趙雪光

（湖南醫(yī)藥學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化 418000）

皮膚衰老（skin aging）是指皮膚出現(xiàn)功能衰老性損傷，皮膚防護(hù)、調(diào)節(jié)等能力減退，皮膚無(wú)法適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的變化，導(dǎo)致顏色、色澤、形態(tài)、質(zhì)感等整體狀況發(fā)生改變。皮膚衰老是內(nèi)在因素和外在因素共同作用的結(jié)果，關(guān)于皮膚衰老的發(fā)生機(jī)制一直是研究熱點(diǎn)。Bmi-1基因（B cell-specific MLV integration site-1）是Pc G家族成員之一，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化與衰老；此外研究表明，其在多種腫瘤形成過(guò)程中起重要作用?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建自然小鼠衰老模型，探討B(tài)mi-1在小鼠皮膚年齡相關(guān)衰老中的表達(dá)及作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)對(duì)象為健康昆明種小鼠，購(gòu)買于南昌大學(xué)附屬第一醫(yī)院動(dòng)物研究所[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（贛）2010-0002]，普通喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 自然衰老小鼠模型構(gòu)建參考文獻(xiàn)資料，蘇木精-伊紅（HE）染色法與Masson三色染色檢測(cè)皮膚表皮、真皮以及皮膚總膠原變化，判斷是否建模成功。小鼠分為年輕組與年老組，每組5只。年輕組普通喂養(yǎng)8個(gè)月；年老組普通飲食喂養(yǎng)18個(gè)月。

1.2.2 HE染色檢測(cè)小鼠表皮與真皮厚度 頸椎脫位致死各組小鼠后，切取背部皮膚組織放入4%多聚甲醛中浸泡，固定備用。標(biāo)本常規(guī)脫水透明、石蠟包埋、連續(xù)切片，厚度為5 μm，然后切片經(jīng)二甲苯脫蠟、濃度梯度酒精水化后浸入0.5%蘇木素溶液中5 min，流水沖洗；用0.5%鹽酸酒精分化10 s后，使用0.5%伊紅水溶液復(fù)染4 min。切片常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照，使用Image-Pro Plus軟件測(cè)量表皮及真皮厚度。

1.2.3 Masson三色染色檢測(cè)皮膚總膠原變化Weigert蘇木素A、B液按照1∶1配比，浸沒(méi)脫蠟后的切片，染色10 min，流水沖洗；1%鹽酸酒精分化2 s，滴加麗春紅酸性品紅染液，染色10 min；磷鉬酸溶液作用5 min后甩去，再滴加苯胺藍(lán)染色5 min，加入1%冰醋酸溶液作用5 min后水洗。切片常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下拍照?？偰z原陽(yáng)性率=測(cè)量區(qū)真皮膠原染色面積/測(cè)量區(qū)真皮面積×100%。

1.2.4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠背部皮膚組織相關(guān)蛋白表達(dá) 喂養(yǎng)完成后，乙醚麻醉小鼠分離背部組織，根據(jù)小鼠質(zhì)量加入適量RIPA裂解液裂解組織，冰上靜置30 min，離心并提取蛋白。樣品經(jīng)蛋白質(zhì)定量后，用10%～12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將聚偏二氟乙烯膜與Bmi-1一抗（1∶800）、p16一抗（1∶1000）、p19一抗（1∶1000）于4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，次日加入二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色后，用Image Quant LAS-400mini曝光成像儀分析圖像。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠皮膚衰老形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，年老組表皮厚度低于比年輕組（P＜0.05），真皮厚度也低于年輕組（P＜0.05）；Masson三色染色結(jié)果顯示，膠原染色部分呈藍(lán)色，年輕組小鼠膠原豐富，排列整齊，無(wú)明顯斷裂；年老組膠原明顯減少，排列紊亂（P＜0.05），見(jiàn)圖1、2及表1。

表1 兩組小鼠表皮、真皮厚度及皮膚總膠原陽(yáng)性百分率（）

圖1 HE染色和Masson染色結(jié)果（×200）

2.2 皮膚中Bmi-1、p16、p19蛋白表達(dá)及相關(guān)性分析 年老組皮膚內(nèi)Bmi-1表達(dá)低于年輕組（P＜0.05），p16與p19表達(dá)均高于年輕組（P＜0.05），見(jiàn)表2。Spearman相關(guān)性分析顯示，Bmi-1的表達(dá)與p16呈負(fù)相關(guān)（r=-0.569，P＜0.05），與p19表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.389，P＜0.05）。

表2 兩組小鼠Bmi-1、p16、p19蛋白的表達(dá)情況（）

圖2 Masson三色染色結(jié)果

3 討論

皮膚老化是由自然因素或非自然因素造成的皮膚衰老現(xiàn)象，往往表現(xiàn)為表皮變薄，真皮皺縮且厚度減少，鏡下表現(xiàn)為膠原纖維變細(xì)、老化、排列紊亂、斷裂等。皮膚組織隨著時(shí)間的增加功能逐漸成熟活躍，到達(dá)某一年齡階段就會(huì)開(kāi)始出現(xiàn)退化。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)于抗皮膚衰老的需求越來(lái)越大，但皮膚衰老的內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建小鼠皮膚自然衰老模型，探討小鼠皮膚衰老有關(guān)機(jī)制，以期為抗皮膚衰老的研究提供理論基礎(chǔ)。

Bmi-1基因?qū)儆诰哿虻鞍讖?fù)合體基因家族的成員之一，具有抑制轉(zhuǎn)錄的作用，被認(rèn)為是一種原癌基因。作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的有功能的PcG成員，Bmi-1可參與造血、細(xì)胞周期調(diào)控以及衰老等過(guò)程。目前研究已經(jīng)證實(shí)Bmi-1對(duì)下游通路的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)減少氧化應(yīng)激活性氧水平的產(chǎn)生，減少DNA雙鏈斷裂，促進(jìn)其修復(fù)而調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而參與DNA的損傷修復(fù)。此外Bmi-1基因廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化與衰老，并且在多種腫瘤形成過(guò)程中起著重要作用，其對(duì)于造血干細(xì)胞自我更新及分化潛能的維持也發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建小鼠自然衰老模型，檢測(cè)小鼠皮膚衰老情況，并進(jìn)一步研究Bmi-1基因在小鼠皮膚自然衰老中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HE和Masson染色檢測(cè)皮膚形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，年老組和年輕組比較，其表皮厚度降低，真皮厚度變薄，皮膚總膠原陽(yáng)性百分率減少，提示小鼠皮膚衰老模型構(gòu)建成功。研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1基因能夠通過(guò)p16和p19介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。本研究采用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bmi-1、p16和p19在自然衰老小鼠皮膚中的表達(dá)，結(jié)果顯示年老組皮膚Bmi-1表達(dá)下降，而p16、p19表達(dá)升高；Spearman相關(guān)性分析顯示Bmi-1的表達(dá)與p16、p19表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示Bmi-1表達(dá)的降低可能導(dǎo)致小鼠皮膚衰老的發(fā)生，其可能通過(guò)抑制細(xì)胞依賴性激酶抑制因子如p16、p19的表達(dá)而發(fā)揮抗皮膚衰老的作用。這也為Bmi-1的抗皮膚衰老作用提供理論基礎(chǔ)。但是實(shí)驗(yàn)?zāi)壳斑€只停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初級(jí)階段，Bmi-1的具體調(diào)控機(jī)制以及細(xì)胞學(xué)信號(hào)通路的變化未有深入研究，這也是今后需要深入的方向。

綜上所述，Bmi-1在衰老小鼠皮膚中表達(dá)降低，其機(jī)制為調(diào)控p16和p19的表達(dá)，抑制小鼠皮膚衰老。