羅德 劉江 周鵬程 王飄 李栩嘉 林號(hào)民 蘇松

腎移植被視為終末期腎病的最佳治療選擇。然而，器官保存過程中的缺血-再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，IRI）嚴(yán)重影響移植物功能，是移植成功的主要障礙[1]。因此，減輕器官保存中的IRI 并改善器官功能成為當(dāng)前移植領(lǐng)域亟須解決的問題。靜態(tài)冷保存（static cold storage，SCS）是一種通過降低保存溫度和減緩細(xì)胞代謝來實(shí)現(xiàn)器官保存的技術(shù)[2-3]。然而，大量研究證實(shí)，在SCS 過程中，能量耗竭、氧化應(yīng)激和免疫炎癥激活等因素可能導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的受損，從而引發(fā)冷缺血損傷[4-6]。這種損傷在邊緣供者中尤為顯著，并且隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷程度會(huì)進(jìn)一步加重。低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）通過持續(xù)供應(yīng)氧氣和能量物質(zhì)，并及時(shí)清除代謝廢物，能夠減輕IRI 并改善器官保存質(zhì)量和效果，提高移植成功率并降低移植后并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。在IRI 中，炎癥反應(yīng)激活起著關(guān)鍵的作用，適度的炎癥反應(yīng)有助于組織修復(fù)和再生，但過度激活則會(huì)加劇組織損傷[9-10]。因此，控制炎癥反應(yīng)激活對(duì)于減輕IRI 和保護(hù)器官功能至關(guān)重要。然而，目前關(guān)于腎臟HMP 過程中炎癥反應(yīng)激活的研究報(bào)道非常有限。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠腎臟離體SCS 和HMP 模型，比較這兩種器官保存方式對(duì)腎臟炎癥因子水平的影響，為進(jìn)一步研究器官保存提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑和儀器

雄性Fisher 大鼠30 只，體質(zhì)量260～300 g，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液（histidine-tryptophan-ketoglutarate solution，HTK 液）購(gòu)于德國(guó)Custodiol 公司，威斯康星大學(xué)保存液（University of Wisconsin solution，UW 液）購(gòu)于美國(guó)Bridge to Life 公司，QuantiTect 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于德國(guó)Qiagen 公司，TaqMan fast universal PCR master mix 購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司，CXC 趨化因子配體（CXC chemokine ligand，CXCL）1、CXCL2、干擾素（interferon，IFN）-β1、IFN-α4、CC 趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）2、CCL20、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-17α、IL-17C、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、β-actin 引物購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司，StepOne 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司，機(jī)械灌注系統(tǒng)購(gòu)于德國(guó)Hugo Sachs Elektronik 公司。本實(shí)驗(yàn)通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批號(hào)：20211119-067）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理方式

將30 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（Control 組）、SCS 組和HMP 組，每組10 只，術(shù)前自由飲水。4.5% 異氟醚深度麻醉后，打開胸腹腔并剪破心臟，經(jīng)腹主動(dòng)脈使用4 ℃ HTK 液沖洗腎臟，直至腎臟顏色變?yōu)榫鶆螯S白色，剪破心臟到開始沖洗腎臟的時(shí)間大約為5 min。Control 組沖洗結(jié)束后獲取腎臟置于10%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)的病理組織學(xué)檢查；SCS 組沖洗結(jié)束后獲取腎臟置于4 ℃ HTK 液中保存12 h；HMP 組沖洗結(jié)束后獲取腎臟置于4 ℃ HTK 液中保存12 h，再使用4 ℃ UW 液以80 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的恒定壓力進(jìn)行2 h 低溫機(jī)械灌注，采用95% O2、5% CO2通過纖維膜氧合器對(duì)灌注液進(jìn)行氧合。

1.3 研究?jī)?nèi)容及方法

1.3.1 灌注參數(shù) 機(jī)械灌注系統(tǒng)能實(shí)時(shí)記錄流速及腎內(nèi)阻力，灌注結(jié)束后收集灌注過程中的流速和阻力數(shù)據(jù)，并用大鼠腎臟質(zhì)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行后續(xù)分析。灌注過程中每15 min 收集靜脈流出液，并使用酸堿度測(cè)定計(jì)測(cè)量其pH 值。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 取20 mg 腎臟組織于組織裂解器中使其變成組織勻漿，使用RNAeasy Mini 試劑盒提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定濃度，使用QuantiTect 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。隨后使用RT-PCR 系統(tǒng)檢測(cè)CXCL1、CXCL2、IFNβ1、IFN-α4、CCL2、CCL20、IL-17α、IL-17C、TNF-α 的CT 值。每個(gè)標(biāo)本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，用β-actin 將每個(gè)基因平均CT 值進(jìn)行標(biāo)化，并使用相對(duì)定量方法計(jì)算信使RNA（messenger RNA，mRNA）的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 腎臟組織病理學(xué)檢查 多聚甲醛固定腎臟，經(jīng)過不同濃度的乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后封片制成病理切片，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察并對(duì)腎小管損傷進(jìn)行評(píng)分。腎小管損傷采用改良的評(píng)分方法：在每張病理切片中，高倍鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)非重疊區(qū)域分別對(duì)腎小管擴(kuò)張、空泡形成、刷狀緣缺失、上皮壞死和上皮脫落五種組織形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行半定量評(píng)估。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)構(gòu)正常0 分；輕度改變?yōu)? 分（< 25%）；中度改變?yōu)? 分（25%～50%）；嚴(yán)重改變?yōu)? 分（> 50%）。計(jì)算10 個(gè)區(qū)域的平均分作為每張病理切片的腎小管損傷評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組獨(dú)立樣本間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，同一組樣本灌注前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 機(jī)械灌注過程中各參數(shù)變化

流速在HMP 過程中相對(duì)穩(wěn)定，灌注結(jié)束時(shí)流速并未降低[（2.7±0.4） mL/（min·g）比（2.9±0.4） mL/（min·g），P=0.5，圖1A]。腎內(nèi)阻力在HMP 過程中均相對(duì)穩(wěn)定，灌注結(jié)束時(shí)與灌注開始時(shí)比腎內(nèi)阻力沒有明顯變化[（2 2.2±1.6）mmHg/（min·g）比（20.1±2.1） mmHg/（min·g），P=0.3，圖1B]。腎靜脈灌注流出液pH 值在HMP 最初階段下降，隨后保持相對(duì)穩(wěn)定，灌注結(jié)束時(shí)的pH 值低于灌注開始時(shí)（7.28±0.01 比7.35±0.01，P=0.002，圖1C）。

圖1 HMP 過程中各參數(shù)變化Figure 1 Changes of parameters during HMP

2.2 各組腎臟炎癥因子mRNA 表達(dá)水平比較

與Control 組比較，SCS 組和HMP 組CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20、IL-17α、IL-17C、TNFα 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高；與SCS 組比較，HMP 組CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20、IL-17α和 TNF-α 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高（均為P< 0.05，圖2）。

圖2 各組腎臟炎癥因子mRNA 表達(dá)水平Figure 2 mRNA expression levels of inflammatory factors of kidneys in each group

2.3 各組腎臟組織病理學(xué)結(jié)果的比較

腎臟組織切片HE 染色結(jié)果顯示，Control 組腎小管刷狀緣完整，管腔無細(xì)胞碎片，細(xì)胞形態(tài)正常；SCS 組存在大量的細(xì)胞質(zhì)廣泛空泡化、刷狀緣缺失、上皮壞死、上皮脫落、管腔阻塞，腎小管損傷嚴(yán)重；HMP 組僅有少量刷狀緣丟失和上皮脫落，腎小管損傷輕微（圖3）。

圖3 各組腎臟組織病理學(xué)改變（HE，×400）Figure 3 Histopathological changes of the kidney tissues in each group

Control 組腎小管損傷評(píng)分為（0.34±0.11）分，低于SCS 組的（6.20±0.59）分和HMP 組的（4.10±0.76）分，而HMP 組腎小管損傷評(píng)分低于SCS 組（均為P< 0.05）。

3 討 論

腎移植仍然是終末期腎病的最佳治療選擇，能夠改善患者生活質(zhì)量和延長(zhǎng)壽命[11-12]。供者短缺是目前器官移植面臨的巨大挑戰(zhàn)[13-15]。邊緣供者被迫用以補(bǔ)充供者池以改善供者短缺的窘境，這類供者對(duì)保存過程中的IRI 更加敏感，術(shù)后移植物無功能發(fā)生率更高[16-17]。隨著Collins 液、UW 液、HTK 液等器官保存液相繼開發(fā)和改進(jìn)，SCS 成為了目前常用的器官保存方式，被多數(shù)器官移植中心廣泛使用[18-19]。SCS 主要通過降低溫度來抑制細(xì)胞代謝，然而長(zhǎng)時(shí)間SCS 可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失甚至壞死[20-21]。冷保存時(shí)間越長(zhǎng)，器官遭受的損傷越嚴(yán)重，特別是對(duì)于邊緣供器官，這大大降低了SCS 的效果[22-24]。近年來，研究人員開始更加關(guān)注HMP，它不僅可以保存器官，改善器官功能，還可用于評(píng)估器官功能[25-28]。本研究結(jié)果表明，HMP 雖然激活了腎臟的炎癥反應(yīng)，但減輕了腎臟冷保存損傷。靶向調(diào)控HMP 過程中的炎癥反應(yīng)為進(jìn)一步改善器官功能提供了新的思路。

腎臟機(jī)械灌注過程中的血流動(dòng)力學(xué)變化是一個(gè)重要的功能參數(shù)，可用于評(píng)估灌注效果和腎臟損傷程度[6]。由于體外灌注過程中灌注壓力恒定，因此流速與腎內(nèi)阻力成反比。本研究發(fā)現(xiàn)，灌注過程中腎內(nèi)阻力相對(duì)穩(wěn)定，無明顯變化。Blum 等[29]對(duì)豬腎臟進(jìn)行8 h 的HMP，也發(fā)現(xiàn)灌注過程中腎內(nèi)阻力保持基本穩(wěn)定。IRI 過程中存在多種炎癥因子的釋放和激活，如細(xì)胞因子TNF-α、IFN-β1、IFN-α4、IL-17α、IL-17C，趨化因子CXCL1、CXCL2、CCL2、CCL20[30]。這些炎癥因子在IRI 中發(fā)揮著重要的作用，調(diào)控這些炎癥因子有助于減輕IRI，改善器官保存和移植效果。對(duì)機(jī)械灌注過程中炎癥因子的研究，有助于深入理解機(jī)械灌注對(duì)器官的影響，并為開發(fā)相關(guān)的治療策略提供基礎(chǔ)。目前，對(duì)于機(jī)械灌注過程中移植物炎癥細(xì)胞因子的變化，大部分研究集中在常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）[31]，對(duì)于HMP 過程中炎癥因子的變化研究非常有限。一項(xiàng)包括293 例肝移植受者的隨機(jī)臨床多中心試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，相比于SCS，NMP 能顯著減輕肝小葉炎癥，減輕IRI[32]。Beetz 等[33]研究發(fā)現(xiàn)，相比于SCS，6 h的NMP 明顯提高了豬肝IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-18 的表達(dá)水平。然而，F(xiàn)ontes 等[34]研究表明，與SCS 相比，機(jī)械灌注明顯降低豬肝IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4 和IL-12 的水平。Jager 等[35]分別對(duì)豬和人的腎臟進(jìn)行4 h 和 6 h 的NMP，每小時(shí)采集灌注液樣本以評(píng)估促炎因子變化水平，發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8 和TNF 在NMP 期間顯著增加。Yang 等[36]使用夾閉兔子腎臟25 min 模擬熱缺血損傷，SCS 組松開夾子再灌注29 h 后在4 ℃高滲檸檬酸腺嘌呤溶液-Ⅱ溶液（hypertonic citrate adenine solution-Ⅱ，HCA-Ⅱ溶液）中進(jìn)行6 h 的SCS，NMP 組松開夾子恢復(fù)血流1 h，然后再進(jìn)行HMP 保存6 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與SCS 組相比，HMP 組核因子（nuclear factor，NF）-κB 和TNF-α 的表達(dá)明顯降低。然而本研究發(fā)現(xiàn)與S C S 組相比，H M P 組腎臟多種促炎因子mRNA 表達(dá)水平顯著升高，且HMP 能減輕冷保存損傷，研究結(jié)果的差異可能與兩個(gè)實(shí)驗(yàn)方案中熱缺血時(shí)間、保存液種類以及保存時(shí)間不同有關(guān)。

趙德芳等[37]比較了SCS 和HMP 對(duì)犬肝臟炎癥因子水平的影響，發(fā)現(xiàn)移植后HMP 組肝臟IL-1β、TNF-α、IL-8、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1α、MIP-1β、CCL20 的mRNA 表達(dá)水平明顯低于SCS 組，而在移植前的肝臟中只有TNF-α、MIP-1α、MIP-1β、CCL20 的mRNA 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究采用大鼠腎臟作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)也有所不同，獲取的腎臟置于4 ℃的HTK 液中保存12 h，而趙德芳等[37]對(duì)移植前的肝臟采用生理鹽水保存約3 h。此外，本研究中的HMP 組腎臟在SCS 12 h后，繼續(xù)進(jìn)行2 h 的HMP，而SCS 組僅接受了12 h的SCS，因此HMP 組腎臟的冷缺血時(shí)間更長(zhǎng)。這可能是導(dǎo)致HMP 組腎臟炎癥因子表達(dá)水平明顯升高的原因。相較于SCS，雖然HMP 升高了腎臟炎癥因子的mRNA 表達(dá)水平，但改善了腎臟病理損傷，這可能與HMP 降低移植物代謝率、提供氧氣、清除代謝產(chǎn)物、維護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定性和抗氧化等多種機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，腎臟移植物在HMP 期間的炎癥反應(yīng)被激活，在HMP 過程中降低移植腎的免疫炎癥活性有望進(jìn)一步提高機(jī)械灌注效果，改善移植物存活率。