李敏　許友強　劉靜　賈全勝

【摘要】? 為確保聚合酶鏈反應（PCR）實驗結果數(shù)據(jù)的真實性、準確性，也為保證實驗人員的安全性，制定嚴格的實驗室核酸污染防控策略尤為重要。本文以第三方檢測機構新冠核酸PCR實驗室大量核酸檢測實驗的經驗總結為例，闡述第三方核酸實驗室依靠嚴格的實驗室功能分區(qū)，完備的實驗室配套設施，合格的實驗操作人員和嚴謹、科學的質量管理體系，并對污染進行定期監(jiān)控和評估，在很大程度上能夠控制、避免和減少核酸污染。

【關鍵詞】? 第三方核酸檢測實驗室；核酸污染；預防；控制

中圖分類號：R115? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：1672-1721（2023）01-0087-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.01.029

2019年底至今，席卷全球的新型冠狀病毒肺炎疫情，讓第三方醫(yī)學檢測機構成為戰(zhàn)疫中新冠病毒核酸檢測的“主力軍”，金域醫(yī)學作為全國最大的第三方檢測機構，2020年累計新冠核酸檢測量超過3 200萬人份，約占同期全國總體核酸檢測量1/10。這龐大的檢測數(shù)據(jù)意味著疫情之下，當面臨大量核酸檢測需求時，第三方醫(yī)學實驗室切實發(fā)揮了重要作用。

目前我國二級以上綜合醫(yī)院都具備核酸檢測能力，也都相應設立了聚合酶鏈反應（PCR）實驗室，高強度的核酸檢測任務已然成為了醫(yī)檢人員的工作常態(tài)。而一旦出現(xiàn)實驗室污染，可能會造成假陽性結果，導致檢測結果不可信，甚至會危及實驗室工作人員安全，應對核酸檢測實驗室污染的最好方法就是防范于未然。新疆金域PCR實驗室運行至2021年9月，已完成將近189萬人次的核酸樣本檢測，作為新冠病毒核酸定點檢測機構，在監(jiān)控和解決核酸污染方面積累了大量的實踐經驗。本文探討分析了核酸檢測實驗室如何避免和減少核酸污染的產生以及污染處理策略，以供參考。

1? ? 核酸污染防控基本要求

1.1? ? 嚴格的實驗室功能分區(qū)? ? 通過在實驗室設計建造、使用個體防護設施、嚴格遵從標準化工作及操作程序和規(guī)程等方面采取綜合措施，確保實驗室工作人員及周圍環(huán)境不受實驗對象的污染。按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》[1] （衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）規(guī)定，PCR實驗室必須進行分區(qū)，每個步驟都在相應的實驗區(qū)進行，原則上應設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增和產物分析區(qū)，每個區(qū)設置專一標識，流轉順序為試劑準備區(qū) → 核酸提取區(qū) → 擴增區(qū) → 產物分析區(qū)。根據(jù)使用儀器的功能，部分區(qū)域可適當合并，各區(qū)域在物理空間上應當是完全獨立的。傳遞窗滿足密封性要求，不能有空氣直接相通。 試劑、樣本等在各區(qū)之間以相應傳遞窗單向傳遞 ，嚴禁人員、器材和試劑倒流。各區(qū)均設有緩沖間，工作服和清潔消毒物品不得跨區(qū)混用。

各項檢測工作應嚴格按相應規(guī)定在各自的區(qū)域內進行，嚴禁在樣本制備區(qū)配制試劑?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案》（試行第八版）中明確提出：“在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經氣溶膠傳播的可能”[2]?？梢姡瑢嶒炄藛T在進行新冠核酸檢測過程中，若防護不當，不慎接觸新冠氣溶膠病毒也易感染新冠肺炎。核酸檢測實驗室的人、物及空氣流向都須嚴格按照試劑儲存和準備區(qū)→樣本制備區(qū)→擴增和產物分析區(qū)方向，空氣壓力遞減的方式進行，防止擴增產物隨人流、物流及空氣流進入擴增前的區(qū)域，避免交叉污染。

1.2? ? 完備的實驗室配套設施? ? 核酸檢測中，PCR實驗室所需的設備配置對檢測結果的可靠性、準確性和安全性起到至關重要的作用，因此，越來越得到重視。由于PCR實驗室所使用的檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測出的病毒，并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優(yōu)點，因此廣泛應用于醫(yī)院的臨床診斷。完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據(jù)各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器。試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、分析區(qū)儀器設備必須滿足正常實驗開展所需，在確保檢測實驗順利完成的前提下，盡量實現(xiàn)高自動化、高檢測通量、高信息化。工作區(qū)域儀器設備參考配置標準如下：

1.2.1? ? 試劑儲存和準備區(qū)：2～8 ℃和-15 ℃冰箱、混勻器、微量加樣器（覆蓋1～1 000μl）、移動紫外燈、消耗品（一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管、加樣器吸頭）、專用工作服和工作鞋、專用辦公用品等。

1.2.2? ? 標本制備區(qū)：2～8 ℃冰箱、-20 ℃或- 80℃冰箱、高速合式冷凍離心機、混勻器、水浴箱或加熱模塊、微量加樣器（覆蓋1～1 000μl）、紫外燈、超凈工作臺、清耗品（一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭），如需處理大分子DNA，應備有超聲波水浴儀。

1.2.3? ? 擴增反應混合物和擴增區(qū)：核酸擴增儀、微量加樣器（覆蓋1～1 000μL）、紫外燈（近工作臺面）、消耗品（一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭）、專用工作服和工作鞋、專用辦公用品等。

1.2.4? ? 擴增產物分析區(qū)：視檢驗方法不同而定，基本儀器設備如下：微量加樣器（覆蓋1～1 000μl）、紫外燈（近工作臺面）、消耗品（一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭）、專用工作服和工作鞋、專用辦公用品等。

1.3? ? 合格的實驗操作人員? ? WHO《實驗室生物安全手冊》第四版，將實驗室生物安全防護要求分為“核心要求”“加強要求”“最高要求”，主要是基于生物因子和人員能力的評估而確定，實驗室的建設、運行、監(jiān)管和評價需要高水平的專業(yè)人員、監(jiān)管人員和評審人員。

通常情況下，PCR實驗室工作人員應為醫(yī)學檢驗專業(yè)或醫(yī)學相關專業(yè)畢業(yè)，具備大專以上學歷。技術人員必須是受過專業(yè)教育的技術人員，在獨立承擔檢測任務前須在中高級實驗技術人員指導下進行上崗培訓，達到合格標準方可開始工作。根據(jù)《醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》第十四條規(guī)定：“醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室人員應當經省級以上衛(wèi)生行政部門指定機構技術培訓合格后，方可從事臨床基因擴增檢驗工作”[1] ，所有核酸檢測人員需持PCR上崗證上崗，必須進行崗前培訓（包括實驗技能培訓和生物安全培訓）并經考核合格后方可進行檢測工作，檢測過程全程嚴格按照實驗室標準操作規(guī)程（SOP）進行操作；實驗室工作人員必須嚴格執(zhí)行《核酸實驗室設置與管理規(guī)范》的管理，遵守實驗室的所有制度、規(guī)定和操作規(guī)程；實驗室工作人員必須被告知實驗室工作的潛在危險并接受實驗室安全教育，自愿從事實驗室工作。對于新進入本室的人員，如尚未取得PCR技術培訓合格證，應在實驗室有培訓合格證的上級技術人員指導下進行實驗工作，實驗報告由有資格人員出具，并應在最短的時間內取得上崗培訓合格證。此外，PCR實驗室根據(jù)工作需要配備足夠的工作人員，視工作量的增加和業(yè)務發(fā)展需要，適當增加工作人員。

1.4? ? 嚴謹、科學的質量管理體系? ? 根據(jù)實驗室的具體情況編寫質量體系文件《質量手冊》《程序文件》《作業(yè)指導書》，并保證管理體系有效運行。管理體系的特點應有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效的機制、能自我發(fā)展的整體。依據(jù)《實驗室生物安全通用要求》《病原微生物實驗室生物安全管理條例》《生物安全實驗室建設技術規(guī)范》等文件建立完備的實驗室生物安全管理體系。為保證實驗室檢測工作的生物安全性，實驗室應將政策、制度、計劃、程序和指導書制訂成文件，并傳達到全體實驗室人員。生物安全管理體系應始終貫穿于實驗室活動的整個過程，從采樣開始到所有潛在危險材料被處理。

實驗室人員嚴格執(zhí)行《核酸實驗室設置與管理規(guī)范》的管理，盡量減少在實驗區(qū)內不必要的走動以減少交叉污染的可能性；核酸實驗室廢棄物嚴格按照《醫(yī)療廢物管理程序》執(zhí)行，廢液不能直接在實驗室中傾倒；擴增產物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護[3]。

2? ? 污染的類型和處理方式

PCR反應雖然具有較強的擴增能力和極高的靈敏度等優(yōu)點，但也存在極易污染的棘手問題，極其微量的污染都可能造成假陽性結果。如果形成氣溶膠污染擴散，則可導致整個PCR實驗室污染，處理起來非常棘手，嚴重時甚至要關閉實驗室。核酸實驗室具備超強的擴增能力、高檢測靈敏度，因而極其微量的污染都會導致假陽性結果出現(xiàn)，所以防污染策略的實施尤為重要。實驗室日常管理一定要做好清潔消毒工作，不能因為工作熟練就松懈下來，每日PCR實驗前和實驗后一定要按要求對實驗室進行徹底的清潔消毒，避免造成二次污染，甚至更嚴重的人員健康或其他經濟損失。一旦出現(xiàn)污染情況要盡快處理，核酸實驗室常見的污染有：樣本之間的交叉污染、試劑污染、擴增產物污染、克隆質粒污染，以及半開放核酸提取儀提取過程造成的交叉污染等，各類型污染均會給實驗室?guī)砑訇栃越Y果的風險。

2.1? ? 針對試劑污染，可分為：移液器污染，配制容器污染，其他溶液污染，陰陽性對照和標準品混放導致的污染等。可以采取以下防范措施：配備專用移液器用于配制試劑，不得與加質控品、樣本的移液器混用；配制試劑用的容器、EP管等務必為無菌管、不含RNA降解酶等；配制人員做好二級防護，避免體液毛發(fā)等污染試劑；配制試劑一定要遵守現(xiàn)配現(xiàn)用原則，以及配好的試劑密封。

2.2? ? 針對樣本污染，可分為：樣本之間的交叉污染，氣溶膠污染，陽性質控污染，提取好的模板之間的交叉污染等。根據(jù)以上情形可以采取以下防范措施：操作時，要勤更換一次性手套，防止在加液和移液時發(fā)生滴液、漏液，進而污染工作臺面和其他樣本；開樣本管蓋時小心操作、開EP管蓋前稍離心收集液體于管底；在加入模板時，按照“陰性對照-待測樣品-陽性對照”的加樣順序。

2.3? ? 針對核酸氣溶膠污染，可分為：陽性樣本、陽性質控或標準品氣溶膠和擴增產物氣溶膠兩種情況，一般常發(fā)生在EP管爆蓋時、劇烈震蕩時、高速離心時、移液器反復吹打時?？梢圆扇∫韵麓胧簩嶒炇噎h(huán)境以及重污染區(qū)進行封閉，同時對區(qū)域內被氣溶膠污染的相關設備、耗材等，用布或紙巾覆蓋并由外圍向中心傾倒0.5%的次氯酸消毒劑，約30 min后，清除污染物品，再用0.2%次氯酸消毒劑擦拭，然后用75%酒精進行噴灑，最后開啟固定紫外燈、使用移動紫外車定點照射1 h，照射結束后有條件的應開窗通風（通風前做好其他未污染區(qū)域的防范）。在進行去污消殺的同時，需做好環(huán)境、物表和操作人員手表核酸監(jiān)測與評估，上述去污措施可反復多次進行，通過核酸監(jiān)測發(fā)現(xiàn)去污措施無效時，應更換實驗場地或者使用不同引物的擴增試劑。核酸氣溶膠污染不是瞬間產生的，而是一個累積的過程，在日常實驗過程中嚴格按照相關要求進行清潔消毒，遵守實驗室各區(qū)獨立、物品嚴格分區(qū)、人流和氣流單一流向原則，在很大程度上可規(guī)避核酸氣溶膠污染[4]。

進行PCR檢測實驗操作時，操作人員必須嚴格遵守操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR檢測過程中污染。實驗室一旦發(fā)生污染，檢測工作應立即停止，污染的實驗結果必須作廢，直到確認污染消除后才能重新開始檢測。首先，要查找污染源和明確污染范圍，根據(jù)污染源和污染范圍采取最有效的去污染措施，結合各種不同方法以達到最佳效果。規(guī)范的實驗操作包括：實驗應在超凈工作臺進行，工作臺內應放置PCR專用微量離心機、各量程移液器和其他必需物品；實驗過程中選擇最合適尺寸的手套并及時更換，在進出不同實驗區(qū)域時都應更換實驗服、口罩及手套，以避免不同實驗區(qū)交叉污染；裝有PCR試劑的反應管在打開之前應先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風險；謹慎開啟反應管，防止管內液體濺出或形成氣溶膠導致污染；吸加試劑和模板的操作遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產生的交叉污染。PCR試劑建議小量分裝，以減少反復凍融、重復取樣次數(shù)；多樣本PCR反應時，先配制反應混合液分裝至反應管中，最后加入樣本核酸，且勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作；實驗試劑應與樣品和PCR產物分開保存，不應放于同處；PCR擴增實驗完成后及時將反應管取出，用一次性手套將產物反應管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。

3? ? 污染的定期監(jiān)控和評估

2021年3月，西安某新冠肺炎定點醫(yī)院一位負責隔離病區(qū)患者核酸檢驗的工作人員被診斷為確診病例。除了一線醫(yī)務人員，身為第三方醫(yī)檢機構的核酸檢測人員，長期暴露在高危的病毒檢測環(huán)境中，所承受的壓力和風險也是常人無法想象的。

一個合格的PCR實驗室要時刻注意污染的監(jiān)測，以防遇到任何污染，在第一時間能夠及時采取有效解決措施。為保證實驗室工作人員不受實驗對象的感染，周圍環(huán)境不受實驗對象的污染，做好核酸實驗室核酸污染的定期監(jiān)控工作很有必要，常規(guī)定期監(jiān)控要求做到：每天進行實驗室空氣采樣監(jiān)測，定期對實驗室臺面、門把手、儀器設備表面等進行取樣監(jiān)測；每次檢測過程采用至少3個陰性對照隨機置放參與提取全過程；針對陽性樣本，實驗室應當建立嚴格的可疑樣本和陽性樣本復檢流程，選用另外1～2種靈敏度更高且擴增不同區(qū)域的檢測試劑對原始樣本進行復查檢測。安排實驗人員記錄陽性率及假陽性的發(fā)生頻率，針對檢測過程中發(fā)現(xiàn)陽性率異常升高、陰性對照頻繁出現(xiàn)假陽性、未知擴增條帶重復出現(xiàn)等問題，很可能發(fā)生了核酸氣溶膠污染，應立即進行污染源的排除和清理。

除了日常的防污染監(jiān)控，還應對所在實驗室的風險因子進行定期評估，并制定避免危險生物因子造成實驗室人員暴露，防止向實驗室擴散并導致危害的相應預防措施。WHO第四版手冊[5]對實驗室的生物安全防護要求主要是基于生物因子和人員能力的評估而確定，以確保實驗室工作人員不受實驗對象的感染，周圍環(huán)境不受實驗對象的污染。

本醫(yī)學檢驗所作為在當?shù)匦l(wèi)健委備案的獨立法人第三方檢驗檢測機構，為社會及政府提供各類優(yōu)質的醫(yī)學檢測服務、公證的數(shù)據(jù)，并出具具有法律效力的檢測報告。檢驗所檢測水平的高低直接影響到企業(yè)的聲譽，PCR檢測作為目前新冠病毒流行大背景下日常檢測的重點項目，更應該保證其檢測結果的真實性和準確性。因此，檢測過程中必須嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程，提高防止交叉污染的意識，降低出現(xiàn)假陽性結果的風險，做好實驗室日常清潔消毒和環(huán)境監(jiān)測工作，保證實驗檢測及相關人員的生物安全性。

參考文獻

[1]? ? 醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號）[S].國家衛(wèi)生部辦公廳，2010.

[2]? ? 新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）（國衛(wèi)辦醫(yī)函〔2020〕680號）[S].國家衛(wèi)健委，2020.

[3]? ? 曾勁峰.核酸實驗室污染原因分析及污染控制對策[EB/OL].https：//wenku.baidu.com/view/351a46eaff4733687e21af45b307e87101f6f8fa.html

[4]? ? 醫(yī)療機構新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊（試行第二版）（聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療發(fā)〔2020〕271號）[S].國務院應對新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機制醫(yī)療救治組，2020.

[5]? ? 張彥國.WHO《實驗室生物安全手冊》（第4版草案）簡介[J].暖通空調，2020，50（6）：81-85.

（收稿日期：2022-10-18）