馬 玲，劉太香，薛 敏

江蘇省血液中心輸血研究室，江蘇 南京 210042

Rh 血型系統(tǒng)因其復(fù)雜多態(tài)性及臨床重要性而備受關(guān)注，其中RhD抗原免疫原性最強(qiáng)，相應(yīng)的抗D是導(dǎo)致胎兒新生兒嚴(yán)重溶血的最主要抗體，因而RhD 陰性孕婦妊娠及血液安全管理需格外重視［1］。RhD 抗原存在諸多的變異型，根據(jù)紅細(xì)胞膜上D 抗原表達(dá)的數(shù)目和性質(zhì)，大致可分為弱D、部分D以及東亞人群常見(jiàn)的Del型等。各種RhD變異型基因背景機(jī)制不一，免疫原性也不相同，尤其是Del表型的檢測(cè)及個(gè)體RhD 抗原免疫應(yīng)答情況值得重視。Del表型最初由Okubo等［2］報(bào)道，其D抗原表達(dá)非常弱，每個(gè)紅細(xì)胞膜上D抗原拷貝數(shù)低于200個(gè)［3］，常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)不出，需要通過(guò)吸收放散技術(shù)才能檢測(cè)到。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)東亞人群中初篩為RhD 陰性者中17%～30%為Del 型，其中約98%的分子遺傳背景為RHD 基 因exon 9 c.1227G>A 同義突變（RHD*01EL.01）［4］，因此該型又被稱為亞洲型DEL 血型（Asia type DEL 血型）。有研究報(bào)道在亞洲型DEL孕婦中，均未發(fā)現(xiàn)抗D抗體產(chǎn)生，因此提議，Del型孕婦可以免去孕期頻繁的抗體篩查和抗D免疫球蛋白注射［5-6］，這一理論如果獲得推廣應(yīng)用無(wú)疑有良好的社會(huì)效益。因而，研究第一步，建立RHD c.1227G>A基因位點(diǎn)高效、便捷的檢測(cè)方法十分必要。

常規(guī)Del表型的血清學(xué)檢測(cè)是通過(guò)吸收放散的方法，該操作步驟較繁瑣，對(duì)檢測(cè)人員的手法和經(jīng)驗(yàn)有一定要求，易導(dǎo)致差錯(cuò)。隨著DEL型分子機(jī)制的闡明，血型基因檢測(cè)方法的發(fā)展為DEL型鑒定提供了新的技術(shù)手段。本研究旨在建立用于檢測(cè)RHD c.1227G>A 基因分型的熔解曲線分析法，該方法基于單核苷酸熔解溫度差異而形成不同形態(tài)熔解曲線，具有較高的敏感性，可以檢測(cè)出單個(gè)堿基的差異，同時(shí)避免了常規(guī)PCR方法后續(xù)上樣、電泳、成像等操作，縮短了檢測(cè)時(shí)間，且減少了PCR 產(chǎn)物交叉污染的可能性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源

2018 年10 月—2020 年1 月于本中心進(jìn)行產(chǎn)前檢查的孕婦87例，年齡21～41 歲，中位年齡29 歲；RhD 初篩試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，采外周靜脈EDTA 抗凝血約3 mL；經(jīng)本人知情同意，且研究經(jīng)本中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器

IgG/IgM 型抗D 試劑（Sanquin 公司，荷蘭）；IgG型抗D 試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；基因組DNA 提取試劑盒（北京原平皓生物公司）；2×Taq PCR Mix（南京博爾迪生物科技有限公司）；SYBR Green Master（Roche，瑞士）；人類紅細(xì)胞RhD基因分型試劑盒（PCR?SSP）（天津秀鵬生物技術(shù)）；Labofuge 400R 低溫高速離心機(jī)（Heraeus 公司 德國(guó)）；ND?100?Spectrophotometer DNA 定量分析儀（NanoDrop 公司 美國(guó)）；Alphalmager HP 凝膠成像系統(tǒng)、ABI 7300擴(kuò)增儀（Applied Biosystem公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)試驗(yàn)

采用間接抗人球試驗(yàn)的方法，使用3～4 種不同克隆的IgG 或IgM/IgG 型抗D 試劑進(jìn)行RhD 陰性確認(rèn)。對(duì)于結(jié)果為陰性的樣本進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)，檢測(cè)是否為Del 型。具體操作步驟參考文獻(xiàn)方法［7］并略為修改，吸收用試劑為IgG/IgM型抗D與IgG型抗D試劑混合使用，吸收時(shí)間為1 h。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

查找GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中RHD基因序列（序列號(hào)為NG007494），針對(duì)1227A特異性位點(diǎn)，應(yīng)用Primer 5 引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化后的引物序列參見(jiàn)表1。另采用引物β?actin作為內(nèi)參序列［8］。

表1 熒光定量PCR所用引物

1.2.3 基因組DNA提取

離心吸取孕婦白膜層細(xì)胞，按照DNA提取試劑盒操作要求提取基因組DNA，采用ND?100?Spectro?photometer DNA 定量分析儀測(cè)定DNA 含量與純度，樣品-20 ℃保存待用。

1.2.4 熔解曲線分析

采用熒光定量PCR 分別擴(kuò)增RHD exon 9 c.1227G>A 及β?actin（作為內(nèi)參）。PCR 總體積為20 μL，引物濃度為300 nmol/L，調(diào)整DNA 模板含量約為50 ng（可以低至至少1 ng），2×SYBR Green mix 10 μL。PCR 條件為：50 ℃溫育2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，之后95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min共40 個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，并以水為模板設(shè)空白對(duì)照。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，使用儀器默認(rèn)的熔解曲線分析程序（95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s）進(jìn)行分析，期間連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，根據(jù)熔解溫度（melting temperature，Tm）值的差異進(jìn)行基因分型。

1.2.5 對(duì)比研究

采用商品化RHD 陰性鑒定基因檢測(cè)試劑盒（PCR?SSP 法）對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行同步檢測(cè)，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作。PCR 反應(yīng)條件為：96 ℃2 min，隨后96 ℃20 s，68 ℃60 s，5 個(gè)循環(huán)；96 ℃20 s，65 ℃50 s，72 ℃45 s，10 個(gè)循環(huán)；96 ℃20 s，62 ℃50 s，72 ℃45 s，15 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，最后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳（100 V，30 min），用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.6 RHD基因測(cè)序

參考文獻(xiàn)方法［9］，對(duì)RHD 外顯子9 進(jìn)行測(cè)序分析，PCR 總體積為20 μL，引物濃度為200 nmol/L，PCR 條件為：95 ℃，5 min；95 ℃30 s，61 ℃30 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序引物同擴(kuò)增引物。使用Sequencing Analysis 6 和SeqScape v3.0軟件進(jìn)行測(cè)序圖譜分析和序列比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和構(gòu)成比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，并通過(guò)配對(duì)χ2檢驗(yàn)比較熔解曲線法與PCR?SSP 法結(jié)果的差異；采用靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、符合率和約登指數(shù)等指標(biāo)對(duì)熔解曲線法進(jìn)行評(píng)判。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)結(jié)果

87例標(biāo)本中，RhD確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性者6例；對(duì)其余81例標(biāo)本進(jìn)行RhD吸收放散試驗(yàn)，結(jié)果為陽(yáng)性者共15例。

2.2 熔解曲線分析

對(duì)全部87例樣本分別進(jìn)行RHD exon 9 c.1227G>A 及β?actin 熒光定量PCR 擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。前者的Tm 值約為73 ℃，后者約為88 ℃，擴(kuò)增陽(yáng)性者分別在相應(yīng)位置處出現(xiàn)單一峰型。在空白對(duì)照結(jié)果為陰性的前提下，兩種熔解峰均出現(xiàn)時(shí)，判定為RHD exon 9 c.1227G>A 陽(yáng)性；只有β?actin峰時(shí)，判定為RHD exon 9 c.1227G>A陰性；無(wú)β?actin 峰時(shí)，判為試驗(yàn)無(wú)效（圖1）。共計(jì)16例樣本檢測(cè)出含有RHD c.1227G>A（占比18.4%）。

圖1 RHD c.1227G>A 及β?actin基因擴(kuò)增的熔解曲線

2.3 熔解曲線法與PCR?SSP方法比較

87例樣本同步采用商品化RHD 陰性鑒定基因檢測(cè)試劑盒（PCR?SSP 法）進(jìn)行檢測(cè)，將熔解曲線法結(jié)果與之比較，結(jié)果一致，相同的16例樣本均含有RHD c.1227G>A（χ2=0.038，P=0.845）。

2.4 測(cè)序結(jié)果

對(duì)1例吸收放散試驗(yàn)結(jié)果為陰性，基因檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣本進(jìn)行RHD外顯子9測(cè)序分析，證實(shí)含有c.1227G>A（圖2）。

圖2 某樣本RHD exon 9測(cè)序結(jié)果

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，采用熔解曲線分析法檢測(cè)RHD c.1227G>A 位點(diǎn)的靈敏度為100%，特異度為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為100%，約登指數(shù)為1.0，總符合率達(dá)100%。

3 討論

亞洲型DEL 血型的分子遺傳背景為RHD 基因exon 9 存在c.1227G>A 同義突變，由于1 227 位為exon 9 3′端最后1位堿基，該突變雖未導(dǎo)致氨基酸的變化，但可能影響mRNA 的正常拼接或拼接效率，導(dǎo)致RHD基因表達(dá)水平降低，這也一定程度上解釋了為何Del 表型RhD 抗原表位沒(méi)有變化，但抗原數(shù)量卻明顯減少［10］。用于Del血型檢測(cè)的吸收放散試驗(yàn)并未常規(guī)用于臨床檢測(cè)，因此Del 表型個(gè)體一直被當(dāng)成RhD 陰性對(duì)待。Del 表型個(gè)體，尤其是亞洲型DEL 的檢測(cè)及個(gè)體RhD 抗原免疫應(yīng)答情況值得研究；故本研究旨在建立高效、便捷的RHD c.1227G>A等位基因檢測(cè)方法。

本研究首先對(duì)于RhD 抗原確認(rèn)結(jié)果為陰性的樣本進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)，該操作步驟較為繁瑣，對(duì)檢測(cè)人員的手法和經(jīng)驗(yàn)有一定要求，操作不當(dāng)易產(chǎn)生錯(cuò)誤結(jié)果。本次試驗(yàn)血清學(xué)檢測(cè)出15例Del 表型，另有1例標(biāo)本經(jīng)熒光定量PCR 熔解曲線分析及PCR?SSP 的方法表明為亞洲型DEL，后經(jīng)測(cè)序方法證實(shí)。該樣本血清學(xué)方法漏檢可能原因是樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或吸收方法試驗(yàn)操作不熟練，因樣本量不足，未進(jìn)行血清學(xué)重復(fù)驗(yàn)證。

血清學(xué)方法只能檢測(cè)出Del 表型，并不能明確其分子機(jī)制?，F(xiàn)已知導(dǎo)致Del表型的等位基因已超過(guò)17 個(gè)，如RHD（IVS3+1A）、RHD c.3G>A、RHD c.1227G>A 等［11］。對(duì)于中國(guó)人最常見(jiàn) 的RHD c.1227G>A檢測(cè)，常用的檢測(cè)手段為PCR?SSP法，但該方法的不足之處在于PCR 結(jié)束后，需開(kāi)蓋上樣、電泳、成像等操作，耗時(shí)較長(zhǎng)，且增加了產(chǎn)物交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)；而熔解曲線分析法是一種PCR后產(chǎn)物分析技術(shù)，利用雙鏈DNA 在升溫過(guò)程中，由于長(zhǎng)度、GC含量等因素而產(chǎn)生不同的解離特征，結(jié)合熒光檢測(cè)，在閉管環(huán)境下，由儀器自動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)單核苷酸多態(tài)性鑒別分析，避免人為判斷誤差，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果判斷直觀等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于基因分型、甲基化檢測(cè)等研究。熔解曲線分析技術(shù)可分為探針熔解曲線（probe melting curve）和熒光染料熔解曲線（fluorescent dye melting curve）兩大類。Sun 等［12］報(bào)道了一種熒光探針熔解曲線分析法，可同時(shí)檢測(cè)RHD 1227G和RHD 1227A等位基因，該方法難點(diǎn)在于“錨定探針”和“檢測(cè)探針”的合理設(shè)計(jì)，如何實(shí)現(xiàn)高效率結(jié)合多種靶序列，產(chǎn)生多個(gè)可區(qū)分的熔點(diǎn)峰；由于該方法需要2種熒光標(biāo)記探針，檢測(cè)成本較高。

熒光染料熔解曲線法無(wú)需探針設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)單且成本較低，因而本研究?jī)?yōu)先考慮采用此方法。根據(jù)RHD c.1227G>A 基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)并合成序列特異性引物，β?actin作為內(nèi)參，單一擴(kuò)增目的基因，選用SYBR Green Ⅰ染料法。SYBR Green Ⅰ為非飽和型熒光染料，非特異性與雙鏈DNA結(jié)合，操作簡(jiǎn)單，性價(jià)比高；雖然精準(zhǔn)度較飽和染料稍低，但完全滿足本實(shí)驗(yàn)要求。本次共對(duì)87例標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，其中16例含有RHD c.1227G>A等位基因，與商品化RHD陰性鑒定基因檢測(cè)試劑盒（PCR?SSP 法）結(jié)果一致，RHD c.1227G>A陽(yáng)性率為18.4%；熔解曲線方法的靈敏度及特異度均為100%。

王霓等［13］建立了RHD c.1227G>A 熒光染料熔解曲線分型方法，設(shè)計(jì)2 條特異性引物和1 條通用引物，產(chǎn)物RHD 1227A和RHD 1227G的熔解曲線分別為75 ℃和77 ℃，根據(jù)結(jié)果可鑒別出RHD 1227A+/G-、1227A-/G+、1227A+/G+及1227A-/G-4 種基因型。不過(guò)該方法僅能分析Del 型標(biāo)本是否存在RHD 1227G 和1227A 位點(diǎn)，對(duì)于RHD 1227A+/G-的標(biāo)本無(wú)法得知其是RHD 1227A/1227A，還是RHD1227A/d，同樣也無(wú)法區(qū)分RHD 1227G/1227G 和1227G/d，若需進(jìn)行區(qū)分，還需進(jìn)一步RHD合子型檢測(cè)。本研究建立的方法與之相比，目的不同，因而研究手段更為簡(jiǎn)單直接。本研究旨在檢測(cè)出是否存在RHD c.1227G>A 等位基因，而并不關(guān)注RHD 1227G 的存在與否。由于RHD c.1227G>A 是亞洲型DEL 血型的分子遺傳背景，其RhD 抗原表位沒(méi)有發(fā)生變化，該基因型個(gè)體是否會(huì)對(duì)RhD抗原免疫產(chǎn)生抗D抗體值得研究。Xu 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，808例RhD 陰性孕婦中，178例為DEL 型，其中94%存在c.1227G>A 突變，均未產(chǎn)生抗D 抗體。Shao 等［6］也同樣發(fā)現(xiàn)，199例RhD陰性孕婦中，22.1%為DEL型，均為c.1227G>A突變且未產(chǎn)生抗D抗體。因此提議，該Del型孕婦可以免去孕期頻繁的抗體篩查和抗D免疫球蛋白注射。因此本研究目的在于對(duì)RhD 初篩陰性的孕婦進(jìn)行RHD c.1227G>A檢測(cè)，該位點(diǎn)檢出意味著為亞洲型DEL，因此不會(huì)產(chǎn)生抗D抗體，無(wú)論樣本是純合子、雜合子，或者合并其他RHD變異型情況，該等位基因的檢出具有重要指向意義。

綜上所述，本研究建立了一種RHD c.1227G>A基因檢測(cè)的熔解曲線分析方法，該方法簡(jiǎn)單直接，可以高效、快速地進(jìn)行RHD c.1227G>A等位基因檢測(cè)，在RhD陰性孕婦篩查中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。