá)模式相近，而轉(zhuǎn)染C、N兩種結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒與空白和空載組存在明顯差異。通過(guò)計(jì)算模塊與樣本間的相關(guān)系數(shù)(圖2B)，發(fā)現(xiàn)Green(R2=0.99,P<0.01)、Blue(R2=0.62,P<0.05)模塊基因的表達(dá)與GDF11-C(C.GDF11)組表現(xiàn)出極高的正相關(guān)性，Brown(R2=0.88,P<0.01)和Red(R2=0.64,P<0.05)模塊與GDF11-N(N.GDF11)組表現(xiàn)出極高的正相關(guān)性。如圖2C所示，該相關(guān)性在各組樣品間具有很好的一致性。為了進(jìn)一步尋找GDF11-C(C.GDF11)和GDF11-N(N.GDF11)參與的信號(hào)通路，對(duì)Green、Blue、Brown和Red等4個(gè)模塊進(jìn)行了富集通路分析(圖2D)，發(fā)現(xiàn)兩種不同的GDF11結(jié)構(gòu)域都參與了氧化磷酸化通路和細(xì)胞周期信號(hào)通路。

圖2 GDF11調(diào)控機(jī)制分析Fig.2 Analysis of the regulatory mechanism of GDF11A： WGCNA分析；B： WGCNA模塊與不同類型GDF11的相關(guān)性分析；C： 各樣本在不同模塊中的相關(guān)性分析；D： 各模塊富集到的通路以及關(guān)鍵調(diào)控基因

2.3 GDF11-C端成熟域可以促進(jìn)細(xì)胞增殖

根據(jù)本研究2.2部分，GDF11-C和GDF11-N與Brown模塊都有正相關(guān)性，而B(niǎo)rown模塊富集到了細(xì)胞周期信號(hào)通路，所以接下來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)染了GDF11-C、GDF11-N和Vec質(zhì)粒的293T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。流式細(xì)胞結(jié)果(圖3)顯示，與Vec組比較，GDF11-C組的G1期細(xì)胞比例下降(P<0.05)，S期細(xì)胞比例出現(xiàn)上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.36)；而GDF11-N組與Vec組相比，各個(gè)時(shí)期皆無(wú)顯著差異。由此可以看出，GDF11-C具有促進(jìn)細(xì)胞增殖能力。

圖3 GDF11-C和GDF11-N對(duì)293T細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effects of GDF11-C and GDF11-N on 293T cell cycle每組兩個(gè)樣本，*P<0.05,***P<0.01

2.4 GDF11-C端成熟域可改善老年小鼠認(rèn)知水平

在細(xì)胞水平確定了GDF11-C對(duì)細(xì)胞增殖的影響，接下來(lái)為了確定不同前肽對(duì)老年小鼠認(rèn)知的影響，通過(guò)尾靜脈高壓注射質(zhì)粒過(guò)表達(dá)相關(guān)結(jié)構(gòu)域的基因來(lái)確定GDF11-C對(duì)老年小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶的影響。對(duì)15個(gè)月大的小鼠每5天用尾靜脈高壓注射Vec、GDF11-C、GDF11-N和GDF11-FL等4種質(zhì)粒，共4次。隨后，使用MWM測(cè)試來(lái)檢查小鼠對(duì)空間學(xué)習(xí)和記憶能力。首先使用隱藏平臺(tái)進(jìn)行了5 d的訓(xùn)練試驗(yàn)，然后在24 h內(nèi)測(cè)試了短期記憶力保持力。結(jié)果顯示，在訓(xùn)練期間GDF11-C和GDF11-FL組的小鼠尋找到平臺(tái)時(shí)間縮短較明顯(圖3A)。此外在正式測(cè)試中，通過(guò)首次上平臺(tái)時(shí)間(圖4B)，GDF11-C組到達(dá)虛擬平臺(tái)的能力顯著增強(qiáng)(P<0.05)。根據(jù)穿越平臺(tái)次數(shù)的數(shù)據(jù)(圖4C)，GDF11-C組也表現(xiàn)出一定程度的提高。而且4組之間的游泳速度并無(wú)顯著差異(圖4D)，表明各組之間存在可比性。綜上所述，GDF11-C端成熟域可以增強(qiáng)老年小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

圖4 GDF11-C改善了老年小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力Fig.4 GDF11-C improved spatial learning and memory in elderly miceA： 訓(xùn)練期間小鼠尋找到平臺(tái)所用時(shí)間；B： 小鼠在測(cè)試中第1次找到平臺(tái)區(qū)域的時(shí)間；C： 測(cè)試時(shí)小鼠穿越平臺(tái)區(qū)域的頻率；D： 測(cè)試中小鼠游泳速度；*P<0.05

3 討 論

之前關(guān)于GDF11對(duì)延緩衰老的研究都是通過(guò)使用GDF11重組蛋白來(lái)進(jìn)，研究發(fā)現(xiàn)GDF11可以改善衰老小鼠的神經(jīng)發(fā)生和肌肉增殖[8,12-13]，其中多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)GDF11可以增加老年小鼠SVZ中神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量和血管密度，具有增加老年小鼠海馬中的突觸可塑性提高認(rèn)知的潛力[13-14]。然而這些研究一直受到挑戰(zhàn)，研究發(fā)現(xiàn)GDF8與GDF11在各自的活性域高度相似，所以部分學(xué)者認(rèn)為研究人員混淆了GDF8和GDF11，GDF11并不是一個(gè)伴隨著年齡下降的循環(huán)因子，隨年齡下降是GDF8，這導(dǎo)致之后使用GDF11重組蛋白做的研究存在著爭(zhēng)議[15]。因此，使用GDF11的活性結(jié)構(gòu)域能否延緩衰老還需要進(jìn)一步的研究。

在本研究中，為了避免使用常見(jiàn)的GDF11活性結(jié)構(gòu)域重組蛋白引起的爭(zhēng)議，分別構(gòu)建了包含C端成熟結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域和GDF11前體的質(zhì)粒，以探索GDF11的成熟結(jié)構(gòu)域能否發(fā)揮延緩衰老的作用，或者是否其他的結(jié)構(gòu)域和蛋白前體存在著延緩衰老的功能。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)GDF11-C端活性結(jié)構(gòu)域后，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平中GDF-C和GDF-N兩種結(jié)構(gòu)域存在著相似的共表達(dá)模式，共同激活了氧化磷酸化和細(xì)胞周期通路，但兩者也存在著不同，這些不同可能是導(dǎo)致其功能差異的關(guān)鍵。有研究報(bào)道TGF-β家族活性域可以通過(guò)TGF-β-ActRⅡ-Smad 2/3信號(hào)軸起到調(diào)控作用[16-20]，在本研究中未發(fā)現(xiàn)此通路。

本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)GDF11-C端活性結(jié)構(gòu)域，證明了GDF11活性結(jié)構(gòu)域具有延緩衰老的能力。在細(xì)胞水平中，細(xì)胞周期與細(xì)胞衰老密切相關(guān)[21]，GDF11-C端活性域可以減少細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞的比例(P<0.05)，增加S期細(xì)胞比例，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的潛力。而在動(dòng)物水平中，通過(guò)MWM，發(fā)現(xiàn)GDF11-C端活性域可以顯著提高老年小鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)能力(P<0.05)，延緩衰老引起的記憶力下降。同時(shí)，通過(guò)MWM中的游泳速度數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)老年小鼠的運(yùn)動(dòng)能力并沒(méi)有提高，這與前人研究不同[11,22]，說(shuō)明GDF11-C端活性域并沒(méi)有改善老年小鼠肌肉強(qiáng)度的能力。

雖然本研究通過(guò)使用非重組蛋白的方法證明了GDF11活性域具有提高老年小鼠認(rèn)知能力的潛力，但是依然無(wú)法解決重組蛋白GDF11和GDF8高度同源的問(wèn)題，通過(guò)構(gòu)建載體過(guò)表達(dá)GDF11活性域并不是一種可行性高的的臨床干預(yù)手段。其次，與前人相似，本研究沒(méi)有對(duì)GDF11活性域提高認(rèn)知的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究，這依然是一個(gè)黑箱結(jié)果，具有大量的研究空白。因此，GDF11在延緩衰老等領(lǐng)域依然需要廣泛而深遠(yuǎn)入的研究。