梁富強，段姍姍，濮欣然，郭銳林，石嘉懌

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

作為稻米加工過程的重要副產(chǎn)物，米糠不僅富含優(yōu)良蛋白質(zhì)，還含有具有多種生物活性的小分子物質(zhì)，如酚酸類化合物[1]。谷蛋白是米糠中主要的貯藏蛋白之一（含量可達22%[2]），不僅具有較高的必需氨基酸含量，還是多種生物活性肽的重要來源，如抗氧化肽[3]、降血壓肽[2]和降血糖肽[4]等，因此具有較高的營養(yǎng)健康價值。根據(jù)分子結構的不同，酚酸類化合物可以分為羥基苯甲酸和羥基肉桂酸兩大類，芥子酸（sinapic acid，SA）是米糠中一種常見的含量較高的羥基肉桂酸（分子結構如圖1A所示）[5]。酚酸類物質(zhì)不僅具有良好的抗氧化活性，也能夠通過作用于不同的靶點發(fā)揮多種生物活性。因此，酚酸單體及其協(xié)同效應被認為是米糠及全谷物糙米具有多種健康效應的重要原因[6]。冉玲等[7]的研究表明SA和阿魏酸的ABTS+自由基清除能力不僅強于咖啡酸，而且高于常見的內(nèi)源抗氧化劑谷胱甘肽。而與阿魏酸的結構不同，SA分子結構的苯環(huán)上有兩個甲氧基（圖1），研究發(fā)現(xiàn)這對于SA的生物活性具有重要影響。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)SA的DPPH自由基清除能力明顯高于阿魏酸。Jeon等[9]的研究也表明SA對于紫外損傷人皮膚成纖維細胞的保護效果顯著優(yōu)于阿魏酸。因此，SA作為一種代表性的酚酸化合物近年來受到越來越多的關注。

圖1 SA的分子結構Fig.1 Molecular structure of SA

作為共存于食品體系中的小分子和生物大分子，酚酸和蛋白在加工、膳食和消化過程中非常容易發(fā)生共價結合。Dai等[10]的研究表明大米谷蛋白與原花青素在疏水相互作用的驅動下發(fā)生非共價結合。研究表明這不僅能改變蛋白質(zhì)的營養(yǎng)功能特性，也會對小分子多酚的化學穩(wěn)定性、生物利用率及生物活性產(chǎn)生顯著影響[11?12]。小分子化合物與蛋白的結合位點及作用機制是決定其結合親和力及生物效應的基礎[13]。然而，作為共存于米糠中的小分子和生物大分子，SA與米糠谷蛋白（rice bran glutelin，RBG）非共價相互結合的動態(tài)行為及其分子機制仍不清楚。因此，研究擬采用光譜學方法結合同源模建、分子結合和分子動力學模擬探究RGB和SA的結合行為及分子機制，以期為RGB-SA非共價復合物在食品營養(yǎng)中的應用提供分子和結構基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠 由南京遠望富硒農(nóng)產(chǎn)品有限責任公司提供；芥子酸（純度>95%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲亞砜（純度≥96.0%） 北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉（純度≥96.0%） 上海麥克林生化科技股份有限公司；鹽酸（分析純） 中國醫(yī)藥集團有限公司。

磁力攪拌器 常州國華電器有限公司；FL-7000熒光分光光度計、U3900型紫外-可見光分光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RBG制備 參考實驗室提取大米谷蛋白的方法[14]提取RBG：將脫脂米糠依次分離清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白后的殘渣，加入0.05 mol/L NaOH提取谷蛋白，離心取上清（8000 r/min，15 min），調(diào)節(jié)pH至4.8，靜置沉淀。將沉淀物水洗至pH中性，凍干得到RBG提取物。采用凱氏定氮法測得RBG提取物中蛋白質(zhì)含量約為85.3%±2.6%。

1.2.2 熒光光譜測定 將0.2 g RBG溶解于50 mL磷酸鹽緩沖液中離心制備蛋白母液，與不同濃度的SA混合制備SA終濃度為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 μmol/L的RBG-SA復合物體系。設定激發(fā)波長為280 nm，狹縫為5 nm，熒光分光光度計發(fā)射波長為300～500 nm范圍的熒光光譜。此外，將Δλ分別設定為15和60 nm，測定SA對RBG同步熒光光譜的影響。采用式（1）～式（4）計算SA猝滅RBG熒光的速率常數(shù)（Ksv）、猝滅常數(shù)（Kq）、結合常數(shù)（Ka）、結合位點數(shù)（n）及熱力學參數(shù)，包括焓變（?H），熵變（?S）和吉布斯自由能（?G）[15]。

式中：F0和F分別是SA加入前后RBG的熒光強度； τ0表示生物分子的熒光平均壽命（10?8s）；[Q]表示SA濃度；T表示開爾文溫度；R表示氣體常數(shù)（8.314 J/mol/K）。

1.2.3 RBG三維結構同源模建 基于多模板同源模建的方法構建RBG的三維結構模型[16]。從Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）下載谷蛋白的氨基酸序列（P07728），利用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）在線網(wǎng)站進行序列比對以尋找適合的模板結構。根據(jù)比對結果選擇同源模建模板，采用Modeller 10.0軟件構建RBG的三維結構模型，通過PROCHECK程序（https://saves.mbi.ucla.edu/）評估模型質(zhì)量。

1.2.4 分子對接 為尋找小分子配體SA在RBG上所有可能的結合位點，將同源模建獲得的RBG三維結構文件和小分子配體SA的三維結構文件上傳到CB-dock2（https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php）進行口袋搜索和分子對接[17]。通過Discovery Studio客戶端和Pymol可視化對接結果。

1.2.5 分子動力學（Molecular dynamic，MD）模擬以分子對接獲得的5種結合構象為初始結構，采用Gromacs 2019.6軟件包參考實驗室的方法[18]進行MD模擬。6個模擬體系（單獨的RBG和5個RBGSA復合物）均采用立方體盒子，TIP3P水模型，力場為amber99sb-ildn。添加Na+和Cl?離子做為抗衡離子，以中和模擬體系電荷。首先采用最陡下降法對模擬體系進行能量最小化，然后依次進行100 ps等溫系綜和等溫等壓系綜下的限制性模擬以平衡體系，使體系的溫度和壓力分別達到298 K和1 bar。最后對平衡后的體系進行100 ns的無限制動力學模擬，時間步長為2 fs。對模擬軌跡通過Gromacs 2019.6結合視覺分子動力學軟件進行分析。采用分子力學泊松-玻爾茲曼比表面積（Molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area，MM-PBSA）方法計算SA與RBG的結合自由能。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復三次或以上，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±平均偏差表示。采用Origin 2018軟件繪圖，SPSS22.0進行統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著。使用chemoffice軟件繪制SA分子結構。

2 結果與分析

2.1 熒光猝滅及機制分析

圖2A～圖2C顯示了不同濃度SA存在下RBG熒光光譜在三個溫度下的變化?？梢钥闯鯮BG在345 nm處有最大發(fā)生峰。隨著SA濃度的不斷增加，RBG的內(nèi)源熒光強度明顯下降。研究認為這種熒光猝滅效應可能是由于非共價結合形成了復合物，改變了蛋白中色氨酸和酪氨酸殘基的微環(huán)境[19]。

動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅是兩種常見的熒光猝滅機制，可以通過Stern-Volmer方程（圖2D）和結合參數(shù)（表1）判斷。三個溫度下Ksv隨著溫度的增大而增大，說明存在動態(tài)猝滅。然而，最小的猝滅速率（Kq=1.55×1012L/mol/s）遠大于最大動態(tài)猝滅常數(shù)（2.0×1010L/mol/s），表明SA對RBG的熒光淬滅主要是由于基態(tài)復合物的形成而不是動態(tài)碰撞。因此，可以推斷SA對于RBG熒光淬滅主要是靜態(tài)猝滅。前人研究表明包括芥子酸與玉米醇溶蛋白結合的Kq也遠大于最大動態(tài)猝滅常數(shù)，判斷猝滅類型為靜態(tài)猝滅[20]。Li等[21]的研究認為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對于大米谷蛋白的熒光猝滅也屬于靜態(tài)猝滅。對于靜態(tài)猝滅，可以進一步采用雙對數(shù)方程（圖2E）計算SA與RBG之間的結合常數(shù)與結合位點數(shù)。由表1可以看出，SA與RBG的結合常數(shù)隨著溫度的升高而增大，表明形成復合物的穩(wěn)定性與溫度正相關。與前人研究相比，SA與RBG的結合常數(shù)（298 K）大于SA與白菇魚肌球蛋白[22]及大米谷蛋白與沒食子酸[23]的結合常數(shù)。岳一珂[20]的研究也顯示大多數(shù)羥基肉桂酸與玉米醇溶蛋白的結合能力強于羥基苯甲酸?？梢酝茰ySA與RBG能夠發(fā)生非共價結合且表現(xiàn)出較強的結合能力。

圖2 SA對RBG內(nèi)源熒光的猝滅機制Fig.2 Quenching mechanism of SA on RBG endogenous fluorescence

表1 SA與RBG相互作用的猝滅常數(shù)及熱力學參數(shù)Table 1 Quenching parameters and thermodynamic parameters for SA-RBG interaction

氫鍵、范德華力、靜電和疏水相互作用是蛋白與多酚非共價結合的主要相互作用力。這些作用力類型可以通過熱力學參數(shù)來確定。根據(jù)前人理論，一般認為，當ΔS<0，ΔH<0時為氫鍵相互作用；ΔS>0，ΔH>0時為疏水相互作用；當ΔS>0，ΔH<0時為靜電相互作用[24]。由表1可知，ΔG為負值，說明SA與RBG的結合是自發(fā)行為；而ΔS和ΔH均大于0，表明RBG-SA非共價復合物的形成主要由疏水相互作用驅動。Jia等[25]的研究表明SA與杏仁蛋白的非共價結合也主要是由疏水相互作用力驅動的。

2.2 同步熒光

同步熒光光譜可以表征蛋白中色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境極性變化，可以進一步反映SA對RBG構象的影響。圖3A和圖3B分別顯示的是不同濃度SA存在下RBG中酪氨酸（Δλ=15 nm）和色氨酸（Δλ=60 nm）的同步熒光光譜變化?？梢园l(fā)現(xiàn)色氨酸（5069）的熒光強度明顯高于酪氨酸（1011），說明RBG的內(nèi)源熒光主要由色氨酸貢獻，這與戴濤濤[23]的結果一致。隨著SA濃度的增加，RBG中的酪氨酸和色氨酸的熒光強度均呈現(xiàn)規(guī)律性下降的趨勢，可以發(fā)現(xiàn)最大發(fā)射峰的位置發(fā)生了輕微藍移，說明SA的結合導致酪氨酸和色氨酸殘基所處微環(huán)境的疏水性有所增加。

圖3 SA對RBG同步熒光光譜的影響Fig.3 Effect of SA on the synchronous fluorescence spectra of RBG

2.3 分子對接結果

實驗結果說明SA與RBG發(fā)生了非共價結合，然而僅通過實驗的手段難以闡述受體蛋白識別小分子配體的過程、結合穩(wěn)定性及分子機制。近年來分子對接已經(jīng)成為研究受體和配體相互作用分子機制的重要手段。由于目前尚無RBG的晶體結構，因此首先通過多模板同源模建的方法建立了其三維結構。根據(jù)序列比對結果中的相似性（>30%）選擇5WPW（51.36%）、5XTY（50.66%）、2E9Q（45.05%）、3QAC（44.52%）和6B4S（45.15%）五個蛋白結構作為模板進行多模板同源模建，獲得RBG的三維結構模型（圖4A）。拉氏圖分析（圖4B）顯示，沒有氨基酸殘基（0.0%）位于不允許區(qū)域（disallowed regions），90%以上的氨基酸殘基位于允許區(qū)域（allowed regions）和最佳區(qū)域（most favoured regions）。上述說明得到的RBG三維結構構象合理，質(zhì)量較高，可用于后續(xù)研究[26]。

通過基于口袋搜索的分子對接可以發(fā)現(xiàn)RBG存在5個潛在的配體結合位點（圖4C），根據(jù)位點的三維坐標依次命名為C1～C5位點。SA在這5個位點的分子對接打分均為負值（表2）表明SA能夠自發(fā)與RBG結合。很多研究一般根據(jù)分子對接打分選擇多酚與蛋白的結合構象[27]。然而，這5個位點的對接打分非常接近，因此，僅依據(jù)分子對接結果無法確定SA在RBG上最可能的結合位點。近年來越來越多的研究認識到分子對接只能提供蛋白和小分子配體的靜態(tài)結合模式，而無法分析兩者相互作用的動態(tài)過程和結合穩(wěn)定性[28]。MD模擬能夠從時間尺度和分子水平探究受體蛋白和小分子配體結合識別的穩(wěn)定性及動態(tài)行為。因此，需要進一步結合MD模擬以探究SA與RBG最可能的結合位點。

圖4 RBG三維結構及其與SA的分子對接結果Fig.4 Three-dimensional structure of RBG and the molecular docking result between it and SA

表2 SA在RBG 5個潛在結合位點的分子對接打分Table 2 Docking scores for SA at five potential binding sites of RBG

2.4 SA與RBG最可能結合位點的確定

為了確定SA的RBG最可能的結合位點，以分子對接得到的5種結合構象為起始結構進行了MD模擬。均方根位移（root mean square deviation，RMSD）是衡量模擬體系是否達到穩(wěn)定狀態(tài)的重要指標，小分子配體的RMSD能夠反映其在結合口袋中運動的穩(wěn)定性[29]。MD過程中RBG蛋白骨架的RMSD的變化如圖5A所示，可以發(fā)現(xiàn)在配體SA不存在（RBG）和存在（pro_C1-pro_C5）的情況下，蛋白骨架的RMSD值10 ns后均能達到平衡狀態(tài)（0.2～0.3 nm之間），說明MD過程中蛋白RBG能夠很快達到穩(wěn)定狀態(tài)。五個結合位點MD過程中配體SA的RMSD變化情況和運動軌跡如圖5B～圖5F所示。由圖5F可以發(fā)現(xiàn)，60 ns后配體SA的RMSD發(fā)生了急劇升高，進一步結合其MD過程中的運動軌跡可以發(fā)現(xiàn)SA在60 ns后脫離了蛋白結合位點，說明SA不能穩(wěn)定結合在位點C5。而結合在位點C1～C4時，根據(jù)圖5B～圖5E可以看出，雖然在MD過程中配體SA的RMSD也都產(chǎn)生了一定的波動，但是結合SA整個運動軌跡可以看出其均未脫離，這表明SA能夠穩(wěn)定結合在RBG上除C5外的4個位點。

圖5 RMSD曲線及結合自由能Fig.5 RMSD plots and binding free energy

實驗結果（表1）表明，SA與RBG的結合位點數(shù)n接近1，因此，為了確定小分子配體SA在RBG上這個最可能的結合位點，進一步采用MM-PBSA的方法計算了SA在C1～C4四個結合位點的結合自由能。如圖5G所示，SA結合在剩余四個位點的結合自由能值分別為?43.99、?61.15、?25.75和?26.44 kJ/mol。結合自由能均為負值說明SA與RBG的結合是自發(fā)行為，這與實驗獲得的熱力學參數(shù)和分子對接結果一致[30]。SA在C2位點的結合自由能顯著低于其他位點（P<0.05），表明在這一位點的親和力最強。同時，圖5C顯示在結合位點C2，35 ns后小分子配體SA的RMSD值穩(wěn)定在約0.8 nm。因此，根據(jù)結合自由能和RMSD變化情況可以推測位點C2是SA與RBG最可能的結合位點。與前人的研究比較可以發(fā)現(xiàn)，SA在RBG上的結合位點不同于原花青素[10]、沒食子酸[31]和表沒食子兒茶素沒食子酸酯[32]的結合位點。這一方面可能是由于前人研究采用靜態(tài)的分子對接分析三種多酚與RBG的相互作用，沒有考慮結合的動態(tài)過程；另一方面配體SA的分子結構與這三種多酚類物質(zhì)不同，也可能導致結合位點存在明顯差異。因此，多酚類化合物與RBG非共價相互作用的構效關系仍需深入研究。

2.5 SA與RBG的結合穩(wěn)定性及分子機制分析

蛋白質(zhì)回旋半徑（radius of gyrate，Rg）可以表征蛋白質(zhì)的密實度，值越大表示蛋白溶脹和結構松弛[29]。圖6A可以看出，MD過程中單獨RBG和RBG-SA復合物的Rg平均值分別穩(wěn)定在約2.59和2.58 nm，說明SA的結合對于RBG的密實度沒有明顯影響。均方根漲落（root mean square fluctuation，RMSF）能夠反映MD過程中單個氨基酸殘基的波動情況。圖6B表明，配體SA存在的情況下RBG結構中多數(shù)氨基酸殘基的波動程度明顯降低至低于0.2 nm，說明SA的結合增強了結構穩(wěn)定性。這也進一步證實SA能夠穩(wěn)定結合在RBG的C2位點。

圖6 結合穩(wěn)定性及相互作用分子機制Fig.6 Binding stability analysis and the interaction molecular mechanism

為深入揭示SA與RBG相互作用的分子機制，進一步將結合自由能分解到蛋白的每個氨基酸殘基。如圖6C所示，可以發(fā)現(xiàn)其中Ile131、Ile90、Gln261、Trp149、Tyr151和Tyr102 6個氨基酸殘基（<-2 kJ/mol）對兩者的結合自由能有重要貢獻，提示它們可能對于SA和RBG的結合穩(wěn)定性和親和力起著重要作用。SA與Trp149、Tyr151和Tyr102殘基的相互作用可能是實驗中導致RBG內(nèi)源熒光猝滅的重要原因。對MD最后一幀的結合構象分析（圖6D）可以發(fā)現(xiàn)，SA的苯環(huán)和甲氧基可以通過π-烷基相互作用與Ile131、Ile90、Trp149、Tyr151及Tyr102形成疏水相互作用；還可以通過范德華力與Gln261接觸。有研究顯示SA的苯環(huán)和甲氧基可以通過π-σ、π-烷基和氫鍵與靶點蛋白的關鍵氨基酸殘基相互作用，從而發(fā)生特異性結合[33]。前人研究表明酚酸分子結構中甲氧基的取代位置，如3位和5位，對提高其與蛋白的親和力強弱有重要影響[34]?？梢酝茰ySA的兩個甲氧基基團對其與RBG的結合具有重要作用。本文的結果能夠為后續(xù)探究酚酸與RBG相互作用的結構-親和力關系及其復合物的結構改造提供依據(jù)。

3 結論

本文通過熒光光譜結合同源模建、分子對接和分子動力學模擬研究了SA與RBG非共價相互作用及其動態(tài)過程，解析了SA與RBG最可能的結合位點及相互作用的分子機制。結果表明SA與RBG通過疏水相互作用以約1:1的比例自發(fā)形成復合物，其結合導致RBG微環(huán)境和構象的改變。分子模擬揭示了RBG上5個潛在的結合位點中，C2位點是最可能的結合位點，并進一步揭示了SA在RBG的C2位點親和力高的關鍵氨基酸殘基和結構基礎。本文深入探究了SA與RBG非共價結合的動態(tài)過程和相互作用的分子機制，為進一步研究酚酸類化合物與RBG非共價相互作用的構效關系提供了新思路，為其復合物作為功能性食品配料的應用開發(fā)提供了理論基礎。