郝 藝 羅曉磊 王 敏 張 偉 肖朝江 姜 北*

1.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000； 2.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000

白族藥用植物倒鉤刺為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物三葉懸鉤子(RubusdelavayiFranch.)的全草，直立矮小灌木，常生于海拔2000～3000 m的山坡溝谷稀疏灌木叢中[1]。該植物在大理分布廣泛，藥用全草，夏秋采集，鮮用藥效較好，是傳統(tǒng)的白族藥用植物[2]。據(jù)白族醫(yī)藥文獻(xiàn)記載，倒鉤刺主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性結(jié)膜炎、扁桃體炎、腮腺炎、四季感冒、痢疾等[3]。此外，課題組成員在藥材市場及民間走訪時(shí)發(fā)現(xiàn)，在大理洱源、喜洲、漾濞、下關(guān)一帶白族民間還常將倒鉤刺用于防治旋毛蟲病。另有文獻(xiàn)報(bào)道，倒鉤刺植物還具有體外抗菌[4]、抗炎[5]、抗寄生蟲[6]、抗腫瘤[7]等作用。

目前，有關(guān)倒鉤刺植物化學(xué)成分有少量研究報(bào)道，分離得到的化合物主要包括萜類、甾體類、黃酮類、酚酸類等成分[8]。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)倒鉤刺的化學(xué)成分，明確其藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)利用多種色譜方法對(duì)白族藥用植物倒鉤刺進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離得到11個(gè)化合物，包括5個(gè)三萜類、4個(gè)酚酸類、2個(gè)甾體類化合物。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Bruker Avance Ⅲ-400核磁共振儀(德國布魯克公司，TMS為內(nèi)標(biāo))；Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀(美國戴安公司)；Bruker Daltonics MS系統(tǒng)(德國布魯克公司)；柱色譜用硅膠和GF254薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；MCI CHP-20(75～150 μm)(日本三菱公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(瑞典Amersham Biosciences公司)；D101型大孔樹脂(天津波鴻樹脂科技有限公司)；石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇均為工業(yè)級(jí)重蒸后使用；異丙醇為分析純(上?；び邢薰?。

1.2 材料 本實(shí)驗(yàn)所用植物樣品于2018年10月購自云南大理，由大理大學(xué)藥學(xué)院張德全教授鑒定為三葉懸鉤子(RubusdelavayiFranch.)，植物標(biāo)本(編號(hào)：20181019-3)保存于大理大學(xué)云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

倒鉤刺干燥全株2 kg，粉碎后用8 L 95%乙醇室溫浸提4次，每次24 h，合并濾液減壓濃縮得總浸膏308 g，400 mL蒸餾水溶解后經(jīng)D101型大孔樹脂分離，以乙醇-水(0～100%)梯度洗脫得水、50%乙醇及100%乙醇3個(gè)洗脫部位。50%乙醇洗脫部位經(jīng)硅膠柱色譜進(jìn)行分離，三氯甲烷-丙酮溶劑系統(tǒng)梯度洗脫(1∶0～0∶1)，薄層色譜檢測并合并相同流分，得8個(gè)組分Frs.A～H。組分Fr.B經(jīng)硅膠柱層析分離，氯仿-甲醇(30∶1～1∶1)、石油醚-乙酸乙酯(50∶1～1∶1)反復(fù)洗脫得4個(gè)亞組分(Fr.B-1-1～Fr.B-1-4)。Fr.B-1-1經(jīng)硅膠柱色經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮5∶1)等度洗脫得化合物3(7 mg)。Fr.B-1-2經(jīng)MCI柱色譜(乙醇-水0～100%)梯度洗脫得2個(gè)亞組分Fr.B-1-2-1、Fr.B-1-2-2。Fr.B-1-2-1經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)洗脫得化合物5(100 mg)；Fr.B-1-2-2經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-乙酸乙酯2∶1)洗脫得化合物6(12 mg)、7(10 mg)。組分Fr.D用MCI柱層析分離，甲醇-水系統(tǒng)梯度洗脫(0∶1～1∶0)，硅膠柱色譜(氯仿-丙酮30∶1～1∶1)梯度洗脫，得6個(gè)亞組分(Fr.D-1-1～Fr.D-1-6)。Fr.D-1-1經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1)柱色譜洗脫得3個(gè)亞組分(Fr.D-1-1-1～Fr.D-1-1-3)。Fr.D-1-1-2經(jīng)硅膠柱色譜(環(huán)己烷-異丙醇10∶1～4∶1)梯度洗脫得化合物11(10 mg)；Fr.D-1-1-3經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿-甲醇=1∶1)柱色譜洗脫得化合物10(8 mg)。Fr.D-1-2經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-乙酸乙酯20∶1～5∶1)梯度洗脫得化合物8(40 mg)。Fr.D-1-3經(jīng)Sephadex LH-20(甲醇)柱色譜洗脫得化合物9(10 mg)。組分Fr.F用硅膠柱層析分離，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫得9個(gè)組分Fr.F-1～Fr.F-9。Fr.F-2經(jīng)硅膠柱色譜(氯仿-甲醇50∶1～0∶1)梯度洗脫得10個(gè)組分Fr.F-2-1～Fr.F-2-10。Fr.F-2-7經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-異丙醇80∶1～20∶1)梯度洗脫得化合物1(14 mg)；Fr.F-2-10經(jīng)硅膠柱色譜(石油醚-丙酮10∶1～2∶1)梯度洗脫得化合物2(30 mg)。Fr.F-3經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇50∶1)梯度洗脫得化合物4(10 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：分子式為C30H48O4，白色粉末。1H-NMR(400MHz, C5D5N)δ∶5.48(1H, m, H-12), 4.13(1H, td,J=11.0, 4.1 Hz H-2β), 3.43(1H, dd,J=9.3, 2.9 Hz, H-3α), 2.64(1H, d,J=10.8 Hz, H-18), 1.29, 1.21, 1.09, 0.98, 0.96(each 3H, s, 5×Me), 1.03(3H, d,J=7.4Hz, H-30), 1.01(3H, d,J=7.4 Hz, H-29);13C NMR(100MHz, C5D5N)δ∶47.8(t, C-1), 68.3(d, C-2), 83.6(d, C-3), 39.6(s, C-4), 55.6(d, C-5), 18.6(t, C-6), 33.0(t, C-7), 39.7(s, C-8), 47.8(d, C-9), 38.2(s, C-10), 23.5(t, C-11), 125.3(d, C-12), 139.1(s, C-13), 42.3(s, C-14), 28.4(t, C-15), 24.6(t, C-16), 47.8(s, C-17), 53.3(d, C-18), 39.2(d, C-19), 39.2(d, C-20), 30.7(t, C-21), 37.2(t, C-22), 29.1(q, C-23), 17.3(q, C-24), 16.7(q, C-25), 17.2(q, C-26), 23.7(q, C-27), 179.7(s, C-28), 17.5(q, C-29),21.2(q, C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為2α-羥基熊果酸。

化合物2：分子式為C30H48O3，白色粉末。在TLC上經(jīng)多種溶劑系統(tǒng)分別展開后化合物2與已鑒定化合物烏蘇酸的Rf蓮值及斑點(diǎn)顏色均一致，故鑒定該化合物為烏蘇酸。

化合物3：分子式為C30H46O5，白色粉末。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶5.30(1H, t,J=4.3 Hz, H-12), 1.32, 1.30, 1.29, 1.19, 1.11, 0.86(each 3H, s, 6×Me), 0.93(3H, d,J=6.9 Hz, H-30);13C NMR(100MHz, CD3OD)δ∶50.6(t, C-1), 70.4(d, C-2), 216.0(s, C-3), 48.8(s, C-4), 58.8(d, C-5), 20.4(t, C-6), 33.9(t, C-7), 41.3(s, C-8), 48.2(d, C-9), 38.8(s, C-10), 24.9(t, C-11), 128.9(d, C-12), 140.2(s, C-13), 42.7(s, C-14), 29.6(t, C-15), 26.7(t, C-16), 48.8(s, C-17), 55.0(d, C-18), 73.5(s, C-19), 43.1(d, C-20), 27.0(t, C-21), 38.8(t, C-22), 25.4(q, C-23), 22.1(q, C-24), 17.6(q, C-25), 17.0(q, C-26), 24.8(q, C-27), 183.1(s, C-28), 27.3(q, C-29),16.4(q, C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid。

化合物4：分子式為C30H48O4，白色粉末。1H-NMR(400MHz, C5D5N)δ∶5.48(1H, t,J=3.6, 7.3 Hz, H-12), 4.12(1H, td,J=11.0, 4.2 Hz H-2β), 3.42(1H, d,J=9.3 Hz, H-3α), 3.31(1H, dd,J=14.1, 4.5 Hz, H-18), 2.27(1H, dd,J=12.4, 4.4 Hz, H-1), 1.29, 1.27, 1.09, 1.02, 1.01, 0.99, 0.95(each 3H, s, 7×Me),13C NMR(100MHz, C5D5N)δ∶46.2(t, C-1), 68.3(d, C-2), 83.6(d, C-3), 39.6(s, C-4), 55.6(d, C-5), 18.6(t, C-6), 29.6(t, C-7), 39.6(s, C-8), 47.9(d, C-9), 38.3(s, C-10), 23.5(t, C-11), 122.2(d, C-12), 144.6(s, C-13), 42.0(s, C-14), 28.0(t, C-15), 23.7(t, C-16), 46.4(s, C-17), 41.7(d, C-18),47.5(t, C-19), 30.7(s, C-20), 34.0(t, C-21), 33.1(t, C-22), 29.1(q, C-23), 17.5(q, C-24), 17.2(q, C-25), 16.6(q, C-26), 25.9(q, C-27), 180.0(s, C-28), 33.1(q, C-29), 23.4(q, C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為maslinic acid.

化合物5：分子式為C30H48O4，白色結(jié)晶(丙酮)。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶4.67(1H, d,J=1.9 Hz H-29α), 4.67(1H, d,J=1.9 Hz H-29β),3.57(1H, td,J=4.7, 10.3, 10.4 Hz, H-3), 2.89(1H, m, H-19),2.83(1H, d,J=9.6 Hz H-3), 1.65, 0.94, 0.90, 0.87, 0.77, 0.72(each 3H, s, 6×Me);13C NMR(100MHz, CD3OD)δ∶48.5(t, C-1), 69.5(d, C-2), 84.4(d, C-3), 40.5(s, C-4), 56.8(d, C-5), 19.5(t, C-6), 35.5(t, C-7), 42.0(s, C-8), 52.1(d, C-9), 39.5(s, C-10), 22.2(t, C-11), 26.8(t, C-12), 39.5(d, C-13), 43.6(s, C-14), 30.8(t, C-15), 33.3(t, C-16), 57.5(s, C-17), 50.4(d, C-18), 48.5(d, C-19), 152.0(s, C-20), 31.7(t, C-21), 38.1(t, C-22), 29.2(q, C-23), 17.3(q, C-24), 17.9(q, C-25), 16.6(q, C-26), 15.1(q, C-27), 180.0(s, C-28), 110.2(t, C-29),19.5(q, C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為alphitolic acid。

化合物6：分子式為C29H50O2，白色固體。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶5.49(1H, d,J=4.9 Hz, H-6), 3.72(1H, s, H-7), 3.41(1H, m, H-3), 1.03(3H, s, H-19), 0.91(3H, d,J=6.7 Hz, H-21), 0.85(3H, d,J=7.8 Hz, H-29), 0.81(6H, d,J=7.5 Hz, H-26, 27), 0.68(3H, s, H-18);13C NMR(100MHz, CD3OD)δ∶37.4(t, C-1),31.4(t, C-2), 71.3(d, C-3), 42.0(t, C-4), 146.1(d, C-5), 123.7(t, C-6), 65.4(d, C-7), 37.0(d, C-8), 42.3(d, C-9), 37.5(s, C-10), 20.8(t, C-11), 39.1(t, C-12), 42.0(s, C-13), 50.0(d, C-14), 24.4(t, C-15), 28.4(t, C-16), 55.7(d, C-17), 11.7(q, C-18),18.3(d, C-19), 36.1(d, C-20), 19.1(q, C-21), 34.0(t, C-22), 29.2(t, C-23), 45.8(d, C-24), 25.5(d, C-25), 18.9(q, C-26), 19.9(q, C-27), 22.8(t, C-28), 11.9(q, C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為7α-羥基谷甾醇。

化合物7：分子式為C29H50O2，白色固體。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶5.21(1H, s, H-6), 3.68(1H, d,J=8.0 Hz, H-7), 3.41(1H, m, H-3), 1.03(3H, s, H-19), 0.93(3H, d,J=6.7 Hz, H-21), 0.85(3H, d,J=7.8 Hz, H-29), 0.81(6H, d,J=7.5 Hz, H-26, 27), 0.69(3H, s, H-18);13C NMR(100MHz, CD3OD)δ∶36.9(t, C-1),31.5(t, C-2), 71.4(d, C-3), 41.7(t, C-4), 143.3(d, C-5), 125.3(t, C-6), 73.3(d, C-7), 39.4(d, C-8), 48.2(d, C-9), 36.5(s, C-10), 21.4(t, C-11), 42.8(t, C-12), 40.9(s, C-13), 56.0(d, C-14), 26.5(t, C-15), 28.4(t, C-16), 55.2(d, C-17), 12.1(q, C-18),19.2(d, C-19), 36.1(d, C-20), 19.1(q, C-21), 34.0(t, C-22), 29.1(t, C-23), 45.8(d, C-24), 25.5(d, C-25), 18.8(q, C-26), 19.9(q, C-27), 22.8(t, C-28), 12.4(q, C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為7β-羥基谷甾醇。

化合物8：分子式為C11H14O5，黃色固體粉末。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶7.05(2H, s, H-2, 6), 4.21(2H, t,J=6.5 Hz, H-1′),1.70(2H, m, H-2′), 1.47(2H, m, H-3′), 0.97(3H, t,J=8.0 Hz, H-4′);13C-NMR(100MHz, CD3OD)δ∶121.7(s, C-1), 109.9(d, C-2, 6), 146.4(s, C-3, 5), 139.6(s, C-4), 168.6(s, C-7), 65.5(t, C-1′), 31.9(t, C-2′), 20.3(t, C-3′), 14.1(q, C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為沒食子酸正丁酯。

化合物9：分子式為C8H7O5，白色固體粉末。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ∶7.06(2H, s, H-2, 6), 3.79(3H, s, -OCH3);13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ∶121.3(s, C-1), 110.0(d, C-2, 6), 146.3(s, C-3, 5), 139.6(s, C-4), 169.0(s, C-7), 52.3(q, C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為沒食子酸甲酯。

化合物10：分子式為C8H8O4，黃色固體粉末。1H-NMR(400MHz, CD3OD)δ∶7.25(1H, d,J=3.0 Hz, H-6), 6.97(1H, dd,J=8.9, 3.0 Hz, H-4), 6.78(1H, d,J=8.9 Hz, H-3);13C-NMR(100MHz, CD3OD)δ∶113.7(s, C-1), 156.4(s, C-2), 116.0(d, C-3), 124.7(d, C-4), 150.5(s, C-5), 118.7(d, C-6), 173.3(s, C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為龍膽酸。

化合物11：分子式為C5H4O3，白色粉末。1H-NMR(400MHz, CDCl3)δ∶10.97(1H, brs, 2-COOH), 7.65(1H, s, H-3), 7.34(1H, d,J=3.4 Hz, H-5), 6.56(1H, dd,J=3.4, 1.7 Hz, H-4);13C-NMR(100MHz, CDCl3)δ∶143.9(s, C-2), 120.3(d, C-3), 112.4(d, C-4), 147.6(d, C-5), 163.9(s, 2-COOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物為2-呋喃甲酸。

4 討論

本研究從白族藥用植物倒鉤刺中分離鑒定了11個(gè)化合物，化合物1～11均為首次從該植物中分離得到，包括5個(gè)三萜：2α-羥基熊果酸(1)、烏蘇酸(2)、2α,19α-dihydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid(3)、maslinic acid(4)、alphitolic acid(5)；4個(gè)酚酸：沒食子酸正丁酯(8)、沒食子酸甲酯(9)、龍膽酸(10)、2-呋喃甲酸(11)；2個(gè)甾體：7α-羥基谷甾醇(6)、7β-羥基谷甾醇(7)?；衔?～8、10、11為首次從懸鉤子屬中分離得到。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，上述部分化合物具有顯著的生物活性。2α-羥基熊果酸(1)在125 μg/mL濃度下具有較好的體外抗人輪狀病毒(HRV)作用[18]。同時(shí)，2α-羥基熊果酸(1)可以將細(xì)胞阻滯在G1期，從而發(fā)揮抗人白血病細(xì)胞HL-60作用[19]；其還可通過調(diào)節(jié)p38/MAPK信號(hào)通路，抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。沒食子酸甲酯(9)則可通過抑制Akt和ERK1/2通路來抑制大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373的增殖和遷移，從而發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性[21]。此外，沒食子酸甲酯(9)還具有抗炎、抗氧化和抗致齲菌等活性[22-23]。

綜上所述，倒鉤刺中分離鑒定的化合物的活性報(bào)道與倒鉤刺的抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗菌等作用相一致，進(jìn)一步證實(shí)倒鉤刺民間用藥具有一定的合理性。本研究為完善白族植物藥倒鉤刺的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)一步研究開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。