胡燕珍 張媛媛 黃 斌 王亞敏 陳 樂▲ 楊 治

1.江西省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，江西南昌 330046；2.江西省兒童醫(yī)院新生兒外科，江西南昌 330006

抑郁癥是最常見的精神疾病之一，以生理、情感和認知障礙為主要特征，伴隨的癥狀包括情緒低落、快感缺失、絕望、精力喪失、有自殺念頭等[1]。世界衛(wèi)生組織預(yù)測世界各地已超過3.5 億人患有這種疾病，涉及各個年齡段[2]。同時，隨著每年全球中老年女性的增多，圍絕經(jīng)期抑郁癥的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。相關(guān)研究表明，在歐美圍絕經(jīng)期婦女中，輕度抑郁癥的人占總?cè)藬?shù)的50%～60%，嚴重抑郁癥占1%～3%[3]。圍絕經(jīng)期抑郁癥的發(fā)生不僅影響中老年女性的生活質(zhì)量，同時也給家庭和社會帶來了沉重的負擔[4]。現(xiàn)代研究認為，圍絕經(jīng)期抑郁癥的發(fā)生與雌激素的缺乏有關(guān)[5]。其中，植物雌激素是一類存在于植物中具有雌激素生物活性的物質(zhì)，其已作為臨床絕經(jīng)期婦女激素替代療法的一種新選擇。染料木素是植物雌激素的一種，其可選擇性地與雌激素受體結(jié)合，表現(xiàn)出雌激素與抗雌激素活性。有研究報道，染料木素具有改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女的生活質(zhì)量和抑郁癥狀的能力[6]。但目前有關(guān)染料木素治療圍絕經(jīng)期抑郁癥的具體作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學的出現(xiàn)為染料木素治療抑郁癥的作用機制系統(tǒng)研究提供了新的思路和方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學是一門以系統(tǒng)生物學理論為基礎(chǔ)，采用生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析方法，通過選取特定的信號節(jié)點對多靶點藥物分子進行系統(tǒng)設(shè)計的新學科[7]。基于此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，分析和預(yù)測染料木素治療抑郁癥的分子作用機制，以期為揭示染料木素治療抑郁癥作用機制的科學內(nèi)涵提供參考。

1 材料與方法

1.1 染料木素作用靶點預(yù)測

通過搜索下列數(shù)據(jù)庫獲得染料木素靶向蛋白編碼基因的完整列表：中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）、比較毒理基因組學數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org/）、TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）。結(jié)果僅限于“homo Sapiens”。

1.2 抑郁癥相關(guān)靶點預(yù)測

檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）和Home-NCBI-Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）數(shù)據(jù)庫獲得潛在抑郁癥相關(guān)靶點，關(guān)鍵詞輸入“depression”，設(shè)置物種為“homo Sapiens”。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將染料木素作用靶點與抑郁癥相關(guān)靶點的交集部分導入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/），設(shè)置物種為“homo Sapiens”，獲取藥物-疾病靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，將處理后的數(shù)據(jù)導入Cytoscape Version 3.6.1軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，對生成的網(wǎng)絡(luò)圖進行拓撲分析，節(jié)點大小與degree 值呈正相關(guān)，并根據(jù)degree 值篩選出核心靶點。

1.4 “成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將染料木素化合物、抗抑郁相關(guān)作用靶點和疾病導入Cytoscape Version 3.6.1 軟件，構(gòu)建“成分-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）將染料木素抗抑郁癥潛在靶點進行系統(tǒng)分析，設(shè)置列表和背景的限定物種為“homo Sapiens”，以P ＜0.05 進行關(guān)鍵靶基因GO 與KEGG 功能富集分析，并將結(jié)果以條形圖形式輸出。分析染料木素抗抑郁癥的生物學過程、細胞成分、分子功能和信號通路。

2 結(jié)果

2.1 染料木素抗抑郁靶點預(yù)測

檢索TCMSP、比較毒理基因組學、TTD 等數(shù)據(jù)庫，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)，整理得到231 個染料木素的作用靶點。對Home-NCBI-Gene 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果進行整理，得到抑郁癥相關(guān)靶點537 個。將染料木素作用靶點與抑郁癥靶點相匹配，整理得到23 個染料木素抗抑郁癥潛在靶點。見表1。

表1 染料木素抗抑郁潛在靶點

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將23 個潛在靶點錄入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲取靶點PPI的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape Version 3.6.1軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。圖中節(jié)點代表靶蛋白，節(jié)點的大小和顏色表示degree 值的大小，節(jié)點越大、顏色越深對應(yīng)的degree 值越大。圖中有相互關(guān)聯(lián)的蛋白以線連接，線條的粗細代表蛋白相互作用的強弱。圖中共有23 個節(jié)點，平均節(jié)點度為15.6，179 條邊，平均局部聚類系數(shù)為0.882。在PPI 關(guān)系中，MAPK1、PTGS2、MMP9、VEGFA、AKT1、TNF 等6 個靶點 的節(jié)點較大，推測這些蛋白可能是染料木素治療抑郁癥的關(guān)鍵靶點，在染料木素治療抑郁癥過程中發(fā)揮重要作用。

圖1 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將染料木素化合物、23 個潛在靶點及疾病分別導入Cytoscape Version 3.6.1 軟件，構(gòu)建“成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。在網(wǎng)絡(luò)圖中，中間靠下節(jié)點代表染料木素，靠上節(jié)點代表疾病抑郁癥，外圈節(jié)點代表染料木素抗抑郁的潛在靶點，共23 個節(jié)點，作用靶點與活性成分和疾病的相互關(guān)聯(lián)用邊來表示。從圖中可看出染料木素可以對應(yīng)不同的靶點，充分顯示染料木素抗抑郁具有多靶點的特性。

圖2 “成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 富集分析

將染料木素抗抑郁的23 個潛在靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫，經(jīng)R 語言運行后可獲得33 條GO 富集功能（P ＜0.05）。其中26 個生物過程（圖3A）主要與細胞分裂正調(diào)控、蛋白激酶B 信號轉(zhuǎn)導、絲氨酸肽基磷酸化正調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正負調(diào)控、免疫應(yīng)答、MAP 激酶活性正調(diào)控、細胞增殖正調(diào)控、血糖穩(wěn)態(tài)、血管生成、NF-κB 信號正調(diào)控等相關(guān)。3 個細胞成分（圖3B）主要包括細胞外間隙、胞漿、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物。4 個分子功能（圖3C）主要涉及細胞因子活性、序列特異性DNA 結(jié)合、白細胞介素-1受體結(jié)合、類固醇結(jié)合。圖中黑色條代表基因個數(shù)，條越長表示該GO 條目富集的基因越多；灰色條代表P值，條越長代表P 值越小。

圖3 GO 富集結(jié)果條形圖

2.5 KEGG 通路富集分析

在KEGG 分析中，以P ＜0.05 為界共篩選出23 條信號通路（圖4），依次為癌癥信號通路、利什曼病、瘧疾、乙肝、結(jié)核病、NF-κB 信號通路、阿米巴病、腎細胞瘤、前列腺癌、細胞因子受體相互作用信號通路、丙肝、MAPK 信號通路、黑色素瘤、趨化因子信號通路、黏著斑、移植物抗宿主病、子宮內(nèi)膜瘤、結(jié)直腸癌、慢性粒細胞白血病、造血細胞譜系、癌癥過程中的膽堿代謝通路、人體T 細胞白血病病毒Ⅰ型感染、卵母細胞減數(shù)分裂，提示染料木素可能通過作用以上多條通路達到治療抑郁癥的目的。圖中黑色條代表基因個數(shù)，條越長代表該通路富集的基因越多；灰色條代表P 值，條越長代表P 值越小。

圖4 KEGG 通路富集結(jié)果條形圖

3 討論

目前，現(xiàn)代醫(yī)學多用西藥來治療圍絕經(jīng)期婦女抑郁癥，西藥能夠快速的改善患者的癥狀體征，但存在毒副作用大、依從性差、中斷治療復(fù)發(fā)率高等諸多問題，極大地影響了其在臨床中的應(yīng)用。而中醫(yī)藥依據(jù)患者的病癥類型進行辨證論治，治療效果不低于西藥，且安全性更高，更受患者歡迎。研究表明，絕經(jīng)期抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與體內(nèi)雌激素水平的降低密切相關(guān)[8]。其中，植物雌激素是從植物尤其是豆類植物中提取的可以替代雌激素的作用并同時防止雌激素不良反應(yīng)的發(fā)生，給廣大圍絕經(jīng)期女性追求健康、遠離煩惱帶來了新的希望。染料木素是植物雌激素的一種，已成為絕經(jīng)期婦女激素替代療法的一種新選擇。因此，研究染料木素抗抑郁的作用機制具有重要意義。

本研究通過構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)染料木素可能通過調(diào)節(jié)MAPK1、PTGS2、MMP9、VEGFA、AKT1、TNF 等核心靶點達到治療抑郁癥的作用。MAPK1 參與細胞的自噬、增殖、遷移、侵襲和脂代謝等生物過程[9]，其參與抗抑郁的機制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工過程有關(guān)[10]。PTGS2 是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵限速酶。前列腺素合成酶在抑郁癥患者中顯著下調(diào)[11]，提示前列腺素生物合成途徑的異常與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，其也可通過降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)揮抗抑郁的作用[12]。MMP9 又稱明膠酶B，可以高效降解Ⅳ型膠原，在血管重生、炎癥反應(yīng)等生物過程中起關(guān)鍵作用。近年研究表明，抑郁癥與炎癥應(yīng)答系統(tǒng)的激活有關(guān)，是一種炎癥疾病[13]。VEGFA 是PDGF/VEGF 生長因子家族的最主要成員之一，通常也被稱之為VEGF，在血管發(fā)生和形成過程中起著主要的調(diào)控作用。VEGF 是內(nèi)皮細胞和神經(jīng)元的一種有效的特異性有絲分裂原和神經(jīng)營養(yǎng)因子，是突觸傳遞的調(diào)節(jié)劑[14]。研究表明VEGF在海馬神經(jīng)發(fā)生和抑郁病理生理學中起重要作用，抑制神經(jīng)細胞中VEGF 受體2 的表達會損害海馬依賴性突觸可塑性和情感記憶的鞏固[15]。AKT1 可通過PI3K 依賴的機制被胞外信號激活，在體內(nèi)參與代謝、細胞增殖和存活、胰島素信號轉(zhuǎn)導及血管生成等多種生物學過程。AKT1 基因SNPrs3001371 多態(tài)性與重性抑郁障礙患者認知功能損傷存在一定的關(guān)聯(lián)性；G/G基因型患者與G/A 和A/A 基因型患者比較，認知功能損害更嚴重[16]。TNF 基因編碼的蛋白是一種多功能的促炎性細胞因子，分為TNF-α、TNF-β 兩種。其中，TNF-α 在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展及臨床藥理機制中發(fā)揮著重要作用[17]。抑郁癥相關(guān)性的薈萃分析（meta 分析）顯示，抑郁癥患者血清TNF-α 水平明顯高于健康人群[18]。同時，劉玉芝等[19]研究表明，TNF-α 基因rs1800629 多態(tài)性與首發(fā)抑郁癥的易感性相關(guān)。

靶點KEGG 通路分析表明，染料木素抗抑郁癥作用與癌癥通路、免疫炎癥反應(yīng)通路（趨化因子信號通路、細胞因子-受體相互作用信號通路、NF-κB 信號通路）、細胞凋亡通路（MAPK 信號通路）、病毒感染等通路相關(guān)。其中，免疫炎癥反應(yīng)和細胞凋亡是抑郁癥的重要發(fā)病機制。抑郁癥患者的相應(yīng)腦區(qū)存在炎癥反應(yīng)，而介導炎癥反應(yīng)的趨化因子在其中發(fā)揮著重要的作用。在LPS 誘導的抑郁動物模型中，大鼠前額皮質(zhì)的趨化因子CXCL1 和CCL2 水平明顯升高[20]。另外，在LPS 誘導的外周急性早期炎癥動物模型中，Col1a1或Rgs5 亞型的PDGFRβ 細胞能夠介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的CCL2 迅速高表達，進而導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[21]，從而誘發(fā)模型動物出現(xiàn)抑郁性癥狀。細胞因子與相應(yīng)受體結(jié)合后，具有調(diào)節(jié)細胞生存和死亡的作用，如TNF-α 可使NF-κB 的抑制蛋白磷酸化、泛素化從而發(fā)生降解，并從NF-κB 脫離而激活NF-κB 轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與特定的DNA 序列結(jié)合，啟動或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細胞生存或死亡。最近陸梅娟等[22]研究表明，抑郁癥患者血清NF-κB 水平升高，其表達量影響抑郁癥的發(fā)病過程。在劉麗珠等[23]研究中，發(fā)現(xiàn)APS 可通過抑制NF-κB 信號通路的磷酸化反應(yīng)，穩(wěn)定模型動物腦海馬CA1 區(qū)自發(fā)性動作電位和群峰電位電壓，可顯著改善大鼠腦卒中后抑郁行為。MAPK已被證實具有調(diào)節(jié)行為、學習、記憶等方面的作用，MAPK 信號通路包括：ERK1/2、ERK3/4、ERK5、p38、JNK/SAPK，其中ERK1/2 通路與抑郁癥關(guān)系最為密切。覃斌等[24]通過構(gòu)建慢性不可預(yù)知刺激抑郁模型來探討氯胺酮抗抑郁的作用機制，發(fā)現(xiàn)氯胺酮可通過抑制ERK1/2、NF-κB 信號分子，抑制炎癥反應(yīng)，顯著改善抑郁大鼠的行為學。張世嬌等[25]發(fā)現(xiàn)逍遙合劑可上調(diào)產(chǎn)后抑郁大鼠下丘腦內(nèi)ERK1/2 信號通路上的p-MEK1、MEK1 蛋白表達水平，改善大鼠產(chǎn)后抑郁癥狀。以上研究均提示，ERK1/2 通路與抑郁癥發(fā)病機制密切相關(guān)。綜上所述，染料木素可能通過上述多種信號通路來調(diào)節(jié)各種生理活動，從而到達治療抑郁癥的目的。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，對染料木素抗抑郁癥作用的靶點和機制進行了系統(tǒng)的預(yù)測和分析，共篩選出核心靶點6 個、GO 生物信息33 條及相關(guān)信號通路23 條，為后續(xù)深入研究染料木素抗抑郁的作用機制提供了新思路。但本研究未對關(guān)鍵靶蛋白進行分子對接驗證，因此染料木素抗抑郁的具體作用機制還需進一步實驗驗證。