胡黃金 雷利娟 鄭靚怡 楊妮 趙鵬 孟春慧 孟婼婭 張恒

良性前列腺增生 (benign prostate hyperplasin, BPH)又稱前列腺肥大，是中老年男性最常見(jiàn)的疾病之一，由于其腺體上皮和間質(zhì)的增生，并發(fā)癥包括急性尿潴留和尿路梗阻等[1]。隨著中國(guó)老齡化的到來(lái)和年齡的增長(zhǎng)，BPH的發(fā)病率逐年上升，而且越來(lái)越年輕化[2]。雄激素是引起 BPH的性激素己被學(xué)者認(rèn)同，但不是唯一的，雌激素也發(fā)揮著作用，此外雌、雄激素平衡失調(diào)的也是重要因素[3]，且與新血管生成密切相關(guān)，這些可能是導(dǎo)致 BPH 的重要機(jī)制。而使用天然中醫(yī)藥治療BPH悠久，中藥復(fù)方能明顯改善相應(yīng)癥狀[4-5]。

中空栓劑是 1984 年始于日本學(xué)者在普通栓劑的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型栓型，其栓殼為基質(zhì)，中空部可填充藥物，較普通栓劑釋藥快、起效快、生物利用度高、藥物穩(wěn)定、且其給藥操作簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn)?！吧低健睘樯轿魇≈嗅t(yī)藥研究院治療BPH總結(jié)出治療BPH療效頗佳的經(jīng)驗(yàn)方。臨床應(yīng)用10余年，具有療效好，副作用少，費(fèi)用低的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于生活行為能力差或患有胃腸道疾的老年人、不便于服用中藥湯劑或?qū)Ψ妹饧孱w粒服用口感不適應(yīng)的患者，研制出高效、簡(jiǎn)便、無(wú)毒副作用的中藥新劑型，加以推廣應(yīng)用具有重要的理論及實(shí)用價(jià)值。所以本實(shí)驗(yàn)，將報(bào)道升降通隆方中空栓對(duì)大鼠BPH模型的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

70只性成熟雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重210±10 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司動(dòng)物(許可證號(hào)為:SCXX(京)2019-008)，于山西省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 藥品、試劑與儀器

升降通癃方顆粒劑：熟地黃20 g、山藥10 g、酒萸肉12 g、酒蓯蓉10 g、益母草15 g、醋三棱10 g、炒王不留行10 g、夏枯草10 g、黃芪10 g、澤瀉10 g、升麻12 g、牛膝10 g、黃柏8 g、鹽車前子15 g、甘草6 g。每劑藥總質(zhì)量為25.5 g，購(gòu)于山西省中醫(yī)藥研究院顆粒劑處，江陰天江藥業(yè)；丙酸睪酮注射液(杭州動(dòng)物藥品廠，獸藥字(110201054)；橄欖油[艾貝克有限公司(西班牙)843701604333]；注射用青霉素鈉(瑞陽(yáng)制藥有限公司，國(guó)字準(zhǔn)號(hào)：H37021950)；液體石蠟(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)；睪酮(testosterone,T)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號(hào)：ml002868)、雌二醇(estradiol,E2)ELISA試劑盒(貨號(hào)：ml002871)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)ELISA試劑盒(貨號(hào)：ml002868)均購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司

Synergy H1多功能微孔讀板機(jī)酶標(biāo)儀：美國(guó) Bio Tek公司；KDC-1044低速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；BP211D電子天平：德國(guó)賽多利斯公司； TKY-BMB石蠟包埋機(jī)：湖北康泰醫(yī)療設(shè)備有限公司； F325旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)：美國(guó) Thermo 公司； BX43光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS。

1.3 中空栓制備和升降通癃方水溶液

空白中空栓制備[6]：將混合脂肪酸甘油酯裝入燒杯中置于恒溫水箱中加熱至40℃融化，灌入已加熱至40℃涂有潤(rùn)滑劑的栓模中，冷卻成型，栓腔內(nèi)僅加入 1，2丙二醇，封底，刮削，啟模，得空白中空栓。升降通癃方中劑量中空栓：制備過(guò)程與空白中空栓相同，僅將1，2丙二醇換成升降通癃方藥液(1，2丙二醇為溶媒按1 mL∶1 g)，制成升降通癃方中劑量中空栓，平均每粒重2.902 g，體積2.5 mL，呈魚雷型，每粒含藥量為0.59 g，大鼠給藥濃度為1.99 g/kg。升降通癃方高劑量中空栓為2粒升降通癃方中劑量中空栓，總含藥量為1.18 g，大鼠給藥濃度為3.98 g/kg。升降通癃方低劑量中空栓，每粒含生藥量為0.29 g，大鼠給藥濃度為0.99 g/kg。非那雄胺中空栓：制備過(guò)程與空白中空栓相同，僅將1，2丙二醇換成非那雄胺藥液1，2丙二醇為溶媒配成濃度為0.34 mg/mL的非那雄胺懸浮液，每粒含生藥量為0.13 mg，大鼠給藥濃度為0.45 mg/kg；升降通癃方水溶液：將升降通癃方顆粒劑打粉后融于水中，制成濃度為0.19 g/mL的溶液，大鼠給藥濃度為1.99 g/kg，于冰箱中冷藏備用。

1.4 模型制備

模型制備[7]： 除假手術(shù)組大鼠僅行假手術(shù)切開陰囊暴露睪丸于空氣中10分鐘再縫合外， 其余造模組大鼠， 腹腔注射10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉，經(jīng)陰囊切除雙側(cè)睪丸。術(shù)后青霉素抗感染7天，于第8天，造模組經(jīng)背、側(cè)腹部皮下多個(gè)注射部位交替注射濃度為5 mg·kg-1·d-1丙酸睪酮，規(guī)格1 mL∶25 m g(按1∶4溶于無(wú)菌橄欖油)，即給藥體積為0.1 mL /100 g，根據(jù)每周四上午所稱體重，每周調(diào)整一次丙酸睪酮?jiǎng)┝?，假手術(shù)對(duì)照組大鼠僅背部皮下注射無(wú)菌橄欖油按0.1 mL/100 g，均連續(xù)注射28天。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，采用隨機(jī)數(shù)表法，將70只大鼠分組為：假手術(shù)對(duì)照組(假手術(shù)組)、模型組、非那雄胺陽(yáng)性組(陽(yáng)性組)、升降通癃方中空栓組高劑量(高劑量組)、升降通癃方中空栓中劑量組(中劑量組)、升降通癃方中空栓低劑量組(低劑量組)，升降通隆方溶液灌胃給藥組(灌胃組)，每組10只，用3%三硝基苯酚溶液進(jìn)行染色標(biāo)記。于術(shù)后第8天，假手術(shù)組、模型組大鼠通過(guò)肛塞直腸給與空白中空栓納肛直腸給藥，陽(yáng)性組、高、中、低劑量組大鼠分別給與相應(yīng)中空栓納肛直腸給藥，并按住肛門5分鐘，待中空栓栓殼融化釋放藥液，灌胃組大鼠給與3 mL升降通癃方水溶液灌胃給藥，即給藥量等于升降通癃方中劑量中空栓的含藥量，所有大鼠連續(xù)給藥28天。

1.6 測(cè)量大鼠前列腺濕重及計(jì)算前列腺指數(shù)

殺檢前天晚上禁食不禁水12小時(shí)，早上稱量大鼠空腹體質(zhì)量，末次給藥1小時(shí)后，腹腔注射麻醉，使用5 mL無(wú)菌注射器腹主動(dòng)脈取血，然后分離前列腺組織，用9%生理鹽水洗凈、剝離附著的組織和血液，用濾紙吸去多余的水分，再用電子稱測(cè)量前列腺濕重，計(jì)算前列腺指數(shù)=前列腺濕質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。取部分大鼠前列腺組織放入預(yù)先備好的 4% 多聚甲醛固定液中，為病理切片準(zhǔn)備，剩余置于液氮中保存。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1小時(shí)后3 500 rpm 離心，15分鐘，取上層血清。采用競(jìng)爭(zhēng)技術(shù)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定樣品中大鼠血清E2、T、VEGF的水平。取前列腺400 mg，于冰塊上勻漿，以3000 r/min離心30分鐘，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書酶免法測(cè)定前列腺組織中E2、T、VEGF的水平。

1.8 HE染色

取4%多聚甲醛已固定好的前列腺組織, 常規(guī)石蠟包埋, 切片脫臘至水,光學(xué)顯微鏡下觀察各組前列腺組織病理結(jié)構(gòu)的變化，保存病理圖片。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠前列腺濕質(zhì)量及前列腺指數(shù)比較

與假手術(shù)組比，模型組大鼠前列腺濕質(zhì)量與指數(shù)均明顯上升(P<0.05)；與模型組比，陽(yáng)性組與高劑量組大鼠前列腺濕質(zhì)量與指數(shù)均明顯下降(P<0.05)，中劑量組與灌胃組大鼠前列腺體指數(shù)下降(P<0.05)；與低劑量組比，高劑量組大鼠前列腺濕質(zhì)量與指數(shù)均明顯下降(P<0.05)；與灌胃組比，大鼠前列腺質(zhì)量與指數(shù)差異影響不明顯。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠前列腺濕質(zhì)量、指數(shù)及密度的比較

2.2 各組大鼠前列腺中T、E2、VEGF的水平

與假手術(shù)組比，模型組大鼠前列腺T水平明顯下降(P<0.05)，E2與VEGF水平明顯上升(P<0.05)；與模型組比，各給藥組大鼠前列腺T水平明顯上升(P<0.05)，E2與VEGF水平明顯下降(P<0.05)；與低劑量組比，高劑量組與中劑量組大鼠前列腺T水平明顯上升(P<0.05)，E2水平明顯下降(P<0.05)；與灌胃組比，中劑量組大鼠前列腺E2的水平明顯下降(P<0.05)，T與VEGF的水平差異影響不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠前列腺中T、E2、VEGF水平的比較

2.3 各組大鼠血清中T、E2、VEGF的水平

與假手術(shù)組比，模型組大鼠血清中T水平明顯下降(P<0.05)，E2與VEGF水平明顯上升(P<0.05)；與模型組比，各給藥組大鼠血清中T水平明顯上升(P<0.05)，E2與VEGF水平明顯下降(P<0.05)；與低劑量組比，高劑量組大鼠血清中T水平明顯上升(P<0.05)，VEGF水平明顯下降(P<0.05)；與灌胃組比，中劑量組大鼠中T、E2與VEGF的水平差異影響不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中T、E2、VEGF水平的比較

2.4 升降通隆方對(duì)大鼠前列腺組織病理變化

高倍鏡(HE，400×)下各組前列腺組織病理結(jié)構(gòu)觀察可見(jiàn)：假手術(shù)組大鼠前列腺上皮細(xì)胞均勻整齊、形態(tài)較一致，間質(zhì)無(wú)纖維結(jié)締組織增生，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；模型組前列腺腔內(nèi)縮小，內(nèi)見(jiàn)明顯粉色濃染均質(zhì)狀物，腺上皮細(xì)胞有明顯的增生褶皺，有乳頭狀的結(jié)構(gòu)，間質(zhì)可見(jiàn)明顯纖維結(jié)締組織增生；陽(yáng)性組前列腺上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，間質(zhì)無(wú)纖維結(jié)締組織增生；高劑量組前列腺上皮細(xì)胞有少量增生，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常；中劑量組前列腺上皮細(xì)胞較厚，且有輕微增生褶皺和乳頭狀的結(jié)構(gòu)；低劑量組前列腺上皮細(xì)胞有明顯的增生褶皺，內(nèi)見(jiàn)較多粉色濃染均質(zhì)狀物，形態(tài)異常；灌胃組前列腺上皮細(xì)胞有明顯的乳頭狀的結(jié)構(gòu)；結(jié)果表明，升降通隆方對(duì)增生的前列腺具有一定的抑制作用，各組間前列腺組織病理學(xué)改變比較有意義。

注：A 假手術(shù)組；B 模型組；C 陽(yáng)性組；D高劑量組；E中劑量組；F低劑量組；G灌胃組。

3 討論

BPH屬于中醫(yī)學(xué)“癃閉”，該病名首見(jiàn)于《內(nèi)經(jīng)》，之后有閉癃、淋閉之稱[8]。《素問(wèn)·上古天真論》曰: “丈夫八歲……天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極。”腎與膀胱相表里。《素問(wèn)·靈蘭秘典論篇》曰：“膀胱者，州都之官，津液藏焉，氣化則能出矣?！?多數(shù)臨床中醫(yī)認(rèn)為BPH基本病機(jī)是腎虛血瘀，虛實(shí)夾雜證[9-10]。升降通隆方中以熟地、益母草為君藥，熟地益精髓，滋腎精，益母草活血利水，善祛膀胱之瘀。山藥補(bǔ)脾腎，即補(bǔ)腎固精，又補(bǔ)脾助后天之本；山茱萸補(bǔ)肝腎，肉蓯蓉補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血，藥力和緩，補(bǔ)陽(yáng)不燥，補(bǔ)陰不膩，能潤(rùn)腸通便，從而改善直腸對(duì)尿道的壓迫，三者同為臣藥；莪術(shù)行氣活血，夏枯草消癥散結(jié)，王不留行走厥陰經(jīng)絡(luò)，消腫散瘀，通利關(guān)竅；氣化則水出矣，中氣不足，溲便為之變，氣之不化水液不行，故加入黃芪，升麻，旨在升氣補(bǔ)中，助陽(yáng)化氣；澤瀉利濕瀉濁，下走膀胱以利水，又能防止滋膩太過(guò)。牛膝活血能引藥下行，且使藥物直達(dá)病所，四藥升降相宜，恢復(fù)氣機(jī)升降；前列腺增生合并前列腺炎時(shí)往往以濕熱為標(biāo)，故加黃柏、車前子清利下焦?jié)駸?、化濁通淋，均為佐藥；生甘草調(diào)和諸藥，為佐使藥。諸藥合用，既重視扶助腎之陰陽(yáng)虧損、補(bǔ)中益氣、升清降濁、又清利濕熱、活血逐瘀、消癥散結(jié)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，益母草中益母草堿可顯著降低BPH前列腺中T及DHT水平[11]；王不留行有抑制新生血管增生之效[12]；黃芪能緩解尿路的不適癥狀[13]。前列腺與直腸解剖位置的血液供應(yīng)密切聯(lián)系，使得升降通隆方中空栓納肛直腸給藥可直接作用于前列腺組織，用最小的藥量發(fā)揮最大程度的藥效。

本實(shí)驗(yàn)采用去勢(shì)皮下注射外源性丙酸睪丸酮復(fù)制BPH的造模方法， 排除自身雄激素的影響，可重復(fù)高。BPH 的研究普遍認(rèn)為與性激素學(xué)說(shuō)、生長(zhǎng)因子學(xué)說(shuō)以及凋亡與基因調(diào)控學(xué)說(shuō)等密切相關(guān)[14-15]。性激素學(xué)說(shuō)被普遍認(rèn)可，前列腺是雄激素依賴性器官，雄激素是引發(fā) BPH 的關(guān)鍵激素，其中最主要是T[16]，同時(shí)E2也發(fā)揮重要作用。陳其華等[17]實(shí)驗(yàn)證明，益腎通癃膠囊可通過(guò)降低T、E2水平，抑制前列腺組織增生。BPH 還涉及新血管生成，VEGF在新血管生成與 BPH的發(fā)生密切相關(guān)[18-19]，VEGF也可在E2作用下由上皮細(xì)胞釋放一種促血管生成因子，可以促進(jìn)間質(zhì)組織中的血管生成和細(xì)胞增殖，導(dǎo)致BPH[20]。所以VEGF能直接促進(jìn)前列腺細(xì)胞增殖，雌雄激素起間接作用。通過(guò)前列腺濕質(zhì)量、指數(shù)和病理觀察比較，可直接反應(yīng)前列腺增生情況，通過(guò)T、E2、VEGF的水平差異的變化，能為升降通隆方中空栓的療效提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)顯示，光鏡顯微鏡下升降通隆方中空栓可有效緩解前列腺增生，實(shí)驗(yàn)中升降通隆方中空栓可明顯降低BPH大鼠的前列腺濕質(zhì)量及前列腺指數(shù), 升高大鼠前列腺和血清中T水平及降低大鼠前列腺和血清E2與VEGF水平。提示，升降通隆方通過(guò)升高T水平及降低E2與VEGF水平，可能是其改善前列腺增生的一條途徑；與低劑量組比，高劑量組大鼠在光鏡顯微鏡下前列腺增生增生程度明顯減輕、大鼠前列腺濕質(zhì)量與指數(shù)均明顯下降(P<0.05)、大鼠前列腺和血清中T水平明顯上升(P<0.05)、E2水平明顯下降(P<0.05)、中劑量組大鼠前列腺T水平明顯上升(P<0.05)，提示，升降通隆方中空栓納肛直腸給藥療效具有一定藥效關(guān)系，且高劑量組療效最佳；表中升降通隆方中空栓各組有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不一致，與實(shí)驗(yàn)中大鼠采用納肛直腸給藥方式易刺激肛門導(dǎo)致大鼠將藥排出，以確保直腸吸收的藥量與實(shí)際給藥量有關(guān)；與灌胃組比，中劑量組大鼠前列腺質(zhì)量與指數(shù)差異影響不明顯(P>0.05)、大鼠前列腺和血清中T、VEGF水平水平差異影響不明顯(P>0.05)，但大鼠前列腺E2的水平明顯下降(P<0.05)，提示升降通隆方中空栓納肛直腸給藥較升降通隆方溶液灌胃給藥療效相近，甚至更佳。

升降通隆方臨床以湯劑使用，但由于劑型的局限性，藥物穩(wěn)定性差，服用不便。中藥中空栓使藥物包裹在中空栓殼內(nèi)，既減少氧化潮解，同時(shí)也避免藥物與基質(zhì)產(chǎn)生硬度效應(yīng)，可使釋藥速度減慢，與普通栓劑相比，中空栓在人體腸道環(huán)境中迅速裂解，提高了生物利用度，納肛直腸給藥方式，可使藥物少受胃腸道pH值或酶的影響，通過(guò)直腸直接吸收可避免肝臟的首過(guò)效應(yīng)。因此，將升降通癃方采用現(xiàn)代中藥提取、純化技術(shù)，制成一種既可以減少患者用藥量、又能保證治療效果、作用確切的中空栓，且使用方便、療效快捷，為中醫(yī)藥治療BPH提供新的思路及方法。

本研究有一定局限性，檢測(cè)范圍僅局限于T、E2、VEGF 三個(gè)因子?？蛇M(jìn)一步檢測(cè)前列腺組織的PI3K/Akt信號(hào)通路、caspase-3、抗凋亡基因 Bcl-2、Bax等基因的調(diào)控，更深層次的明確升降通隆方對(duì)改善大鼠前列腺增生的分子生物學(xué)機(jī)制。

綜上所述，升降通隆方中空栓通過(guò)升高大鼠前列腺增生腺體組織和血清中T水平及降低E2與VEGF水平表達(dá)水平，進(jìn)而減輕前列腺濕質(zhì)量，降低前列腺指數(shù)，從而達(dá)到治療 BPH 的效果。此外升降通隆方中空栓納肛直腸給藥較升降通隆方溶液灌胃給藥療效相近，甚至更佳，創(chuàng)新了傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療BPH的給藥方式，為BPH患者提供了一種療效肯定，使用簡(jiǎn)便的新劑型，將傳統(tǒng)中藥與科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，突破中藥現(xiàn)代化瓶頸，推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展，具有十分現(xiàn)實(shí)的意義。