韓 冰 趙卓華 申玉霞 張 言 徐 妍 張 媛 （陜西師范大學生命科學學院，西安 710119）

近年大氣污染對人群健康的影響已成為全球重要公共衛(wèi)生問題。大氣污染物中的可吸入式懸浮細顆粒物是影響空氣質(zhì)量的關(guān)鍵指標，也是大氣污染影響健康的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［1］。不斷增多的流行病學證據(jù)表明，暴露于大氣中的PM2.5 會加重糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）、類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatic arthritis，RA）和多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）等自身免疫?。?-3］。PM2.5 暴露會誘導機體炎癥因子失衡，引起炎癥反應［4-5］。本團隊前期通過遺傳、細胞和藥理學等手段建立了長期PM2.5 暴露通過TLR-4/NF-κB 信號通路誘導小膠質(zhì)細胞活化加劇神經(jīng)炎癥和髓鞘損傷的“PM2.5 暴露-細胞效應-健康危害”全鏈條證據(jù)［6］。但隨著研究的深入，課題組發(fā)現(xiàn)PM2.5 的致病作用與其暴露時間窗、質(zhì)量濃度、粒徑、化學組分密切相關(guān)，具有異質(zhì)性，其致病機制的普適性和特殊性有待長期觀察和系統(tǒng)評估。O'DRISCOLL 等［7］報道低劑量PM 暴露以依賴芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AHR）的方式抑制病理性T細胞反應，從而減輕神經(jīng)炎癥發(fā)作，也證實了PM2.5 生理作用的復雜性。在研究PM2.5 與自身免疫病相關(guān)性的前期工作中，課題組發(fā)現(xiàn)了一個現(xiàn)象：與持續(xù)PM2.5暴露顯著加劇成年小鼠EAE 病理作用相反，短期PM2.5 暴露可有效延遲小鼠神經(jīng)炎癥發(fā)生和發(fā)展，顯著降低了臨床評分累積和峰值，推測可能與PM2.5 誘發(fā)機體免疫耐受相關(guān)，但這一“時間窗”效應的作用機制尚不清楚，無法進行針對性藥物干預。

本研究旨在探究短期PM2.5 暴露對小鼠EAE的影響，并探討其潛在作用機制，以期為預防和解決空氣污染造成的健康效應提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF級6～8周齡雌性C57BL/6品系小鼠購自陜西師范大學實驗動物中心，在標準條件下飼養(yǎng)，溫度（23±2） ℃，所有實驗程序和方案均經(jīng)陜西師范大學動物實驗倫理委員會批準（倫理批號：202312013），并按照批準的機構(gòu)指南和法規(guī)進行。MOG35-55多肽（Genescript，Piscataway）；百日咳毒素（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）；SRM1648A（Sigma）；O.C.T.包埋劑（Tissue-Tek， Sakura Finetek）；Fluoromyelin（Abcam，Cambridge）；CD45、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD80、CD86、IL-17、IFN-γ 和Foxp3 抗體（BD Biosciences，San Jose，CA）。

1.2 方法

1.2.1 EAE 模型制備 PBS 溶解MOG35-55多肽，與等體積完全弗氏佐劑（含5 mg/ml 結(jié)核分枝桿菌）混合，玻璃注射器推打至油包水狀的白色抗原乳劑。在小鼠背部兩個位點皮下注射免疫，免疫當天和2 d后分別腹腔注射百日咳稀釋液（200 ng/只）。免疫完成后每天對小鼠進行EAE 評分，測量體質(zhì)量變化并記錄。

1.2.2 PM2.5 的來源及制備 大氣污染物組成復雜，單一成分暴露不能較好地模擬多種污染物共存的實際大氣污染環(huán)境對人群健康的影響，因此本研究選擇大氣細顆粒物混合物進行各項實驗。但由于PM2.5 的毒性與其來源和組成密切相關(guān)，為保證實驗的代表性和重復性，本研究選擇NIST標準品庫來源的商品化城市大氣微顆粒物SRM1648A進行實驗。該標準參考物主要成分（多環(huán)芳烴、多氯聯(lián)苯同類物、氯化農(nóng)藥和大氣顆粒物質(zhì)等）已由NIST 標準品庫提供了定性定量分析報告。在無菌PBS中超聲處理15 min，制備SRM1648A分散混懸液。

1.2.3 實驗分組和給藥 PM2.5 暴露組：造模前3 d至造模后2 d，每天接受1次PM2.5［5 mg/（kg·d）］鼻咽吸入。PBS 組：同周齡小鼠接受相同時間PBS鼻咽吸入。

1.2.4 組織染色及病理評估 取造模第30 天小鼠，心臟灌注固定，取脊髓腰骶膨脹，室溫下立即用4%多聚甲醛固定24 h。其他組織用30%蔗糖溶液4 ℃脫水48 h 后用O.C.T.包埋劑包埋制作冰凍切片，使用Fluoromyelin 進行免疫熒光組織化學染色，髓鞘密度定量：手動選擇總白質(zhì)區(qū)域，Image-Pro Plus 軟件計算脫髓鞘面積（%）。HE 染色評估炎癥，LFB染色評估脫髓鞘。雙盲法對切片進行炎癥評估和評分：0 分，無炎癥細胞浸潤；1 分，脊髓實質(zhì)輕度炎癥細胞浸潤；2分，脊髓實質(zhì)中度炎癥細胞浸潤；3分，脊髓實質(zhì)重度炎癥細胞浸潤。髓鞘脫失評分：0 分，無髓鞘脫失；1分，1～3個髓鞘脫失；2分，大范圍髓鞘脫失；3分，大范圍髓鞘脫失且累及20%白質(zhì)區(qū)域。

1.2.5 流式細胞術(shù) 分離小鼠脾細胞和CNS 單個核細胞（mononuclear cell，MNC），將細胞與CD45、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD80 和CD86 抗體在冰上孵育30 min，進行表面標記染色。表面染色、固定、透化，IL-17、IFN-γ 或Foxp3 抗體進行細胞內(nèi)染色，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為±s，通過方差分析（ANOVA）和t檢驗分析數(shù)據(jù)。所有統(tǒng)計分析均以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5 短期暴露顯著延遲EAE 發(fā)生發(fā)展 與PBS 對照組相比，PM2.5 短期暴露可延緩EAE 發(fā)生并顯著降低疾病嚴重程度（P＜0.01，圖1A、B），但兩組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1C）。HE染色及LFB染色結(jié)果顯示，PM2.5短期暴露組小鼠炎癥細胞浸潤和脫髓鞘程度顯著低于PBS對照組（P＜0.05）。Fluoromyelin 免疫染色結(jié)果顯示，PM2.5短期暴露組EAE 小鼠胼胝體脫髓鞘面積明顯低于PBS 對照組（P＜0.001，圖1D、E）。提示短期PM2.5暴露顯著抑制炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失，PM2.5 短期暴露可能通過抑制CNS 炎癥減少脫髓鞘損傷，進而抑制EAE發(fā)展。

圖1 PM2.5短期暴露顯著延遲EAE發(fā)生發(fā)展Fig.1 Short-term exposure to PM2.5 significantly delays onset and development of EAE

2.2 PM2.5 短期暴露抑制EAE 小鼠CNS 炎癥 與對照組相比，PM2.5 短期暴露小鼠CNS 中CD45+白細胞、激活的巨噬細胞（CD11b+TNF-α+）（P＜0.01）和活化的樹突狀細胞（CD11c+CD80+和CD11c+CD86+）（P＜0.001）比例和數(shù)量明顯降低（圖2），CD4+Foxp3+（P＜0.001）Treg和具有致病性的CD4+IL-17+（P＜0.001）Th17 細胞被顯著抑制，致病性的CD4+IFN-γ+（P＞0.05）Th1 比例也有所下降（圖3），提示短期PM2.5暴露通過減少CNS 炎癥細胞數(shù)量從而抑制神經(jīng)炎癥緩解疾病發(fā)展。

圖2 PM2.5短期暴露抑制EAE小鼠CNS炎癥Fig.2 Short-term exposure to PM2.5 suppresses CNS inflammation in EAE mice

圖3 PM2.5短期暴露抑制致病性Th17細胞Fig.3 Short-term exposure to PM2.5 inhibits pathogenic Th17 cells

2.3PM2.5 短期暴露抑制EAE 小鼠外周炎癥 免疫后第30天收集EAE小鼠脾細胞，流式細胞術(shù)評價PM2.5 短期暴露對小鼠外周炎癥細胞的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，PM2.5 短期暴露組小鼠脾臟CD4+T 細胞（P＞0.05）和Th1（CD4+IFN-γ+）細胞（P＞0.05）比例差異無統(tǒng)計學意義，Th17（CD4+IL-17+）細胞比例（P＜0.000 1）顯著降低（圖4），表明短期PM2.5暴露抑制EAE小鼠外周炎癥反應。

圖4 PM2.5短期暴露抑制EAE小鼠外周炎癥Fig.4 Short-term exposure to PM2.5 suppresses peripheral inflammation in EAE mice

3 討論

隨著工業(yè)化進程飛速發(fā)展，全球環(huán)境污染日趨嚴重，自身免疫性疾病發(fā)病率顯著上升，城市空氣中懸浮的大量高濃度微顆粒物是霧霾致病的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［8］。多項流行病學研究共同指出空氣污染程度與MS 復發(fā)和惡化顯著相關(guān)［9-10］，但PM2.5 對疾病發(fā)生作用的復雜性和異質(zhì)性有待深入研究。PM2.5 暴露與自身免疫病相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)：與高濃度持續(xù)PM2.5 暴露顯著加劇成年小鼠神經(jīng)炎癥的病理作用相反，短期PM2.5 暴露可有效延遲小鼠神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展，顯著降低了臨床評分累積和峰值。與PBS 對照組相比，接受短期鼻腔滴注PM2.5的小鼠CNS 中炎癥細胞浸潤及脫髓鞘病灶顯著減少，致病性Th1 及Th17 細胞分化和促炎細胞生成被抑制，耐受性Treg 募集增加，提示短期PM2.5 暴露可能誘發(fā)機體免疫耐受。研究報道感染性病原體可通過機體免疫耐受抑制過敏和自身免疫性疾?。?1-12］。滅活病毒疫苗就是采用少量滅活的完整而無致病性的病毒顆粒引起生物系統(tǒng)免疫，從而產(chǎn)生免疫記憶預防相關(guān)疾病。食物中少量病原體微生物可誘發(fā)人體免疫應答而不致病，反而增強人體免疫力。研究表明細菌內(nèi)毒素LPS 可通過結(jié)合TLR4激活下游核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 等信號傳導途徑，導致一系列促炎細胞因子表達升高，出現(xiàn)炎癥損傷［13］；而ELLESTAD 等［14］發(fā)現(xiàn)幼鼠出生后3 d 和5 d 進行短期LPS 暴露，可顯著降低成年大鼠EAE 發(fā)病率和嚴重程度。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PM2.5 在激活炎癥細胞方面具有類LPS 作用，通過TLR-4/NF-κB信號通路誘導小膠質(zhì)細胞激活加劇神經(jīng)炎癥和脫髓鞘損傷，提示TLR-4/NF-κB 信號軸可能是PM2.5發(fā)揮作用的主要通路。表明人體免疫系統(tǒng)在少量病原體刺激下產(chǎn)生免疫應答而產(chǎn)生“訓練”效果，對該種病原體產(chǎn)生免疫耐受，與課題組觀察到的PM2.5暴露與疾病發(fā)展“時間窗”效應相符。

盡管臨床上使用短期PM2.5 暴露實現(xiàn)疾病治療不可行，但闡明這一病理現(xiàn)象的作用機制有助于更深入了解疾病發(fā)生機制，從而尋找有效治療靶點和進行相應藥物干預。本研究顯示，PM2.5 短期暴露抑制了EAE 發(fā)生發(fā)展，并顯著降低了炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失，短期暴露于PM2.5 的EAE 小鼠CD45+白細胞絕對數(shù)顯著減少，對激活的小膠質(zhì)細胞、樹突狀細胞及致病性Th17 細胞均有抑制作用。提示短期PM2.5 暴露通過抑制炎癥反應、誘導免疫耐受而緩解疾病。

綜上，本研究觀察到短期PM2.5 暴露可顯著抑制EAE 進程、炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失，PM2.5 通過減少CNS 炎癥因子并抑制EAE 小鼠外周炎癥從而阻斷脫髓鞘，進而抑制EAE 發(fā)展。后續(xù)研究將聚焦于探索短期PM2.5 暴露誘導免疫耐受這一“時間窗”效應的具體作用機制，為闡明MS 和其他自身免疫病的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點提供依據(jù)。