摘要：目的 探究丁苯酞（NBP）對一氧化碳中毒遲發(fā)性腦?。―EACMP）小鼠海馬組織內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化及炎癥因子表達的作用機制。方法 篩選認知功能正常的C57成年野生型小鼠，采用靜態(tài)吸入一氧化碳法制備DEACMP小鼠模型，并隨機分為3組：DEACMP組、對照組及NBP組，其中，NBP組灌胃NBP混懸液6 mg/kg連續(xù)21 d，DEACMP組和對照組灌胃等量植物油。采用HE染色觀察小鼠海馬組織損傷情況，Western blot法測定離子鈣結(jié)合銜接分子1（IBA1）蛋白表達水平，ELISA法檢測下游炎癥因子表達水平。結(jié)果 與對照組比較，DEACMP組和NBP組逃避潛伏期顯著延長（P=0.00 P=0.029），神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少（P=0.00 P＝0.035），IBA1表達顯著增加（P=0.00 P=0.042），IBA1平均熒光強度顯著增強（P=0.00 P=0.021），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（P=0.00 P=0.024）、白細胞介素（IL）-6（P=0.00 P=0.015）、IL-1β（P=0.00 P=0.023）表達水平顯著增高。與DEACMP組比較，NBP組逃避潛伏期縮短（P=0.025），神經(jīng)細胞數(shù)量增多（P＝0.039），IBA1表達降低（P=0.035），IBA1平均熒光強度減弱（P=0.031），TNF-α（P=0.028）、IL-6（P=0.037）、IL-1β（P=0.034）表達水平降低。結(jié)論 NBP可通過抑制小膠質(zhì)細胞活化減少炎癥因子的表達，進而減輕DEACMP導(dǎo)致的認知功能障礙及腦組織損傷。

關(guān)鍵詞：一氧化碳中毒；遲發(fā)性腦病；小膠質(zhì)細胞；炎癥因子；丁苯酞

中圖分類號： R595.1；R747.9" 文獻標識碼： A" 文章編號：1000-503X（2024）05-0659-07

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.16017

Mechanism of Butylphthalide in Treating Delayed Encephalopathy After Carbon Monoxide Poisoning Based on Activation of Microglia

SHI Yu WANG Baojun CHEN Chao PANG Jiangxia LI Yang ZHANG Jun XU Maomao2

1Central Clinical Medical College of Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou，Nei Mongol 014040，China

2Department of Neurology，Baotou Central Hospital，Baotou，Nei Mongol 014040，China

Corresponding author：CHEN Chao Tel：15849200184，E-mail：282262797@qq.com

ABSTRACT：Objective To explore the mechanism of butylphthalide （NBP） in regulating microglia activation and inflammatory cytokine expression in the hippocampus of the mouse model of delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning （DEACMP）.Methods Wild-type C57 adult mice with normal cognitive function were selected，and DEACMP was modeled by static inhalation of carbon monoxide.The mice were randomized into three groups：DEACMP，control，and NBP.The NBP group was administrated with NBP suspension at 6 mg/kg by gavage for 21 days，and the DEACMP and control groups were administrated with the same amount of vegetable oil by gavage.The hippocampal injury was observed by HE staining.The protein level of ionized calcium-binding adapter molecule 1 （IBA1） was determined by Western blotting，and the levels of downstream inflammatory cytokines were measured by ELISA.Results Compared with the control group，the DEACMP and NBP groups showed prolonged escape latency （P=0.00 P=0.029），reduced nerve cells （P=0.00 P=0.035），up-regulated expression of IBA1 （P=0.00 P=0.042），increased mean fluorescence intensity of IBA1 （P=0.00 P=0.021），and elevated levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） （P=0.00 P=0.024），interleukin （IL）-6 （P=0.00 P=0.015），and IL-1β （P=0.00 P=0.023）.Compared with the DEACMP group，the NBP group showed shortened escape latency （P=0.025），increased nerve cells （P=0.039），down-regulated expression of IBA1 （P=0.035），decreased average fluorescence intensity of IBA1 （P=0.031），and lowered levels of TNF-α （P=0.028），IL-6 （P=0.037），and IL-1β （P=0.034）.Conclusion NBP can inhibit the activation of microglia and reduce the expression of inflammatory factors，thereby alleviating cognitive dysfunction and brain tissue damage caused by DEACMP.

Key words：carbon monoxide poisoning；delayed encephalopathy；microglia；inflammatory cytokines；butylphthalide

Acta Acad Med Sin，2024，46（5）：659-665

一氧化碳（carbon monoxide，CO）中毒是導(dǎo)致中毒性死亡的常見原因之一，約半數(shù)CO中毒幸存者會遺留神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，其中，最常見且嚴重的是一氧化碳中毒遲發(fā)性腦?。╠elayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning，DEACMP），其病程遷延難愈且預(yù)后差，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［1］。DEACMP的發(fā)病機制不清，目前的治療方法單一且療效不佳，因此，探究DEACMP發(fā)病機制并尋找有效的治療靶點顯得尤為重要。近年研究發(fā)現(xiàn)免疫損傷在DEACMP中發(fā)揮著重要作用［2-3］。小膠質(zhì)細胞（microglial，MG）是負責(zé)維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能及對損傷產(chǎn)生局部反應(yīng)的免疫細胞［4］。MG激活后產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)促進了阿爾茨海默病、缺血性腦卒中等神經(jīng)退行性疾病的進展［5-6］。以MG為靶點抑制神經(jīng)炎癥，進而改善甚至逆轉(zhuǎn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理損傷過程已成為當(dāng)前的研究熱點［7］。丁苯酞（butylphthalide，NBP）是我國自主研發(fā)的一種新型腦保護藥物，能夠重建微循環(huán)，保護線粒體，通過下調(diào)炎癥因子來治療認知障礙等神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?-10］。但關(guān)于NBP能否通過介導(dǎo)炎癥因子改善DEACMP認知障礙及其具體機制尚不明確。本研究探究NBP對DEACMP小鼠海馬組織內(nèi)MG活化及炎癥因子表達的作用機制，為臨床診療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6～8周齡健康清潔級C57BL/6小鼠120只，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證［SCXK（京）2019-0010］，飼養(yǎng)于包頭醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，溫度18～23 ℃，12 h明暗交替，標準小鼠飼料喂養(yǎng)，自由采食和飲水。本研究通過內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準（倫理審批編號：YKD202301009）。

1.2 主要試劑

NBP膠囊購自石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司，離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium-binding adaptor molecule "IBA1）單克隆抗體購自美國Abcam公司，小鼠白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司。

1.3 DEACMP動物模型制備及分組

篩選認知功能正常的小鼠，采用靜態(tài)吸入CO法制備DEACMP小鼠模型［11］。將實驗動物置于CO中毒箱中，持續(xù)吸入CO 1000 ppm 40 min，3000 ppm 20 min制備DEACMP小鼠模型，對照組小鼠暴露在空氣中1 h。采用隨機數(shù)字表法將120只小鼠隨機分為3組，每組40只。NBP組灌胃NBP混懸液（NBP和植物油的混合溶液）6 mg/kg［12］，DEACMP組和對照組灌胃等量植物油，各組均每天灌胃1次，連續(xù)21 d。

1.4 Morris水迷宮實驗

采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)及記憶能力。在直徑120 cm、高50 cm的圓形容器中裝滿含有食品級二氧化鈦的水，水溫（22.0±0.5）℃。將水池分為4個象限，在目標象限中央水面下1 cm處放置1個實驗平臺。小鼠先適應(yīng)水迷宮環(huán)境1 d，再進行5 d正式實驗，取4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為其最終學(xué)習(xí)成績，記錄各組小鼠平均逃避潛伏期。

1.5 HE染色

經(jīng)常規(guī)麻醉灌注處理后，將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，采用石蠟包埋法制備腦組織切片（8 μm），浸泡于二甲苯中脫蠟、酒精梯度清洗、水化、蘇木精染色、分化、伊紅浸染，常規(guī)脫水后透明、封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腦細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 Western blot檢測

提取腦組織總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，將蛋白樣品進行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入IBA1（1∶1000）、β-actin抗體（1∶5000）4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，加入二抗（1∶1000），室溫孵育1.5 h，ECL顯影，采用Image-proplus 6.0軟件分析條帶。

1.7 免疫熒光染色

將小鼠海馬組織制成30μm切片，0.5% Ｔriton X-100室溫通透20 min，PBS沖洗，10%羊血清室溫封閉1 h，加入IBA1一抗4 ℃搖床過夜，再加入二抗室溫孵育1 h，清洗后常規(guī)封片觀察。

1.8 ELISA實驗

采用ELISA檢測小鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用LSD檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮實驗結(jié)果

造模21 d后，對照組、DEACMP組及NBP組水迷宮實驗逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.260，P＜0.001），DEACMP組和NBP組較對照組逃避潛伏期顯著延長（P=0.00 P=0.029），NBP組較DEACMP組逃避潛伏期縮短（P=0.025）。對照組運動軌跡呈趨向式，DEACMP組運動軌跡無明顯趨勢，NBP組運動軌跡較對照組混亂，但輕于DEACMP組（圖1）。

2.2 組織病理學(xué)變化

對照組小鼠海馬組織神經(jīng)細胞形狀規(guī)整，呈圓形或橢圓形，排列緊密有序，細胞結(jié)構(gòu)完整，核膜核仁完好。與對照組比較，DEACMP組神經(jīng)細胞腫脹，呈三角形或多邊形，細胞數(shù)量與層數(shù)減少，排列混亂，部分細胞出現(xiàn)核固縮、核溶解，甚至壞死。NBP組神經(jīng)細胞損傷程度較DEACMP組減輕，未見壞死細胞，細胞數(shù)量與層數(shù)較對照組減少（圖2）。3組小鼠海馬組織神經(jīng)細胞計數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.804，P=0.001）。與對照組比較，DEACMP組和NBP組小鼠海馬組織神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少（P＝0.00 P＝0.035），但NBP組小鼠海馬組織神經(jīng)細胞數(shù)量較DEACMP組增多（P＝0.039）。

2.3 各組小鼠海馬組織中IBA1的表達水平比較

3組小鼠海馬組織中IBA1表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.280，Plt;0.001）。與對照組比較，DEACMP組和NBP組海馬組織中IBA1表達顯著增加（P=0.00 P=0.042），且NBP組IBA1表達較DEACMP組降低（P=0.035）（圖3）。

2.4 各組小鼠海馬組織中IBA1的活化水平比較

對照組小鼠海馬組織中MG呈靜息態(tài)，細胞胞體較細長，分枝多；DEACMP組小鼠海馬組織中MG處于活化狀態(tài)，細胞胞體增大，分枝減少，突起增粗；NBP組小鼠海馬組織可見部分MG處于活化狀態(tài)，活化數(shù)量較DEACMP組減少，但較對照組增多。3組小鼠海馬組織中IBA1平均熒光強度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.150，P＜0.001），與對照組比較，DEACMP組和NBP組IBA1平均熒光強度顯著增強（P=0.00 P=0.021），但NBP組IBA1平均熒光強度較DEACMP組減弱（P=0.031）（圖4）。

2.5 各組小鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平比較

3組小鼠海馬組織中TNF-α（F=11.200，Plt;0.001）、IL-6（F=12.760，P＜0.001）、IL-1β（F=11.860，P＜0.001）表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組比較，DEACMP組和NBP組海馬組織中TNF-α（P=0.00 P=0.024）、IL-6（P=0.00 P=0.015）、IL-1β（P=0.00 P=0.023）表達水平顯著增高，且NBP組TNF-α（P=0.028）、IL-6（P=0.037）、IL-1β（P=0.034）的表達水平較DEACMP組降低（圖5）。

3 討論

多數(shù)CO中毒患者經(jīng)假愈期后會出現(xiàn)DEACMP，包括認知及精神異常、錐體外系及錐體系癥狀、大腦皮質(zhì)局灶性功能障礙等，其中以認知障礙為最典型的臨床表現(xiàn)［13］。DEACMP治療以高壓氧療法為主，但研究表明高壓氧治療對于嚴重CO中毒患者效果不佳，且會導(dǎo)致氣壓創(chuàng)傷、肺水腫、癲癇和自由基生成等并發(fā)癥［14］。若能找到有效藥物早期干預(yù)，將有助于提高患者生存質(zhì)量，減輕社會負擔(dān)。目前DEACMP的發(fā)病機制有缺血缺氧學(xué)說、免疫損傷學(xué)說及自由基損傷等。大量研究表明腦組織損傷可分為早期損傷和二次損傷，損傷后腦內(nèi)MG在數(shù)量和形態(tài)上發(fā)生一系列變化。DEACMP假愈期的發(fā)病特點和病程早期的病理損傷與腦損傷及二次損傷相似［ 15-16］，并且本團隊前期研究證實免疫損傷在DEACMP中發(fā)揮重要作用［17-18］。具有抗炎活性的神經(jīng)保護藥物在治療免疫損傷相關(guān)疾病方面的效果顯著［19］，有可能改善DEACMP的臨床癥狀。

海馬體位于大腦顳葉內(nèi)側(cè)，在空間導(dǎo)航、情景記憶及認知功能中起關(guān)鍵作用［20］。越來越多的證據(jù)表明成人海馬損傷及神經(jīng)調(diào)節(jié)異?？赡芘c阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化、帕金森病及癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的認知能力下降和精神疾病的心理癥狀有關(guān)［21］。CO中毒后海馬對缺血缺氧高度敏感，MRI可見腦白質(zhì)高信號和海馬萎縮；在DEACMP模型中也發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)元壞死凋亡［22-24］。因此，本研究對小鼠海馬組織樣本進行分析，HE染色顯示DEACMP組海馬組織神經(jīng)細胞較對照組明顯腫脹、數(shù)量減少、細胞層數(shù)減少、排列紊亂疏松，部分細胞出現(xiàn)核固縮、核溶解，并可見呈三角形或多邊形的壞死細胞。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，在造模21 d后，DEACMP組小鼠較對照組逃避潛伏期顯著延長，運動軌跡明顯混亂，表明DEACMP組小鼠出現(xiàn)認知障礙和記憶力減退；采用NBP干預(yù)后，小鼠逃避潛伏期較DEACMP組縮短，運動軌跡也趨向規(guī)整，表明NBP對治療DEACMP引起的認知障礙具有一定效果，但與對照組仍存在差異，提示還可能存在其他機制介導(dǎo)DEACMP相關(guān)認知功能障礙。本研究成功構(gòu)建DEACMP小鼠模型，從病理及行為認知方面證明了DEACMP會使小鼠海馬組織內(nèi)的神經(jīng)細胞減少甚至壞死，出現(xiàn)以認知障礙為主的一系列臨床表現(xiàn)。

MG是炎癥因子的主要來源，參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎性損傷過程。它在靜息狀態(tài)下為M0型，過度激活轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型（經(jīng)典激活）［25］。既往研究表明MG能通過Toll樣受體和核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體識別受損細胞，釋放損傷相關(guān)分子模式，產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子，同時這些細胞因子又進一步活化MG，使MG由M0型向M1型極化，產(chǎn)生大量促炎因子，造成持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)，加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［26-27］。這些促炎因子導(dǎo)致的腦損傷被認為是阿爾茨海默病及DEACMP等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生認知障礙的關(guān)鍵因素［28］。本研究免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)對照組小鼠海馬組織中MG呈靜息態(tài)，細胞胞體較細長，分枝多；與對照組比較，DEACMP組小鼠海馬組織中MG活化增強，細胞胞體增大，分枝減少，突起增粗，并且IBA1平均熒光強度顯著增強；Western blot也顯示DEACMP組小鼠海馬組織內(nèi)IBA1表達較對照組顯著增加。可見MG參與DEACMP的腦損傷機制：CO中毒引起免疫反應(yīng)，使MG活化增強，IBA1表達增加，釋放大量炎癥因子導(dǎo)致神經(jīng)細胞壞死，這與Thom等［2］研究結(jié)論一致。此外，本研究ELISA檢測結(jié)果顯示DEACMP組炎癥因子表達量較對照組增高，提示在DEACMP發(fā)病過程中，MG受到刺激極化為M1型，發(fā)揮促炎作用產(chǎn)生大量炎癥因子，造成神經(jīng)細胞壞死引起腦損傷。

NBP已被推薦用于急性缺血性卒中的治療，它是一種小分子多靶點藥物，具有神經(jīng)保護、改善認知障礙、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激和抗炎等作用，在神經(jīng)退行性疾病、腦水腫、自身免疫性疾病及血管性癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中表現(xiàn)出巨大潛力［29-30］。臨床研究表明NBP不會增加藥物性肝損傷和肝腎功能衰竭的發(fā)生風(fēng)險，對體內(nèi)血糖和血脂水平的影響小，藥物不良反應(yīng)少［31］。藥理研究表明NBP可促進腦血管新生、加速神經(jīng)行為功能恢復(fù)從而治療缺血性腦卒中［32］；以MG為靶細胞可以減輕肌萎縮側(cè)索硬化癥的神經(jīng)炎癥反應(yīng)［33］?；A(chǔ)研究表明NBP能顯著下調(diào)腦內(nèi)炎癥因子水平，減輕免疫性腦損傷，改善認知障礙［34］。但NBP對DEACMP的保護作用及其機制還不清楚。Chen等［35］研究表明NBP能通過減輕MG活化改善小鼠的認知障礙。Han等［36］研究發(fā)現(xiàn)NBP可通過減少促炎細胞因子來減輕慢性灌注不全導(dǎo)致的認知障礙。本研究結(jié)果顯示，與DEACMP組比較，NBP組小鼠海馬組織神經(jīng)細胞未出現(xiàn)壞死，細胞數(shù)量及層數(shù)較多，較致密；MG活化減弱，IBA1表達降低，IBA1平均熒光強度減弱，TNF-α、IL-6、IL-1β表達水平降低。這提示NBP可能通過抑制MG活化減少炎癥因子的產(chǎn)生進而減輕DEACMP的免疫損傷，并在一定程度上改善認知功能。

綜上，本研究結(jié)果表明，NBP可以改善DEACMP小鼠的認知障礙，其可通過抑制MG活化，減少炎癥因子表達，進而減輕腦組織損傷。研究成果為探索新的DEACMP治療策略提供重要的參考依據(jù)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 石雨：撰寫論文、統(tǒng)計數(shù)據(jù)、參與實驗；王寶軍：設(shè)計實驗、指導(dǎo)研究、提供基金支持；陳超、龐江霞：指導(dǎo)研究、參與實驗；李洋：參與實驗；張軍：指導(dǎo)研究、參與實驗；許毛毛：參與實驗

參 考 文 獻

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（收稿日期：2024-01-24）