皇甫潔，何猛超，劉 雅，溫銀萍，4，韓興林，何松貴，王德良，吳振強(qiáng)

（1.華南理工大學(xué)生物工程學(xué)院,廣東廣州 510006；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東佛山 528203；3.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；4.石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆石河子 832099）

中國白酒釀造歷史久遠(yuǎn)，采用的是多種微生物共同發(fā)酵的傳統(tǒng)釀制技術(shù)，其生產(chǎn)制作工藝更是中華民族至關(guān)重要的非物質(zhì)文化遺產(chǎn)之一[1-2]。按照使用原料可分為糧食白酒和代用原料白酒；按照生產(chǎn)方式可分為固態(tài)法白酒、半固態(tài)法白酒和液態(tài)法白酒、機(jī)械化白酒、半機(jī)械化白酒和手工生產(chǎn)白酒；按糖化發(fā)酵劑分類可分為大曲白酒、小曲白酒和麩曲白酒；按香型可分為濃香型白酒、醬香型白酒、清香型白酒、豉香型白酒、米香型白酒、鳳香型白酒等十二大香型白酒[3-4]。相比與世界上其他的蒸餾酒，中國白酒酒體和諧豐滿，風(fēng)格獨(dú)特，酒體成分最為豐富[5]。

米香型白酒是以廣東、廣西地區(qū)米制蒸餾酒制作工藝為基礎(chǔ)的一類白酒總稱，包括豉香型白酒和米香型白酒，是一種獨(dú)特的白酒，因獨(dú)特的生產(chǎn)過程造就了其“玉、冰、清、米香、獨(dú)特、甘潤、回味爽凈”的獨(dú)特風(fēng)格[6]。米香型白酒是酒曲中霉菌、酵母、細(xì)菌等微生物與原料的共同協(xié)調(diào)發(fā)酵作用得到的產(chǎn)物[7-9]。徐成勇等[10]利用平板稀釋法在米香型白酒酒曲中分離出了部分微生物；蕭暖章等[11]從麥芽汁培養(yǎng)基中分離出了表面酵母、產(chǎn)酯酵母、假絲酵母、釀酒酵母等功能性酵母菌；吳雪梅等[12]通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法分析了米香型白酒酒曲和發(fā)酵過程中的微生物，結(jié)果表明酒曲中主要的微生物是米根霉和酒精酵母。

隨著科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，白酒行業(yè)也逐漸往數(shù)字化、智能化、機(jī)械化方向發(fā)展，能夠大大提高白酒的產(chǎn)量和品質(zhì)的均一性，同時(shí)也能夠解決生產(chǎn)勞動(dòng)力不足、勞動(dòng)強(qiáng)度大等問題。本論文通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)九江酒廠傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲的微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行對(duì)比分析，以期為企業(yè)機(jī)械化制曲的質(zhì)量提升提供改進(jìn)措施及建議。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

曲樣：本實(shí)驗(yàn)所用的兩種曲樣為傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲，由廣州九江酒廠有限公司提供，每次取200 g，實(shí)驗(yàn)室保藏（4 ℃和-20 ℃）至檢測(cè)。大曲微生物DNA試劑盒為Fast DNA?Spin Kit for Soil。

試劑及耗材：無水乙醇、濃硫酸、氫氧化鈉、酚酞等（均為分析純），天津市福晨化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯、己酸乙酯等標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純），美國Sigma-Aldrich 公司；TAE 緩沖液：北京索萊寶科技有限公司；引物，上海生物工程股份有限公司；DNA Marker，Takara；瓊脂糖，南京生興生物技術(shù)有限公司；核酸染料Gengreen，上海賽百盛有限公司；土壤DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit），Omega Bio-Tek 公司。

儀器設(shè)備：CP1502 電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；HH-S6A 電熱恒溫水浴鍋，北京利偉永興儀器有限公司；PX2 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀，上海賽默生物科技有限公司；DYY5 穩(wěn)壓電泳儀，北京六一儀器廠；GeI Image System Tanon 1600 凝膠成像儀，上海天能科技有限公司；Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)，美國Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大曲理化指標(biāo)檢測(cè)

不同類型高溫大曲的理化指標(biāo)（糖化力、液化力、酯化力、發(fā)酵力、酸度等）依據(jù)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》測(cè)定[13]。

1.2.2 大曲微生物群落組成檢測(cè)

（1）總DNA 的提取[14-15]。稱取不同類型高溫大曲5.0 g 用液氮速凍后迅速研磨。大曲總DNA 提取方法按照土壤DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）操作說明書。為了保證所提取基因組的濃度及純度對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化，對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因的V3—V4 高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為338F/806R（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3/5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）；對(duì)真菌的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1）進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物為ITS5F/ITS1R（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3/5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3）。擴(kuò)增后用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

（2）高通量測(cè)序。將檢測(cè)合格樣品送往蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司，通過高通量測(cè)序（Illumina Miseq PE250）平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品至少3 次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，顯著性差異以p＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)。

利用Excel 2019、IBM SPSS Statistics 25等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，利用Origin pro 2021、Excel 2019 和網(wǎng)站https://www.omicstudio.cn/tool 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)制曲與圓盤制曲理化指標(biāo)分析結(jié)果

衡量酒曲性能主要通過對(duì)糖化力、液化力、發(fā)酵力與酯化力四大發(fā)酵性能進(jìn)行分析。糖化力指酒曲中糖化微生物及糖化酶將可溶性淀粉水解為葡萄糖的能力，是衡量酒曲糖化作用強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)[16]。液化力指酒曲中多種酶系對(duì)淀粉水解的綜合能力，當(dāng)酒曲的液化力較高時(shí)，發(fā)酵體系中微生物可利用更多的可溶性糖，從而提高產(chǎn)酒率。此外，液化力與糖化力成正相關(guān)，當(dāng)糖化力較高時(shí)，液化力也高。發(fā)酵力指酒曲生成乙醇的能力，是反映酒曲產(chǎn)酒能力的重要標(biāo)志。酯化力指酒曲催化酸醇酯化的能力，直接影響酒曲酒的質(zhì)量和品格。酒曲發(fā)酵性能、風(fēng)味形成與發(fā)酵微生物分類組成息息相關(guān)。對(duì)比兩種不同工藝酒曲糖化力發(fā)現(xiàn)，圓盤工藝制曲的糖化力較高，傳統(tǒng)酒曲的酯化力較高，圓盤制曲的發(fā)酵力略高于傳統(tǒng)制曲，兩種不同工藝的酒曲液化力相差不大。由表1 可知，傳統(tǒng)制曲與圓盤制曲相比其酯化力和水分含量更高，表明傳統(tǒng)制曲更有利于曲中酯類等風(fēng)味化合物的保存；圓盤制曲的發(fā)酵力和糖化力顯著高于傳統(tǒng)制曲，表明圓盤制曲中微生物的生長繁殖代謝和將可溶性淀粉水解能力均要高于傳統(tǒng)制曲。

表1 酒曲理化指標(biāo)分析

2.2 傳統(tǒng)制曲與圓盤制曲微生物指標(biāo)分析結(jié)果

2.2.1 傳統(tǒng)制曲與圓盤制曲細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)分析

從表2 可看出，傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲兩種樣品的覆蓋率（Goods coverage）均高于0.99，說明測(cè)序結(jié)果具有較高可信度，能夠反映樣品的真實(shí)情況[17]。Chao 指數(shù)是用于估算樣本中所含物種數(shù)目的指數(shù)，數(shù)值越高表示樣本中所含的物種數(shù)目越多，可以看出傳統(tǒng)制曲的物種數(shù)目高于圓盤制曲的物種數(shù)目。Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)能夠反映樣品的物種多樣性，數(shù)值越大表示樣本中群落多樣性越高，可以看出圓盤制曲的群落多樣性高于傳統(tǒng)制曲。

表2 兩種不同大曲微生物群落α-多樣性指數(shù)差異

表3 兩種曲在屬水平主要細(xì)菌(＞1%，%)

從圖1（a）可以看出，傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲兩種曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門是不同的，傳統(tǒng)制曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes），占總豐度的52.01 %，其次是變形菌門（Proteobacteria），占總豐度的40.79 %；圓盤制曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為變形菌門（Proteobacteria），占總豐度的89.57 %，厚壁菌門（Firmicutes）占比較少。從圖1（b）可以看出，傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲在細(xì)菌屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)菌種完全不同。傳統(tǒng)制曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為：醋酸菌屬（Acetobacter）占總豐度的37.72 %，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）占總豐度的37.06%，魏斯氏菌屬（Weissella）占總豐度的8.84 %等，都為豉香型白酒中常見的功能微生物。圓盤制曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為：克雷伯氏菌（Klebsiella）16.70 %，腸桿菌屬（Enterobacter）16.04 %等，為非釀酒功能微生物，醋酸桿菌、乳酸桿菌占比幾乎沒有。

圖1 細(xì)菌門/屬水平相對(duì)豐度圖

2.2.2 傳統(tǒng)制曲與圓盤制曲真菌微生物群落結(jié)構(gòu)分析

從表4 可以看出，傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲兩種樣品的覆蓋率（Goods coverage）均高于0.99，說明測(cè)序結(jié)果具有較高可信度，能夠反映樣品的真實(shí)情況。Chao 指數(shù)可以看出圓盤制曲的物種數(shù)目高于傳統(tǒng)制曲的物種數(shù)目。Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)能夠反映樣品的物種多樣性，數(shù)值越大表示樣本中群落多樣性越高，可以看出傳統(tǒng)制曲的群落多樣性高于圓盤制曲。

表4 兩種不同大曲微生物群落α-多樣性指數(shù)差異

表5 兩種曲在屬水平主要真菌(＞1%，%)

從圖2（a）可以看出，傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲兩種曲的優(yōu)勢(shì)真菌門也是不同的，傳統(tǒng)制曲的優(yōu)勢(shì)真菌門為子囊菌門（Ascomycota），占總豐度的85.89%，而毛霉菌門（Mucoromycota）占比較少，僅為14.01 %，圓盤制曲的優(yōu)勢(shì)真菌門為子囊菌門（Ascomycota），占總豐度的54.21 %，其次是毛霉菌門（Mucoromycota），占總豐度的45.16 %。從圖2（b）可以看出，傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲在真菌屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)菌種完全不同。傳統(tǒng)制曲的優(yōu)勢(shì)真菌屬為：復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）占56.42 %，伊薩酵母屬（Issatchenkia）占19.93 %，毛霉屬（Rhizomucor）占7.72 %，根霉屬（Rhizopus）占6.30%等。圓盤制曲的優(yōu)勢(shì)真菌屬為：嗜熱真菌屬（Thermomyces）占44.75 %，根霉屬（Rhizopus）占33.29%，毛霉屬（Rhizomucor）占11.11%，而復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）僅占7.05 %、伊薩酵母屬（Issatchenkia）占0.32%。

圖2 真菌門/屬水平相對(duì)豐度圖

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)比了九江酒廠米香型白酒中傳統(tǒng)制曲和圓盤制曲兩種制曲方式的理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)的差異性。理化指標(biāo)結(jié)果表明，傳統(tǒng)制曲的酯化力、糖化力、發(fā)酵力、液化力等均高于圓盤制曲；微生物結(jié)果表明，在細(xì)菌門水平，傳統(tǒng)制曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes），占總豐度的52.01 %，圓盤細(xì)制曲的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門（Proteobacteria），占總豐度的89.57%，在細(xì)菌屬水平上，傳統(tǒng)制曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為醋酸菌屬（Acetobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）等，都為米香型白酒中常見的功能微生物，圓盤制曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為克雷伯氏菌（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）等為非釀酒功能微生物，而醋酸桿菌、乳酸桿菌占比幾乎沒有；在真菌門水平上，傳統(tǒng)制曲的優(yōu)勢(shì)真菌門為子囊菌門（Ascomycota），占總豐度的85.89%，圓盤制曲的優(yōu)勢(shì)真菌門為子囊菌門（Ascomycota），占總豐度的54.21%，在真菌屬水平上，傳統(tǒng)制曲的優(yōu)勢(shì)真菌屬為復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、毛霉屬（Rhizomucor）、根霉屬（Rhizopus）等，圓盤制曲的優(yōu)勢(shì)真菌屬為嗜熱真菌屬（Thermomyces）、根霉屬（Rhizopus）、毛霉屬（Rhizomucor），兩種曲在真菌屬水平上也是各不相同的。通過以上結(jié)果顯示，傳統(tǒng)制曲的質(zhì)量優(yōu)于圓盤制曲的質(zhì)量，可以為企業(yè)的圓盤制曲提供改進(jìn)意見和策略。