王有為?楊陽?趙薇?陳媛瑋?李紅霞?張欣?雍剛

摘要：目的 檢測我院2019—2021年淋病奈瑟菌臨床分離菌株對大觀霉素、阿奇霉素及頭孢菌素類藥物的敏感性，為淋病的治療和防控提供參考。方法 收集并保存淋病奈瑟菌臨床分離株，瓊脂稀釋法和微量肉湯稀釋法測定大觀霉素、阿奇霉素、頭孢曲松和頭孢克肟的最小抑菌濃度（ MIC） ，分析比較菌株對各藥物的耐藥率或低敏率。結(jié)果 2019—2021年共分離收集淋病奈瑟菌菌株279株。其中未發(fā)現(xiàn)對大觀霉素的耐藥菌株；發(fā)現(xiàn)對阿奇霉素耐藥菌株31株，耐藥率分別為16.00%、8.82%和8.11%，平均耐藥率為11.11%；發(fā)現(xiàn)對頭孢曲松低敏菌株43株，低敏率分別為12.00%、14.71%和18.92%，平均低敏率為15.41%；發(fā)現(xiàn)對頭孢克肟低敏菌株27株，低敏率分別為4.00%、2.94%和18.92%，平均低敏率為9.68%。每年發(fā)現(xiàn)同時對頭孢曲松低敏和阿奇霉素耐藥的菌株數(shù)量均為2株，占比分別為2.00%、2.94%和1.80%，總體占比2.15%。結(jié)論 大觀霉素和頭孢曲松仍適合本地區(qū)作為治療淋病的一線藥物，需關(guān)注本地區(qū)淋病奈瑟菌對頭孢曲松低敏率的逐年增長趨勢。

關(guān)鍵詞：淋?。涣懿∧紊?；藥物敏感性檢測；微量稀釋法、最小抑菌濃度

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

The analysis of antimicrobial susceptibility test of Neisseria gonorrhoeae to spectinomycin， azithromycin and cephalosporins in one hospital of Chengdu， Sichuan Province from 2019 to 2021

Wang You-wei， Yang Yang， Zhao Wei， Chen Yuan-wei， Li Hong-xia， Zhang Xin， and Yong Gang

（Department of Laboratory Medicine， Sichuan Provincial Peoples Hospital，

University of Electronic Science and Technology of China， Chengdu 610031）

Abstract Objective To test the susceptibility of Neisseria gonorrhoeae clinical isolates to spectinomycin， azithromycin， and cephalosporins in our hospital from 2019 to 2021， and provide a reference for treatment， prevention， and control of gonorrhea. Methods Clinical isolates of Neisseria gonorrhoeae were collected and preserved， and the minimum inhibitory concentration （MIC） of spectinomycin， azithromycin， ceftriaxone， and cefixime were determined by the agar dilution method and the broth dilution method， and the drug resistance rate or low sensitivity rate of strains to each drug was analyzed. Results A total of 279 Neisseria gonorrhoeae strains were isolated and collected from 2019 to 2021. There was no spectinomycin-resistant strain. Thirty-one strains were found to be resistant to azithromycin， and the drug resistance rates were 16.00%， 8.82%， and 8.11% from 2019 to 2021， with an average azithromycin-resistance rate of 11.11%.? Forty-three strains were found to be hyposensitive to ceftriaxone， and the hyposensitivity rates were 12.00%， 14.71%， and 18.92% from 2019 to 2021， with an average hyposensitivity rate of 15.41%.? Twenty-seven strains were found to be hyposensitive to cefixime， and the hyposensitivity rates were 4.00%， 2.94%， and 18.92% from 2019 to 2021， and the average hyposensitivity rate was 9.68%.? Two ceftriaxone hypoallergenic and azithromycin resistant strains were found each year， accounting for 2.00%， 2.94%， and 1.80% from 2019 to 2021， and the overall ratio was 2.15%. Conclusion Spectinomycin and ceftriaxone are still suitable as first-line drugs for the treatment of gonorrhea in this region. It is necessary to pay attention to the increasing trend of low sensitivity rate of Neisseria gonorrhoeae to ceftriaxone with each passing year in this region.

Key words Gonorrhea; Neisseria gonorrhoeae; Antimicrobial susceptibility test; Microdilution method; Minimal inhibitory concentration

淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae， NG）簡稱淋球菌，是淋病的病原菌。關(guān)于淋病的治療，WHO和美國CDC的治療指南中推薦頭孢曲松（ceftriaxone， CRO）與阿奇霉素（azithromycin， AZM）的聯(lián)合方案，而在我國未將阿奇霉素推薦為治療淋病的一線藥物[1]。近年來，超級淋球菌菌株[2-3]、頭孢菌素耐藥型（FC428）淋球菌[3-4]，以及對頭孢曲松和阿奇霉素雙重高度低敏的淋球菌[5-6]的出現(xiàn)，給淋病的治療帶來更大的挑戰(zhàn)。淋球菌耐藥已成為全球嚴重的公共衛(wèi)生問題[7]。本文就2019—2021年四川省人民醫(yī)院皮膚病性病實驗室分離的淋球菌菌株進行大觀霉素（spectinomycin， SPE）、AZM以及CRO、頭孢克肟（cefixime， CFM）藥物敏感性檢測，對其檢測結(jié)果進行總結(jié)分析，為淋病的治療和防控提供依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株來源

檢測菌株來自2019—2021年四川省人民醫(yī)院淋病初診患者，由本院皮膚病性病實驗室分離培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)控菌株

為了每1批MIC檢測的質(zhì)量控制，檢測中參加中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心組織的淋球菌耐藥監(jiān)測室間質(zhì)量評價活動。2019年質(zhì)控菌株編號：19QA1、19QA2、19QA3；2020年質(zhì)控菌株編號：20QA1、20QA2、20QA3；2021年質(zhì)控菌株編號：21QA1、21QA2、21QA3

1.3 抗菌藥物

本研究選擇SPE、CRO、CFM和AZM等4種抗生素，藥粉由中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心參比實驗室提供。

1.4 主要儀器和試劑

VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、奈瑟菌、嗜血桿菌鑒定卡（NH卡）均用于臨床分離初步鑒定菌株的鑒定；GC基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血紅蛋白粉、生長添加劑等均購自英國Oxoid公司，用于T-M選擇性培養(yǎng)基和瓊脂稀釋法藥敏培養(yǎng)基的配制；淋球菌藥物MIC測試板及其配套稀釋液、MH肉湯等，購自珠海金標醫(yī)學檢驗技術(shù)有限公司（批號：20211124），分別含SPE（藥物濃度128～0.06 mg/L）、CRO（藥物濃度1～0.0005 mg/L）、AZM（藥物濃度8 ～0.004 mg/L）及CFM（藥物濃度1～0.0005 mg/L）梯度濃度微孔各12孔，用于微量稀釋法藥物MIC測定。

2 方法

2.1 菌株的分離培養(yǎng)和保存

采集疑似淋病患者生殖道等部位分泌物樣本，采用T-M淋球菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h，得到菌株經(jīng)革蘭染色、氧化酶試驗初步鑒定。當氧化酶陽性、革蘭染色鏡檢為陰性雙球菌時，增菌后采用奈瑟菌、嗜血桿菌鑒定卡（NH卡）在全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。確認后菌株洗脫于30%甘油牛肉浸液保存液中，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 抗生素液的配制

SPE：稱取38.554 mg藥粉（純度：66.4%），溶劑為2 mL注射用純水，配制成12800 μg/mL原液。將原液倍比稀釋呈濃度為6400～400 μg/mL 5個濃度的工作液。

CRO：稱取2.160 mg藥粉（純度：92.6%），溶劑為1 mL注射用純水，配制成2000 μg/mL原液。將原液10倍稀釋為200 μg/mL，再倍比稀釋得到50～0.8 μg/mL等7個濃度的工作液。

AZM：稱取1.691 mg藥粉（純度：94.6%），溶劑為2 mL無水乙醇，配制成800 μg/mL原液。將原液倍比稀釋為400～3.125 μg/mL等8個濃度的工作液。

CFM：稱取2.024 mg藥粉（純度：98.8%），溶劑為1 mL 0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液，配制成2000 μg/mL原液。將原液20倍稀釋至100 μg/mL，再倍比稀釋得到50～0.8 μg/mL等7個濃度的工作液。

淋球菌藥物MIC測試板已含有梯度濃度的藥物，直接使用。

2.3 藥敏培養(yǎng)基的配制

在培養(yǎng)皿外底部做好抗生素名及濃度標記，分別吸取抗生素工作液150 μL加入到對應(yīng)培養(yǎng)皿中，再傾注經(jīng)高壓滅菌冷卻至50℃左右的150 mL GC瓊脂培養(yǎng)基，混勻，備用。

2.4 菌懸液的配制

凍存細菌采用T-M培養(yǎng)基，在（36℃±1℃）、5%CO2條件下培養(yǎng)時間18～24 h，經(jīng)過復蘇、純化、增菌等過程，得到細菌經(jīng)NH卡鑒定后方可使用。將新鮮菌苔洗于預(yù)溫0.9%生理鹽水或MIC測試板配套稀釋液中，調(diào)整菌液濁度為0.5 CFU/mL，備用。

2.5 最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）測定及敏感性判定標準

2019—2020年采用WHO淋球菌耐藥監(jiān)測規(guī)劃推薦的瓊脂稀釋法測定MIC[8]。2021年采用微量稀釋法測定MIC，測定方法參照淋球菌MIC測試板試劑盒說明書。參照WHO西太平洋地區(qū)（簡稱西太區(qū)）淋球菌耐藥性監(jiān)測項目判定標準：大觀霉素：Susceptible（S）≤64 mg/L；Resistant （R）≥128 mg/L；阿奇霉素：S≤0.05? mg/L；R≥1 mg/L；頭孢曲松：S＜0.125 mg/L；Decreased Susceptible （DS）≥0.125 mg/L。頭孢克肟：S＜0.25 mg/L；DS≥0.25 mg/L。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS statistics23統(tǒng)計軟件，定量資料比較使用t檢驗。P<0.05表示具有統(tǒng)計學差異。耐藥率、低敏率等使用百分比表述。

3 結(jié)果

3.1 一般資料

2019—2021年共檢測淋球菌279株。其中254株來源于男性尿道分泌物、1株來源于男性眼部分泌物、23株來源于女性宮頸管分泌物、1株來源于2歲女童外陰分泌物。感染者中男女性別比例10.625：1，年齡最大71歲、最小2歲，平均年齡33.21±11.851歲。男性和女性感染者平均年齡無顯著性差異（t=1.973、P=0.050）。男性患者中有22例有同性性行為，占所有男性感染者的8.66%。主訴感染地點主要在本?。?8.2%，273/279），有62例患者在一個月內(nèi)使用過抗菌藥物。

3.2 MIC結(jié)果

279株淋球菌中未發(fā)現(xiàn)對大觀霉素耐藥的菌株；發(fā)現(xiàn)頭孢曲松低敏株43株、頭孢克肟低敏株27株；發(fā)現(xiàn)對阿奇霉素耐藥株31株。2019—2021年279株淋球菌對各監(jiān)測藥物MIC結(jié)果分布見表1。淋球菌對各監(jiān)測藥物敏感性及MIC50見表2。

3.3 對頭孢曲松低敏/阿奇霉素耐藥情況

2019—2021年，同時對頭孢曲松低敏（MIC≥0.125 mg/L）和阿奇霉素耐藥（MIC≥1 mg/L）的菌株數(shù)量均為2株，占比分別為2.00%（2/100）、2.94%（2/68）和1.80%（2/111）。淋球菌對頭孢曲松低敏率、對阿奇霉素的耐藥率以及同時對頭孢曲松低敏和對阿奇霉素耐藥的比例趨勢變化見圖1。

4 討論

本研究在2021年的藥物敏感性檢測中，使用了微量肉湯稀釋法，出現(xiàn)了方法上的不統(tǒng)一，是本文的缺點。2019—2021年，每年參加中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心組織的淋球菌耐藥監(jiān)測質(zhì)量控制計劃，結(jié)果均滿意。

近年來淋球菌對頭孢曲松等頭孢菌素類藥物低敏率和對阿奇霉素耐藥性的不斷增加，尤其分離到對阿奇霉素高度耐藥同時對頭孢曲松低敏菌株[9]，或同時對頭孢曲松和阿奇霉素高度低敏的菌株[5]，讓我們認識到淋球菌全球范圍內(nèi)的耐藥現(xiàn)象不容小覷。

本研究顯示，2020年和2021年，本院分離淋球菌對阿奇霉素的敏感性基本一致，耐藥率分別為8.82%和8.11%，3年總體耐藥率為11.11%，低于潘露等[10]報道的浙江地區(qū)2016年的20.48%，和廣州地區(qū)2018年的16.15%[11]。與廣西北海地區(qū)2015—2019年[12]、浙江部分地區(qū)2013—2018年[13]耐藥率逐漸增加的情況相反，與趙靜[15]介紹的從2014—2018年逐年降低類似，本院2019—2021年分離淋球菌對阿奇霉素的耐藥率從2019年的16.0%[14]呈逐年降低趨勢。據(jù)不完全統(tǒng)計，2021年就診患者中，22例患者在一個月內(nèi)有服用以左氧氟沙星、頭孢菌素類藥物等為主的抗生素，沒有1例使用過阿奇霉素。本院淋球菌對阿奇霉素耐藥率的降低是否與本地區(qū)醫(yī)生的習慣性用藥[16]以及患者對于抗生素的可獲得性等因素有關(guān)應(yīng)做進一步的研究。

本院分離獲得的淋球菌對頭孢曲松低敏率在2019、2020和2021年分別為12.00%（12/100）、14.71%（10/68）和18.92%（21/111），低敏菌株的流行與我國臺灣地區(qū)[17]報告的趨勢一致，總低敏率為15.4%，低于浙江部分地區(qū)2018年報道的18.58%[13]、較江蘇地區(qū)2017—2018年的7.64%[18]高。2021年111株淋球菌對頭孢克肟敏感性顯著性降至81.98%，有12株菌的MIC≥1 mg/L，且均為頭孢曲松低敏菌株，與黎小東等[19]報道的敏感率81%相似。

本院分離獲得的淋球菌對阿奇霉素的耐藥率呈下降趨勢，且在2020—2021年間相對穩(wěn)定，對頭孢菌素類藥物低敏率呈上升趨勢，且對頭孢克肟的敏感性降低，兩者趨勢呈現(xiàn)剪刀叉形態(tài)。對頭孢菌素類藥物低敏和對阿奇霉素耐藥的菌株數(shù)量和比率沒有明顯變化。這種趨勢與在美國2014—2018年間頭孢克肟耐藥率下降、阿奇霉素耐藥率上升；在歐洲2014—2018年間頭孢克肟、阿奇霉素耐藥率都上升；在澳大利亞和加拿大，頭孢曲松低敏/耐藥率下降與阿奇霉素耐藥率呈上升[20]的趨勢均不同，與我國廣州市2013—2018年阿奇霉素耐藥上升的趨勢[21]也相反。從部分患者自行服用左氧氟沙星等現(xiàn)象來看，筆者認為：出現(xiàn)上述趨勢，與當?shù)氐慕?jīng)濟水平、就醫(yī)行為、臨床認知和宣傳教育等相關(guān)。應(yīng)加大淋病防治的宣傳教育，促進患者及時、規(guī)范就醫(yī)；加大淋球菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)的臨床應(yīng)用，指引和提升臨床用藥的科學性和準確性；提升全社會對抗生素耐藥會帶來的感染風險、醫(yī)療成本和社會防治成本增加[22]的認識，促進抗生素合理運用。

我國治療淋病的推薦方案是頭孢曲松或大觀霉素作為一線藥物單次給藥[1]。本研究顯示大觀霉素和頭孢曲松適合本地區(qū)作為治療淋病的一線藥物，但隨著頭孢菌素類藥物低敏率的增加，應(yīng)加大淋球菌對抗生素敏感性檢測和監(jiān)測力度，開展淋球菌耐藥機制研究和新藥開發(fā)、老藥新用探索，實施全社會多維度的淋病防治策略[23]。

參 考 文 獻

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