李然，謝朋呈，辛高杰，李磊，任建勛，劉建勛，付建華，2

1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100091；2.國家中醫(yī)心血管疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100091

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是動脈硬化血管病中最重要的一種，其病變特點主要是由內(nèi)膜開始出現(xiàn)復(fù)合糖類積聚和纖維組織增生，并伴有繼發(fā)性病變及斑塊破裂等。斑塊的不穩(wěn)定性可導(dǎo)致急性心肌梗死。雙參芎連顆粒是本課題組根據(jù)AS病機特點擬定的方劑，具有益氣活血、化痰解毒功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，雙參芎連顆?？烧{(diào)節(jié)AS大鼠脂質(zhì)代謝，減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡。本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合腹主動脈拉傷法制備AS大鼠模型，進一步觀察雙參芎連顆粒對大鼠腹主動脈粥樣硬化斑塊的影響，明確其改善AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SPF級SD大鼠202只，雄性，體質(zhì)量（230±10）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級實驗動物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光暗循環(huán)，自由攝食飲水。髙脂飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司，含78.35%普通飼料、2% L-蛋氨酸、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.15%丙硫氧嘧啶、7%豬油、5%蛋黃粉和5%全脂奶粉。

1.2 藥物

雙參芎連顆粒（人參、川芎、黃連、澤瀉等），由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，批號20111012，1 g顆粒相當(dāng)于原藥材2.44 g，用蒸餾水配制成濃度分別為0.08、0.16、0.32 g/mL。丹蔞片，吉林康奈爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，0.3 g/片，批號20110702，實驗時用蒸餾水配制成0.08 g/mL溶液。舒降之片，杭州默沙東制藥有限公司，20 mg/片，批號110594，用蒸餾水配制成濃度為0.4 mg/mL。

1.3 主要試劑與儀器

同型半胱氨酸（Hcy）對照品，美國Sigma公司，批號037K3798，純度＞95%；辛烷基磺酸鈉，美國Thermo Fisher Scientific公司，批號0 800739；磷酸氫二銨，分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號20 190512；甲醇，分析純，美國Thermo Fisher，批號 095586；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na），美國Sigma，批號 950511；二硫蘇糖醇，美國Sigma，批號 925512；PBS，北京索萊寶科技有限公司，批號20 190425；基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）抗體、核因子（NF）-κB p65抗體、p-NF-κB p65抗體，美國Proteintech公司，批號分 別 為10373-2-AP、CL488-54535、10625-1-AP；2.0F 動脈取血栓導(dǎo)管，美國Fogarty 公司，批號58867347。MIKRO-22R 高速臺式冷凍離心機，德國Hettich 公司；BX-41 光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS；VE186型電泳槽，美國Bio-Rad公司；MPIAS-500型多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，北京正恒博誠科技發(fā)展有限公司；16通道Coularray庫倫陣列式電化學(xué)高效液相色譜儀、5600A電化學(xué)檢測器、582液相泵，美國ESA公司。

1.4 造模、分組及給藥

186只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機選取36只作為空白組，予普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)4周。第4周從空白組和高脂飼料喂養(yǎng)大鼠中隨機抽取10只心臟取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，分離血清，測定血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量。確定大鼠TC、LDL-C含量明顯升高后，將高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，沿頸前正中線無菌切開皮膚，暴露頸前三角區(qū)左側(cè)頸總動脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，微動脈夾阻斷近心端，用眼科剪剪一“V”形切口，插入2.0F動脈取血栓導(dǎo)管（預(yù)先用肝素鈉生理鹽水浸潤），插入深度15 cm。向球囊內(nèi)打氣使其充分?jǐn)U張至有阻力感，勻速回拉球囊8～10 cm，重復(fù)上述操作5次。操作完成后回抽球囊內(nèi)氣體，撤出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎左側(cè)頸總動脈近心端，無菌縫合切口，局部予青霉素生理鹽水消毒。

將手術(shù)大鼠隨機分為模型組、丹蔞片組、舒降之組和雙參芎連顆粒低、中、高劑量組，每組26只。術(shù)后3 d開始給藥，丹蔞片組予丹蔞片溶液0.8 g/kg灌胃，舒降之組予舒降之溶液4 mg/kg灌胃，雙參芎連顆粒低、中、高劑量組予不同濃度雙參芎連顆粒溶液灌胃，給藥劑量分別為0.8、1.6、3.2 g/kg（按顆粒計），灌胃體積1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)8周，空白組和模型組予等體積蒸餾水灌胃。除空白組外，給藥期間其余各組大鼠繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5 取材

給藥第2、4、6、8周分批腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血1 mL，加入100 μL EDTA-2Na抗凝，20 ℃、2 500 r/min離心25 min，分離大鼠血漿，凍存?zhèn)溆谩７蛛x腹主動脈，一部分置于-80 ℃冰箱凍存，用于Western blot檢測，另一部分置于10%中性福爾馬林固定，用于HE染色及免疫組化分析。

1.6 HE染色

取出固定后的腹主動脈組織，選取6段不同位置腹主動脈（每段約5 mm），石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察，應(yīng)用顯微數(shù)碼圖像拍攝系統(tǒng)拍攝腹主動脈粥樣硬化斑塊面積最大處，計算校正斑塊面積和管腔狹窄率。校正斑塊面積（%）＝斑塊面積÷斑塊部位外彈性膜內(nèi)面積×100%，管腔狹窄率（%）＝斑塊面積÷斑塊部位內(nèi)彈性膜內(nèi)面積×100%。

1.7 血漿同型半胱氨酸含量測定

取200 μL血漿加入新鮮配制的0.05 mol/L二硫蘇糖醇溶液50 μL，室溫放置還原20 min，加入0.3 mol/L高氯酸800 μL沉淀蛋白，4 ℃、15 000 r/min離心20 min，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得大鼠血漿樣品。

色譜條件：采用Waters-Spherisorb ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為10 mmol/L磷酸氫二銨-12 mmol/L辛烷基磺酸鈉-10%甲醇（pH 2.33±0.01），流速1 mL/min，電勢＋450 mV、＋800 mV，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。

1.8 免疫組化染色

腹主動脈組織石蠟切片于75 ℃烘箱中烤片85 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ分別浸泡30 min脫蠟；100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各浸泡10 min，95%乙醇、85%乙醇、80%乙醇浸泡5 min 水化；蒸餾水洗3 次，每次2 min，PBS洗3次，每次5 min；高壓鍋煮沸枸櫞酸鈉溶液，高壓120 s進行抗原修復(fù)；滴加MMP-2一抗（1∶100），4 ℃冰箱過夜；次日室溫恢復(fù)30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加二抗，室溫孵育45 min；PBS清洗，DAB顯色，蒸餾水沖洗2次；80%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ浸泡10 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡10 min脫水透明，中性樹脂封片；顯微鏡下觀察，陽性表達為棕色顆粒，計算斑塊位置陽性表達的平均光密度。

1.9 Western blot檢測

用PBS緩沖液裂解腹主動脈組織提取總蛋白，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，按蛋白定量試劑盒說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，紫外分光光度計波長562 nm處測定光密度，計算蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加入NF-κB p65和p-NF-κB p65多克隆抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。加入HRP標(biāo)記二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h。化學(xué)發(fā)光法顯影，用圖像分析系統(tǒng)測定蛋白灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 雙參芎連顆粒對模型大鼠校正斑塊面積和管腔狹窄率的影響

與空白組同一時點比較，模型組大鼠腹主動脈組織校正斑塊面積增加、管腔狹窄率顯著升高（＜0.01）；與模型組同一時點比較，雙參芎連顆粒高劑量組、丹蔞片組和舒降之組大鼠給藥第6、8周腹主動脈組織校正斑塊面積減少、管腔狹窄率降低（＜0.05，＜0.01）。見圖1、表1、表2。

表1 各組大鼠不同時點校正斑塊面積比較（，%）

表2 各組大鼠不同時點管腔狹窄率比較（，%）

圖1 各組大鼠腹主動脈組織形態(tài)（HE染色，×40）

2.2 雙參芎連顆粒對模型大鼠血漿同型半胱氨酸含量的影響

與空白組同一時點比較，模型組大鼠各時點血漿Hcy含量顯著增加（＜0.05，＜0.01）；與模型組同一時點比較，各給藥組大鼠第6、8周血漿Hcy含量顯著減少（＜0.05，＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠不同時點血漿Hcy含量比較（，μmol/L）

2.3 雙參芎連顆粒對模型大鼠腹主動脈組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的影響

與空白組比較，模型組第8周大鼠腹主動脈組織MMP-2表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組第8周大鼠腹主動脈組織MMP-2表達顯著降低（＜0.01）。見表4、圖2。

圖2 各組大鼠腹主動脈組織MMP-2陽性表達（免疫組化染色，×200）

表4 各組大鼠腹主動脈組織MMP-2表達比較（）

2.4 雙參芎連顆粒對模型大鼠腹主動脈組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠第8周腹主動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65比值升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠第8 周腹主動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65比值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.01）。見圖3、表5。

圖3 各組大鼠腹主動脈組織NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠腹主動脈組織p-NF-κB p65/NF-κB p65比值比較（）

3 討論

AS是急性冠狀動脈綜合征及腦卒中的主要病理機制，尤其斑塊的穩(wěn)定性被認(rèn)為是影響AS重大心血管不良事件的關(guān)鍵因素。動脈硬化斑塊分為穩(wěn)定斑塊和不穩(wěn)定斑塊，不穩(wěn)定斑塊即易損斑塊，具有血栓形成傾向。易損斑塊的主要特點包括脂質(zhì)核心增大伴纖維帽變薄、炎癥標(biāo)志物（單核/巨噬細(xì)胞聚集，伴或不伴T淋巴細(xì)胞浸潤）、斑塊撕裂、內(nèi)皮細(xì)胞脫落伴表層血小板聚集等，其他少見特點如斑塊淺表處鈣化結(jié)節(jié)、斑塊內(nèi)出血、斑塊所在血管正性擴張等。本實驗結(jié)果顯示，隨著給藥時間延長，各給藥組大鼠校正斑塊面積減少、管腔狹窄率不同程度降低，其中以丹蔞片組、舒降之組和雙參芎連顆粒高劑量組作用明顯。

有研究顯示，體內(nèi)Hcy含量增加可加速AS發(fā)展，促進斑塊破裂形成血栓，引起心腦血管疾病。血漿Hcy含量增加與Hcy代謝酶異常及參與Hcy代謝維生素缺乏等有關(guān)。研究表明，高Hcy血癥導(dǎo)致AS的主要機制是通過在代謝過程中發(fā)生自身氧化，進而損害血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Hcy也是一種炎癥因子，可加速血管彈性纖維溶解，促進膠原纖維合成及平滑肌細(xì)胞增殖，進而加速AS發(fā)生發(fā)展。Hcy主要為蛋氨酸脫甲基后生成的代謝產(chǎn)物，本實驗所用高脂飼料中加入蛋氨酸，造成大鼠高Hcy血癥，各時點模型組大鼠血漿Hcy含量均高于空白組，而給藥后血漿Hcy含量有不同程度降低。

AS發(fā)病早期，高脂血癥引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變，使內(nèi)皮細(xì)胞活化，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞黏附并釋放多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1、血小板衍生生長因子等，從而產(chǎn)生MMP。纖維斑塊時期，血管組織抗損傷作用啟動，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞同時釋放MMP及金屬蛋白酶組織抑制因子，限制MMP降解，纖維斑塊中MMP活性持續(xù)增強，降解膠原纖維，使纖維帽變薄，斑塊不穩(wěn)定性增加。MMP-2可特異性分解多種細(xì)胞外基質(zhì)，包括彈性蛋白、層黏連蛋白等，其對AS斑塊的影響主要有通過降解包繞在中層平滑肌細(xì)胞外的基質(zhì)，促進血管中層平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移，從而分泌更多細(xì)胞外基質(zhì)；降解細(xì)胞外基質(zhì)使纖維帽變薄，減弱抵抗應(yīng)力作用，使AS斑塊易發(fā)生破裂；破壞細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用，促進血管平滑肌細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子，從而加速AS 發(fā)展。本實驗結(jié)果顯示，MMP-2在AS斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中大量表達，并在間質(zhì)中沉積，尤其斑塊肩部、纖維帽部表達密集，雙參芎連顆粒能有效降低AS斑塊中MMP-2表達。

炎性反應(yīng)是引起斑塊易損的主要驅(qū)動力，而調(diào)節(jié)炎癥最重要的轉(zhuǎn)錄因子是NF-κB。NF-κB活化并轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，啟動促炎因子轉(zhuǎn)錄和表達，促進炎癥因子大量釋放。炎癥因子可以引起巨噬細(xì)胞分化和浸潤、平滑肌細(xì)胞遷移和增殖、MMP-2/9表達升高。本實驗結(jié)果顯示，雙參芎連顆?？山档湍Ｐ痛笫蟾怪鲃用}組織p-NF-κB p65/NF-κB p65比值，抑制NF-κB p65磷酸化后激活的一系列炎癥反應(yīng)。

綜上，雙參芎連顆?？山档虯S大鼠腹主動脈斑塊面積和管腔狹窄率，通過降低血漿Hcy含量、斑塊組織MMP-2表達及NF-κB p65磷酸化水平穩(wěn)定AS斑塊。