余媛媛 肖 潔 方 超，2 李靈風(fēng) 劉 玲，2 趙 海 李劍超

(1.湖北省地質(zhì)局第六地質(zhì)大隊(duì)，湖北 孝感 432000；2.湖北楚鵬檢測(cè)科技有限責(zé)任公司，湖北 孝感 432000)

汞是一種用途較廣的重金屬，以多種形態(tài)存在于環(huán)境中，其毒性大、易揮發(fā)，且具有生物蓄積性，在人體內(nèi)達(dá)到一定濃度時(shí)，會(huì)致畸、致癌、致突變，危害人類的生殖和健康[1-2]，如日本著名的“水俁病”。因此，必須嚴(yán)格控制水體環(huán)境中汞的含量。我國(guó)《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》中就要求生活飲用水中汞的含量不得高于0.001 mg/L。因此，發(fā)展高選擇性、高靈敏度的汞離子檢測(cè)方法對(duì)于環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全和人體健康至關(guān)重要。目前水質(zhì)樣品中微量汞的測(cè)定，主要包括分光光度法[3]、色譜法[4]、光譜法[5]、電化學(xué)分析法[6]、動(dòng)力學(xué)傳感器法[7]，這些傳統(tǒng)的分析方法由于存在諸如分析流程繁瑣、儀器成本較高、選擇性不好及靈敏度不高等問題，在一定程度上限制了傳統(tǒng)方法在汞離子檢測(cè)方面的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的汞離子檢測(cè)方法[8-9]相比，熒光分子探針檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，受到了人們的廣泛關(guān)注[10-12]。

對(duì)苯二胺是典型的苯胺類化合物，其具有的特征官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，在紫外區(qū)存在生色團(tuán)，最大吸收波長(zhǎng)為226 nm，并且在該波長(zhǎng)下能發(fā)射熒光[13]，是一類光化學(xué)性能優(yōu)良熒光染料，被廣泛應(yīng)用于合成染料和顏料，是重要的化工原料和中間體[14]。有文獻(xiàn)[15]研究發(fā)現(xiàn)，銅離子能與對(duì)苯二胺發(fā)生絡(luò)合，從而產(chǎn)生相應(yīng)的激發(fā)峰與發(fā)射峰。但對(duì)苯二胺用于Hg(Ⅱ)熒光探針構(gòu)建及識(shí)別與傳感性能研究鮮見報(bào)道。本研究通過對(duì)苯二胺熒光特性的研究，確定緩沖體系的類型、pH值、濃度以及熒光探針的濃度等熒光探針實(shí)驗(yàn)條件，從方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、檢出限、精密度、準(zhǔn)確度等方面進(jìn)行考察，嘗試將所建立的實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用于水質(zhì)樣品中溶解態(tài)汞的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 對(duì)苯二胺熒光探針的設(shè)計(jì)思路

對(duì)苯二胺在226 nm波長(zhǎng)激發(fā)光譜后，會(huì)發(fā)射出熒光，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為356 nm(見圖1)。向?qū)Ρ蕉啡芤褐屑尤際g(Ⅱ)，對(duì)苯二胺的氨基向Hg(Ⅱ)提供配位的孤對(duì)電子，發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，當(dāng)和Hg(Ⅱ)形成配位的對(duì)苯二胺受到激發(fā)后，由于電子躍遷的能量發(fā)生轉(zhuǎn)移等原因，會(huì)產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象?；趯?duì)苯二胺的熒光猝滅程度與Hg(Ⅱ)濃度呈線性關(guān)系，可建立定量分析水質(zhì)樣品中溶解態(tài)汞的新方法(見圖2)。

圖1 對(duì)苯二胺的紫外吸收與熒光發(fā)射波譜Figure 1 The ultraviolet absorption and fluorescence spectrum of p-phenylenediamine.

圖2 檢測(cè)方法的原理示意圖Figure 2 Schematic diagram of the principle of the detection method.

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

LS55熒光分光光度計(jì)(Perkin Elmer)，HITACHI U-3010紫外可見光分光光度計(jì)(日本日立公司)，ZF-1三用紫外分析儀(北京啟航博達(dá)科技有限公司)，PHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及溶液的配制

對(duì)苯二胺、氫氧化鈉、硼酸、硫酸汞(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，磷酸氫二鈉(分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，磷酸二氫鈉(分析純，天津市博迪化工有限公司)，冰醋酸、鹽酸、磷酸、硫酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司)，無(wú)水乙醇(分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司)。

探針標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)的配制：稱取0.010 0 g對(duì)苯二胺溶解并定容于10 mL的去離子水中，制得濃度為1 mg/mL的對(duì)苯二胺母液，取100 μL對(duì)苯二胺母液，定容于10 mL容量瓶中，搖勻，避光冷藏備用。

Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制(10 μg/mL)：稱取0.014 8 g HgSO4并溶于10 mL的H2SO4(1+9)中，得到1 mg/mL的汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，取100 μL汞標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，定容至10 mL，搖勻，避光冷藏備用。其他金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(鉻、鉛、鎘、銀、銅、鐵、鋅、鈣、鎂、鈷、硒)的配制步驟同Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，避光冷藏備用。

HAc-NaAc緩沖溶液(Acetic acid buffer solution，AABS)的配制：使用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)0.1 mol/L的HAc溶液的pH值，制得pH值為3.0～9.0的0.1 mol/L的AABS緩沖溶液，避光冷藏備用。

伯瑞坦-羅賓森緩沖液(Britton-Robinson buffer solution，BR)的配制：BR緩沖溶液由0.04 mol/L的H3PO4、H3BO3和CH3COOH配制而成，用HCl/NaOH調(diào)節(jié)pH值為1.8～11.9，避光冷藏備用。

Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液(Phosphate buffer solution，PBS)的配制：PBS緩沖溶液由0.1 mol/L的Na2HPO4和NaH2PO4配制而成，用HCl/NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.5～9.0，避光冷藏備用。

1.4 熒光探針對(duì)苯二胺檢測(cè)汞離子條件優(yōu)化

1.4.1 選擇性實(shí)驗(yàn)

在多支試管中分別加入150 μL探針標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)和500 μL AABS緩沖溶液(pH=5.0)，分別加入一定體積不同金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，去離子水定容，超聲混勻，置于冰箱中避光冷藏1 h。檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度變化，探討不同金屬離子對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響。

1.4.2 緩沖體系的選擇

在多支比色管中先分別加入不同pH值的PBS、AABS、BR 3種緩沖溶液，再加入1 mL探針標(biāo)準(zhǔn)溶液，去離子水定容，超聲混勻，置于冰箱中避光冷藏1 h，檢測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度變化。探討不同緩沖體系對(duì)探針熒光強(qiáng)度的影響，選擇出最佳的緩沖體系。

1.4.3 AABS緩沖溶液pH值的優(yōu)化

在多支比色管中分別加入1 mL不同pH值的0.1 mol/L AABS緩沖溶液，加入200 μL探針標(biāo)準(zhǔn)溶液和40 μL Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，去離子水定容，超聲混勻，置于冰箱中避光冷藏1 h，檢測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度變化?？疾靝H值變化引發(fā)的測(cè)試體系相對(duì)熒光強(qiáng)度變化。

1.4.4 AABS緩沖溶液濃度的影響

在多支比色管中分別加入不同濃度(0～0.08 mol/L)的AABS緩沖溶液(pH=5.0)，加入200 μL探針標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)和40 μL Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，去離子水定容，超聲混勻，置于冰箱中避光冷藏1 h，檢測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度變化。探究不同濃度的AABS緩沖溶液對(duì)體系影響，確定其最佳濃度。

1.4.5 熒光探針(對(duì)苯二胺)濃度的影響

在多支比色管中均加入10 mL 0.010 mol/L AABS緩沖溶液(pH=5.0)和40 μL Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別加入不同體積的探針標(biāo)準(zhǔn)溶液，超聲混勻，置于冰箱中避光冷藏1 h，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度變化，確定最佳的熒光探針濃度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針對(duì)Hg(Ⅱ)的選擇性

對(duì)特定底物高選擇性識(shí)別是探針優(yōu)良性能之一，因此，首先考察了探針對(duì)Hg(Ⅱ)的選擇性識(shí)別。如圖3所示，Hg(Ⅱ)對(duì)探針熒光強(qiáng)度有顯著的猝滅作用，而其他金屬離子對(duì)探針熒光強(qiáng)度則無(wú)明顯的猝滅作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針可特異性識(shí)別Hg(Ⅱ)。

圖3 常見金屬離子對(duì)0.3 μg/mL對(duì)苯二胺熒光強(qiáng)度的影響Figure 3 The effect of common metal ion on the fluorescence intensity of 0.3 μg/mL p-phenylenediamine.

2.2 緩沖體系的選擇

選擇不同的緩沖體系對(duì)探針的熒光強(qiáng)度有較大的影響，如圖4所示，在PBS、BR、AABS這3種緩沖溶液體系下，探針的最大熒光發(fā)射強(qiáng)度分別在250、500、950附近，探針在AABS緩沖體系下，可以獲得相對(duì)最大的熒光強(qiáng)度，有利于提高本方法的靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AABS緩沖溶液是較佳緩沖體系。

圖4 緩沖體系的優(yōu)化(a. PBS緩沖溶液；b. BR緩沖溶液；c. AABS緩沖溶液)Figure 4 The optimization of buffer.(a. The buffer of PBS；b. The buffer of BR；c. The buffer of AABS)

2.3 AABS緩沖體系pH值的優(yōu)化

pH值對(duì)主客體相互作用起到至關(guān)重要作用，如圖5所示，當(dāng)pH<5時(shí)，隨著pH值增大，Hg(Ⅱ)對(duì)探針熒光強(qiáng)度的猝滅作用不斷增強(qiáng)，在pH=5.0時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著pH值繼續(xù)增大，汞離子對(duì)探針熒光強(qiáng)度的猝滅作用不斷減弱。當(dāng)反應(yīng)體系pH=5.0時(shí)，即有利于Hg(Ⅱ)的解離，也可避免過酸造成對(duì)苯二胺的水解，有助于熒光淬滅反應(yīng)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,pH=5.0是較佳的酸堿條件。

圖5 AABS緩沖體系pH值的優(yōu)化Figure 5 The pH optimization of buffer AABS.

2.4 AABS緩沖體系濃度的影響

在較佳的pH值條件下，考察了不同濃度的AABS緩沖溶液對(duì)反應(yīng)體系的影響，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明,AABS緩沖溶液濃度為0.010 mol/L，汞離子對(duì)探針熒光強(qiáng)度的猝滅作用最強(qiáng)。因此，0.010 mol/L AABS緩沖溶液是較適宜的緩沖體系濃度。

圖6 AABS緩沖體系濃度的優(yōu)化Figure 6 The optimization of buffer concentration.

2.5 熒光探針(對(duì)苯二胺)濃度的影響

為了提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度，考察了汞離子對(duì)不同濃度熒光探針的熒光淬滅作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，隨著熒光探針的濃度提高，熒光淬滅的強(qiáng)度不斷提升，當(dāng)熒光探針的濃度達(dá)到0.40 μg/mL后，汞離子對(duì)熒光探針的猝滅效果開始趨于穩(wěn)定并有緩慢下降的趨勢(shì)。因此，0.40 μg/mL熒光探針溶液為較佳的底物濃度。

圖7 對(duì)苯二胺濃度的優(yōu)化Figure 7 The optimization of concentration of p-phenylenediamine.

3 熒光探針在實(shí)際水樣中的應(yīng)用

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

為驗(yàn)證探針對(duì)實(shí)際樣品中汞離子檢測(cè)的可行性，借助線性回歸方程，測(cè)定水中可溶態(tài)汞。

取400 μL探針標(biāo)準(zhǔn)溶液于10.0 mL比色管中，加入500 μL AABS緩沖液(pH=5.0)，向上述溶液中加不同體積的Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液，去離子水定容，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液熒光強(qiáng)度并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖8。結(jié)果表明，當(dāng)Hg(Ⅱ)濃度在0.64～1.36 μg/mL范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度的猝滅與Hg(Ⅱ)濃度成良好的線性關(guān)系。線性方程為y=389.21x-218.62，相關(guān)系數(shù)為0.999 1。

圖8 最佳條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 8 The standard curve under optimum conditions.

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)測(cè)定多次樣品空白，以3σ/k(式中：σ為樣品空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為校準(zhǔn)曲線斜率)計(jì)算得到該方法的檢出限(LOD)為0.032 μg/mL。

3.2 樣品分析

在與標(biāo)準(zhǔn)曲線相同熒光探針實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)模擬樣品(由Hg(Ⅱ)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制)進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。另外，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)三個(gè)實(shí)際水質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該方法測(cè)定水中溶解態(tài)汞的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.72%，加標(biāo)回收率均在96.2%～105%，該方法具有較好的精密度、較低的檢出限和較高的準(zhǔn)確度。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 實(shí)際樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

基于對(duì)苯二胺的熒光猝滅程度與Hg(Ⅱ)濃度呈線性關(guān)系，建立定量分析水質(zhì)樣品中溶解態(tài)汞的新方法。在pH=5.0的0.010 mol/L AABS體系中，0.40 μg/mL對(duì)苯二胺熒光探針的熒光的猝滅程度與Hg(Ⅱ)的濃度在0.64～1.36 μg/mL有著良好的線性關(guān)系。與一些傳統(tǒng)的測(cè)汞方法相比，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、精密度好、成本低、對(duì)環(huán)境造成的污染較小，可有效地應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境水質(zhì)樣品中溶解態(tài)汞的檢測(cè)。