胡 峻，陳天瑩，李孟純，段嘉寶，李 鈾,2，楊具田

（1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730100；2.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心，甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

中國固有的綿羊品種大致分為3 類，即蒙古羊系統(tǒng)、哈薩克羊系統(tǒng)和藏羊系統(tǒng)，其中以蒙古羊系統(tǒng)為主；而因各地區(qū)的地域差異，又可將中國綿羊分布劃分為多個區(qū)域，由沿海區(qū)的寒羊、湖羊，到云貴高原區(qū)的小尾寒羊，再到北疆區(qū)的哈薩克羊、當巴什羊[1-2]。地方品種綿羊的種質(zhì)資源對中國畜牧業(yè)發(fā)展以及綿羊育種有著十分重要的價值，但在現(xiàn)實生產(chǎn)中，為了獲取更高的經(jīng)濟效益，牧民們常常通過雜交的手段來改良地方品種，從而使得生產(chǎn)性能相對較低的古老地方品種日趨減少甚至瀕臨滅絕，進而引發(fā)世界性的畜禽品種資源危機。因此，綿羊種質(zhì)資源的保護意義重大且迫在眉睫[3]。

甘肅省的綿羊品種主要有甘肅高山細毛羊、蘭州大尾羊、灘羊和藏羊等[4]。而蘭州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）更是我國特有的地方品種之一，主要分布在甘肅中部的干旱地區(qū)，具有成熟早、繁殖力高等特點，適合在蘭州地區(qū)飼養(yǎng)[5]。近年來，由于對地方特有品種的認識不充分，對其保護力度不夠；加上外來品種引進的影響，甘肅省各個綿羊品種均存在不同程度的滅絕危機。據(jù)研究，蘭州大尾羊滅絕頻率為0.77，居北方11 個綿羊品種之首，品種貢獻率為10.52%，居于第三，保護潛力為0.141 9，居第1 位，現(xiàn)已被國家列為瀕臨滅絕的遺傳資源[6]。

線粒體DNA（mtDNA）是動物核外遺傳的主要遺傳物質(zhì)，也是研究動物起源進化及群體遺傳分化的理想對象[7]；在世代間沒有基因重組，為嚴格母系遺傳，同時還具有高突變率等特點，突變速率為單拷貝核DNA 的5～10 倍。因此，線粒體DNA 被廣泛用于動物起源進化、物種鑒定、疾病診斷、衰老及動物經(jīng)濟性狀的核外基因效應等研究[8]。已有許多學者對不同物種的mtDNA 進行了多方面的研究與探索[9]。

該研究對甘肅地區(qū)的蘭州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）、灘羊（Tan sheep）、小尾羊（Small tailed han sheep）和藏羊（Tibetan sheep）的線粒體ND4和ND2基因進行擴增，利用生物信息學軟件將擴增得到的序列與GenBank 上下載的其他綿羊品種的ND2和ND4基因序列進行比對，以探討不同種群之間的系統(tǒng)發(fā)生關系，為研究甘肅地區(qū)綿羊品種的起源以及進一步利用和保護地方綿羊品種提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于甘肅當?shù)匮驁霾杉笪惭颍―1～D6）、灘羊（S1～S12）、小尾羊（X1～X9）和藏羊（T1～T10）的組織樣本。

1.2 基因組擴增

1.2.1 引物設計 使用Gentra Puregene extraction kit（GentraSystems Inc.）從動物組織中提取純度較高且分子量大的基因組DNA 用于后續(xù)試驗。參照GenBank已發(fā)表的綿羊ND2與ND4基因序列設計引物，引物序列、退貨溫度與產(chǎn)物大小見表1，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 PCR 反應體系 上、下游引物濃度10 mmol/L，各0.5 μL；DNA 樣品濃度50 ng/μL，2 μL；PremixTaq（Takara）濃度5 U/μL，12.5 μL；無菌水9.5 μL；最終得到25 μL 的PCR 反應體系。

1.2.3 PCR 反應條件 94℃預變性3 min；94℃變性45 s，54（58）℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72℃延伸10 min。將擴增產(chǎn)物在1.4%的瓊脂糖凝膠上電泳，采用凝膠成像儀檢測。檢測時著重觀察PRC產(chǎn)物是否擴增成功以及是否有二聚體形成。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將成功擴增的PCR 產(chǎn)物送至蘭州天啟基因生物科技有限公司測序，反饋的測序結果使用Geneious 11.0.4 進行處理，拼接獲得較為完整的序列波峰圖，并進一步校對，獲得單個樣本的完整序列，導出Fasta格式的文件以進一步處理分析。使用MEGA-X 軟件將所得全部ND2、ND4基因序列與Genbank 上已發(fā)表的其他20 個綿羊品種的ND2、ND4基因序列（表2）進行比對。

表2 Genbank 上已發(fā)表的其他綿羊物種信息

該研究以盤羊（Ovis ammon）作為進化樹的外群，采用MEGA-X 軟件分別用鄰接法Neighbor-joining，NJ）構建NJ 樹與最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構建ML樹。其中，鄰接法構建的NJ樹以p-distance法計算遺傳距離，Bootstrap 重復選擇為1 000 次；最大似然法構建的ML 樹，以Find BestDNA/Protein Models （ML）中最低的BIC 分數(shù)的模型作為最佳模型，Bootstrap 重復選擇也為1 000 次。

2 結果與分析

2.1 基因測序結果

測序結果顯示，PCR 擴增所得ND2、ND4基因序列大小均為200 bp 左右，經(jīng)Geneious11.0.4 校對，并與國內(nèi)外ND2、ND4基因序列比對，確定樣品中DN2基因序列為184 bp，ND4基因序列為235 bp。

利用MEGA-X 軟件中的Statistic 功能分析表明：ND2基因中T、C、A、G 平均含量分別為25.2%、27.9%、38.1%、8.8%，A+T=63.3%、C+G=36.7%，含有保守位點177 個，變異位點7 個（顛換位點4 個、轉換位點3 個），簡約信息位點3 個，自裔位點4 個，顛換多在A-G 間發(fā)生，轉換多在C-T 間發(fā)生；ND4基因中T、C、A、G 平均含量分別為28.8%、26.7%、29.8%、14.6%，A+T=58.6%、C+G=41.3%，含有保守位點230 個，變異位點6 個（均為顛換位點），簡約信息位點4 個，自裔位點2 個，顛換均在A-G 間發(fā)生。DN2與ND4基因中G含量明顯低于其他3種堿基，出現(xiàn)典型的反G 偏倚。

2.2 基于ND2 與ND4 基因的綿羊系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA-X 將拼接校對后的所有ND2、ND4基因與GenBank 上下載的20 個序列，使用鄰近法和最大似然法構建系統(tǒng)發(fā)生樹，結果如圖1、圖2 所示。

基于ND2、ND4基因所構建的ML 樹與NJ 樹結果略有差異，其原因可能是所研究的樣本量較小且序列較短。其中ND2基因構建的ML 樹（圖1A）中，大部分灘羊樣本與其他樣本間的親緣關系相距較遠，故而單獨聚為1 小支，這樣的情況在其他3 種羊中也有體現(xiàn)，但存在個別不同品種樣本間親緣關系較近的情況；而NJ 樹（圖1B）所示結果中，哈姆達尼羊、烏拉藏羊、葉城羊等與部分大尾羊、藏羊、小尾羊樣本聚為1支；而薩赫勒羊、賈倫克羊等與另一部分藏羊、小尾羊以及個別大尾羊樣本、大部分灘羊樣本聚為1支；除去上述2 大支之外，X1、T9、S5 這3 個樣本之間親緣關系更為接近，故而單獨聚為1 小支，這樣的情況在基于ND4基因構建的NJ 樹中也存在，但有所不同的是在基于ND4基因的NJ 樹中，T9、S1、S5、X1 這4 個樣本單獨聚為1 小支，其余樣本則分為2 支?；贜D4基因構建的ML 樹（圖2A）中所有樣本大致分為2 支，而T9、S5、S2、S1、X1 聚為1 小支，其余樣本聚為1 支，從中可以推斷T9、S5、S2、S1、X1 樣本可能存在基因流故而親緣關系較近；而基于ND4基因的NJ 樹（圖2B）中，樣本在分為2大支的同時，還包含有2 個小分支，分支中個樣本的親緣關系情況與ND2基因構建的NJ 樹中大致相似。

圖1 基于ND2 基因構建系統(tǒng)發(fā)生樹

圖2 基于ND4 基因構建系統(tǒng)發(fā)生樹

3 結論與討論

近年來，線粒體DNA（mtDNA）已經(jīng)成為分子遺傳學的熱點之一。動物線粒體基因組的13 個蛋白基因包括細胞色素b 基因（Cytb）、細胞色素氧化酶3 個亞基基因 （COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ）、NADH氧化還原酶7 個亞基基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）和ATP 酶2 個亞基基因 （ATPase6，ATPase8），這13 個蛋白或亞基都是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的組分[10-11]。這些蛋白基因組的研究在探討品種起源及分化、種間的系統(tǒng)演化、種內(nèi)母系演化、地方品種資源與地理分布的關系等方面有廣泛應用。

該研究選取NADH 氧化還原酶7 個亞基基因中的ND2和ND4基因進行擴增，探討甘肅地區(qū)4 種綿羊與國內(nèi)外其他品種的親緣關系，通過反復試驗確定最佳的PCR 反應條件，再利用生物信息學軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析，最后構建進化樹。

試驗結果表明，甘肅地區(qū)4 種綿羊與國內(nèi)外綿羊均有不同程度的親緣關系，在NJ 樹中所有樣本（除外群）聚為1 大支，進而再分為2 小支，其中2 小支中大尾羊、灘羊、小尾羊和藏羊樣本均有分布，而在ML 樹中所有樣本（除外群）均聚為1 支且并無分支，說明試驗所選4 種綿羊與這20 個綿羊品種有較近的親緣關系，也說明所采集到綿羊樣本有可能與這20 個親緣關系較近的品種存在基因流。傳統(tǒng)觀點則認為小種群內(nèi)的過度基因交流會造成金角衰退、遺傳多樣性的喪失以及種群數(shù)量的減少，而不同物種種群間的基因交流則可以豐富自然界生物多樣性的程度[11]。甘肅地區(qū)綿羊品種基因流存在的主要原因可能是從20世紀就開始進行的世界范圍內(nèi)的綿羊品種雜交，隨著社會的發(fā)展與生活水平的提升，農(nóng)牧民已經(jīng)不滿足于當?shù)鼐d羊品種的單一優(yōu)勢性狀，開始從國內(nèi)外不同地區(qū)引入各種優(yōu)質(zhì)綿羊種質(zhì)資源與當?shù)靥赜械木d羊品種進行雜交并培養(yǎng)出具有更高經(jīng)濟價值的新品種，但由于長期進行雜交，新的經(jīng)濟價值高的品種不斷形成導致世界各國生產(chǎn)性能低的古老地方品種趨于減少，瀕臨滅絕，從而引發(fā)世界性的畜禽品種資源危機。