摘 要：目的 探討癲癇患者血清標(biāo)志物及頭部磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）特征的變化，為進(jìn)一步研究癲癇的發(fā)病機(jī)制和臨床特征打下基礎(chǔ)。方法 選擇30例單側(cè)顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）患者（TLE組）和30例健康人群對(duì)照組作為研究對(duì)象。探查患者腦部MRI特征，提取雙側(cè)海馬T2弛豫時(shí)間（HCT2），測(cè)量外周血 T 淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+）、炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10和ICAM-1）和miRNAs（miR-146a、miR-210、miR-221、miR-34a、miR-135b及miR-33）水平并比較2組的差異。結(jié)果 與對(duì)照組比較，TLE組海馬體積明顯縮小，海馬體HCT2延長(zhǎng)（Plt;0.05）；外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平升高，炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和ICAM-1水平升高，miR-146a、miR-210、miR-221 和miR-34a明顯升高（均Plt;0.05）；而T淋巴細(xì)胞亞群CD8+、IL-10、miR-33、miR-135b的表達(dá)水平顯著降低（均Plt;0.05）。結(jié)論 TLE患者海馬病變，可能與外周血T淋巴細(xì)胞亞群失衡、慢性炎癥反應(yīng)、miRNA異常有關(guān)，控制海馬的炎癥反應(yīng)，可減少癇性發(fā)作。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)蝹?cè)顳葉癲癇；磁共振；T淋巴細(xì)胞亞群；炎性因子；miRNA

中圖分類號(hào)：R742.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2023-06-06

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（22C0454）;邵陽(yáng)市科技創(chuàng)新指導(dǎo)項(xiàng)目（2022FG4083）;邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院院級(jí)項(xiàng)目（23FY1004）

作者簡(jiǎn)介：姚能云，男，主任醫(yī)師，博士研究生，主要從事癲癇的研究;E－mail：786989317@qq.com

Levels of miRNAs， inflammatory factors and MRI features in peripheral blood of patients with epileps

YAO Nengyun， HU Haoyue， XIE Huanhuan， TANG Songlin， LIU Huafei， ZOU Wenhui

（Department of Neurology， The First Affiliated Hospital of Shaoyang University， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Objective To investigate the changes of serum biological substances and head magnetic resonance imaging （MRI） features in patients with epilepsy， and lay a foundation for further research on the pathogenesis and clinical characteristics of epilepsy. Methods Thirty patients with unilateral temporal lobe epilepsy （TLE） （TLE group） and thirty healthy subjects （control group） were selected as participants. The brain MRI features of the patients were investigated. Differences in bilateral hippocampal T2 relaxation time （HCT2） and levels of peripheral blood T lymphocyte subsets （CD3+， CD4+， CD8+ and CD4+/CD8+）， inflammatory factor （TNF-α， IL-1β， IL-2， IL-6， IL-10 and ICAM-1）， miRNAs （miR-146a， miR-210， miR-221， miR-34a， miR-135b， and miR-33） between the 2 groups were compared. Results Compared with the control group， the volume of the hippocampus in the TLE group was significantly reduced， and the HCT2 in the epilepsy group was higher （Plt;0.05）; the levels of peripheral blood T lymphocyte subsets CD3+， CD4+ and CD4+/CD8+， inflammatory factors TNF-α， IL-1β， IL-2， IL-6 and ICAM-1， and miR-146a， miR-210， miR-221 and miR-34a were distinctly increased in the TLE group （all Plt;0.05）; however， the expression levels of CD8+， IL-10， miR-33 and miR-135b in T lymphocyte subsets were remarkably decreased in the TLE group （all Plt;0.05）. Conclusion The pathological changes in the hippocampus of TLE patients may be related to the imbalance of T lymphocyte subsets in peripheral blood， chronic inflammatory response， and abnormal miRNA. Thus， controlling the inflammatory response of the hippocampus can reduce the occurrence of epileptic seizures.

Key words： temporal lobe epilepsy （TLE）; magnetic resonance; T lymphocyte subsets; inflammatory factor; miRNA

姚能云，胡皓月，謝歡歡，唐松林，劉化飛，鄒文慧：癲癇患者外周血miRNAs和炎性因子水平及MRI特征

癲癇為反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)元異常放電引起的一過(guò)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，屬于慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?］。大腦的內(nèi)側(cè)顳葉結(jié)構(gòu)異常時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致（temporal lobe epilepsy，TLE）的發(fā)生［2］，海馬硬化是導(dǎo)致TLE的主要因素之一［3］，嚴(yán)重影響了患者的精神行為及生活質(zhì)量。所以，有效控制癲癇發(fā)作、明確發(fā)病機(jī)制，一直是人們非常關(guān)注的問(wèn)題，但癲癇的發(fā)病機(jī)制至今未完全闡明。近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，免疫炎癥因素在癲癇發(fā)作中起重要的作用［4］。也已經(jīng)證實(shí) T淋巴細(xì)胞亞群中的CD4+和CD8+與海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)，且參與了癲癇的發(fā)作［5］。此外，促凋亡因子的過(guò)度表達(dá)、炎癥因子的過(guò)度積累、神經(jīng)元功能異常等均與癲癇的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［6］。

原發(fā)性癲癇首選藥物治療，大概有30%的癲癇患者癇性發(fā)作時(shí)難以控制，嚴(yán)重影響患者的生命安全及生活質(zhì)量，近來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道大概有70%的難治性癲癇患者在手術(shù)治療后能夠有效控制［7］，但術(shù)前病變的識(shí)別及精準(zhǔn)定位是手術(shù)成功的關(guān)鍵［8］。影像技術(shù)的飛速發(fā)展，特別是高強(qiáng)度的磁共振的臨床應(yīng)用，給癲癇患者的病灶定位的準(zhǔn)確性帶來(lái)質(zhì)的飛躍，因此，MRI是評(píng)估術(shù)前TLE海馬病變的主要方式。許多TLE患者的頭部MRI特征為海馬體積萎縮和T2WI信號(hào)增強(qiáng)，可用于海馬病變的定量評(píng)估［9］。

因此，本研究選擇單側(cè)TLE患者作為研究對(duì)象，利用MRI技術(shù)評(píng)估患者海馬病變特征，隨后觀察外周血T淋巴細(xì)胞亞群、炎性因子、miRNAs表達(dá)水平的變化，為TLE早期診斷和治療提供有效的方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2020年6月至2022年3月診斷為單側(cè)TLE的30例患者作為研究對(duì)象，其中男性16例，女性14例。選擇同期健康體檢的30名無(wú)癲癇病史的受試者作為對(duì)照，其中男、女各15例。本研究經(jīng)邵陽(yáng)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟2017年發(fā)布的癲癇防治指南［10］，結(jié)合臨床特征、腦電圖及輔助檢查方法，診斷為單側(cè)TLE；（2）術(shù)前常規(guī)MRI檢查，掃描序列包括T2-FLAIR，圖像紋理無(wú)偽影；（3）無(wú)癲癇家族史；（4）近期無(wú)免疫抑制劑、激素等藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并腦部疾病，如顱內(nèi)腫瘤、腦外傷、中風(fēng)、癔癥等疾?。唬?）中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染引起的繼發(fā)性TLE；（3）自身免疫性腦??；（4）臨床資料不全。

1.2 方法

1.2.1 影像學(xué)檢查

常規(guī)3.0 T MRI儀器。掃描序列包括：（1）軸向T1-FLAIR、T2WI、T2-FLAIR；（2）矢狀T2加權(quán)像（T2 weighted imaging，T2WI）；（3）海馬長(zhǎng)軸垂直的SE序列雙回波斜冠狀面。FLAIR掃描參數(shù)設(shè)置：（1）重復(fù)時(shí)間8 800 ms；（2）恢復(fù)時(shí)間95 ms； （3）切片厚度3 mm；（4）層間距0；（5）矩陣512×512。SE掃描參數(shù)設(shè)置：（1）重復(fù)時(shí)間3 000 ms；（2）恢復(fù)時(shí)間20 ms；（3）切片厚度4 mm；（4）層間距0；（5）矩陣512×512。使用T2弛豫圖計(jì)算每個(gè)切片的T2弛豫圖，并測(cè)量海馬HCT2。測(cè)量區(qū)域不包括海馬區(qū)邊界、囊性區(qū)和海馬裂腦脊液。

1.2.2 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)

入院后1 h內(nèi)采集患者空腹靜脈血3 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝，TLE患者需在采血前72 h內(nèi)無(wú)癲癇發(fā)作。加入熒光染色劑標(biāo)記淋巴細(xì)胞表面的CD3、CD4、CD8分子； 加入100 μL抗凝劑并充分混合； 在室溫下于黑暗中放置15 min。 加入2 mL FACSLysing 溶液；室溫避光孵育10 min；以300 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。棄上清后，用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+。

1.2.3 外周血炎性因子的檢測(cè)

入院后采集患者空腹靜脈血3 mL，靜置分離血清，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，JYM0083Hu）測(cè)定血清TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、ICAM-1水平。進(jìn)行微量滴定板抗體包被，依次稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與血清混合，密封后37 ℃反應(yīng)1.5 h；分別加入100 μL TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、ICAM-1抗體工作液，密封后37 ℃反應(yīng)1 h；用緩沖液清洗微孔板后，加入100 μL稀釋的ABC工作液，密封后37 ℃反應(yīng)30 min；用緩沖液清洗微孔板后，加入90 μL TMB顯色液，密封后避光37 ℃反應(yīng)20 min；加入100 μL終止溶液，使用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔的OD值。

1.2.4 外周血中miRNA的檢測(cè)

入院后采集患者空腹靜脈血3 mL，靜置分離血清，-80 ℃冰箱保存。 再用試劑盒提取血清中miRNA，然后反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，再進(jìn)行PCR檢測(cè)。使用miRcute增強(qiáng)的miRNA SYBR Green熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)miR-146a、miR-210、miR-221、miR-34a、miR-135b和miR-33進(jìn)行定量檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用卡方檢驗(yàn)比較差異。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較差異。Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TLE患者腦部MRI特征分析

TLE患者的腦部MRI顯示患者右側(cè)海馬體明顯縮小，信號(hào)增強(qiáng)（圖 1）。

隨后通過(guò)SE序列雙回波斜冠狀平面測(cè)量患者海馬HCT2值之間的差異（圖 2）。對(duì)照組和癲癇組右側(cè) HCT2值分別為（83.70±2.60） ms 和（91.80±1.40） ms，左側(cè)HCT2值分別為（83.80±1.10） ms 和（82.90±3.00） ms，右/左HCT2 比值分別為（0.95±0.22）和（1.01±0.31）。與對(duì)照組比較，癲癇組左右海馬HCT2值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；然而右/左HCT2比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

2.2 TLE患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平的變化

對(duì)照組和癲癇組外周血CD3+分別為（72.8±3.7）%和（76.8±4.6）%，CD4+分別為（42.6±1.9）%和（44.9±2.3）%，CD8+分別為（24.9±1.6）%和（23.1±1.7）%，CD4+/CD8+分別為（1.51±0.10）和（2.44±0.12）。與對(duì)照組比較，癲癇組患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均明顯升高，而癲癇組CD8+水平明顯降低（均P ＜0.05，圖3）。

2.3 TLE患者外周血炎性因子水平變化

對(duì)照組和癲癇組外周血TNF-α水平分別為（0.96±0.14）pg/mL和（2.52±0.18）pg/mL，IL-1β水平分別為（1.80±0.43） pg/mL和（4.72±0.61） pg/mL，IL-2水平分別為（0.85±0.17） pg/mL和（1.49±0.26） pg/mL，IL-6水平分別為（1.09±0.22） pg/mL和（2.36±0.16）pg/mL，IL-10水平分別為 （1.40±0.21） pg/mL和（0.34±0.06） pg/mL，ICAM-1水平分別為（1.12±0.31） pg/mL和（1.78±0.28） pg/mL，與對(duì)照組相比，癲癇組患者外周血炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、ICAM-1 水平均顯著升高，而IL-10水平顯著下降（均P＜0.05，圖4）。

2.4 TLE患者外周血miRNAs水平變化

對(duì)照組和癲癇組外周血miR-146a水平分別為（1.00±0.13）和（2.14±0.28），miR-210水平分別為（1.00±0.15）和（1.89±0.31），miR-221水平分別為（1.00±0.20）和（2.44±0.35），miR-34a水平分別為（1.00±0.18）和（1.59±0.13），miR-135b水平分別為（1.00±0.31）和（0.17±0.16），miR-33水平分別為（1.00±0.22）和（0.26±0.09）。與對(duì)照組相比，癲癇組患者外周血miR-146a、miR-210、miR-221、miR-34a水平明顯升高，而miR-135b、miR-33水平明顯下降（均P＜0.05，圖5）。

3 討論

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)的疾病之一，目前的發(fā)病機(jī)制不清［1］。研究發(fā)現(xiàn)癲癇患者有明顯的海馬萎縮性，雙側(cè)海馬HCT2明顯升高，這可能與神經(jīng)元丟失和神經(jīng)膠質(zhì)增生之間存在密切聯(lián)系［2］。結(jié)果還提示TLE患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群中CD3+和CD4+細(xì)胞比例明顯升高，而CD8+細(xì)胞比例明顯降低，這與NAKAHARA等［4］的研究相似。另外，PITSCH等［11］研究表明，CD8+T淋巴細(xì)胞可引起性神經(jīng)變性、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，這可能與邊緣性腦炎后海馬硬化導(dǎo)致TLE 的發(fā)作有關(guān)。有研究表明多種炎性因子參與了癲癇發(fā)病基礎(chǔ)，如TNF-α可通過(guò)刺激谷氨酸誘導(dǎo)癲癇發(fā)作；IL-1β可通過(guò)N-甲基-D-天冬氨酸受體誘導(dǎo)神經(jīng)元過(guò)度興奮并產(chǎn)生興奮性毒性，促進(jìn)海馬體嚴(yán)重變性，最終加重癲癇發(fā)作［4］；IL-2主要由活化的T細(xì)胞進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致海馬的萎縮和硬化；IL-6可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解能力，誘導(dǎo)炎性損傷［12］；但I(xiàn)L-10參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，是炎癥和免疫抑制因子。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLE患者外周血中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、ICAM-1水平顯著升高，IL-10水平明顯降低，這與以上結(jié)果一致。

目前，miRNA是否介入這一發(fā)病機(jī)制，還沒(méi)有定論，有研究表明miRNAs參與癲癇的發(fā)作，miR-146a和miR-221是調(diào)節(jié)炎癥因子生成的miRNA，可促進(jìn)下游多種炎癥因子和黏附因子的表達(dá)［13］；miR-34a屬于調(diào)節(jié)凋亡因子表達(dá)的miRNA［14］，它們都在神經(jīng)系統(tǒng)的功能和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，參與癲癇發(fā)作，本研究發(fā)現(xiàn)TLE患者外周血中miR-126a、miR-221和miR-34a上調(diào)。以上結(jié)果表明miRNAs可以通過(guò)調(diào)節(jié)釋放炎癥因子和凋亡因子來(lái)參與TLE的發(fā)生過(guò)程。本研究還檢測(cè)TLE患者外周血中miR-210、miR-135b和miR-33的表達(dá)水平，與相關(guān)報(bào)道相符。因此，TLE患者海馬結(jié)構(gòu)的病理改變，外周血T淋巴細(xì)胞亞群紊亂、炎性因子釋放、miRNAs表達(dá)調(diào)控等與癲癇發(fā)作和神經(jīng)元損傷有關(guān)。采集組織和腦脊液樣本，分析淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子和miRNA的變化，以及MRI特征與血清生物學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性，并探討它們對(duì)神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制，為了解TLE發(fā)病機(jī)制、尋找治療靶點(diǎn)提供依據(jù)［15-16］。

總之，癲癇的發(fā)病因素很多，炎癥機(jī)制可能是癲癇發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要組成部分，炎癥在癲癇中的作用，可能既是癲癇活動(dòng)的結(jié)果，也是疾病發(fā)展的一個(gè)促成因素。未來(lái)有望從炎癥因子和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的角度，闡明miRNAS、細(xì)胞因子與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，進(jìn)一步闡述癲癇的發(fā)病機(jī)制，為癲癇的治療提供新的靶點(diǎn)，為后續(xù)預(yù)防、復(fù)發(fā)、耐藥等提供新的思路和生物標(biāo)志物。

參考文獻(xiàn)：

［1］肖波， 龍泓羽. 癲癇的多組學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究［J］. 中華神經(jīng)科雜志， 2017， 50（4）： 241-243.

［2］牟慶超. 3.0 TMR對(duì)于癲癇診斷的價(jià)值意義［J］. 現(xiàn)代醫(yī)用影像學(xué)， 2022， 31（12）： 2217-2219.

［3］GAWELEK K L， GALES J M， PRAYSON R A. Hamartia in hippocampal sclerosis-associated mesial temporal lobe epilepsy［J］. Annals of Diagnostic Pathology， 2018， 32： 63-66.

［4］NAKAHARA H， KONISHI Y， BEACH T G， et al. Infiltration of T lymphocytes and expression of icam-1 in the hippocampus of patients with hippocampal sclerosis［J］. Acta Histochemica et Cytochemica， 2010， 43（6）： 157-162.

［5］ALVIM M K M， MORITA-SHERMAN M E， YASUDA C L， et al. Inflammatory and neurotrophic factor plasma levels are related to epilepsy independently of etiology［J］. Epilepsia， 2021， 62（10）： 2385-2394.

［6］杜艷姣， 李艷， 段智慧， 等. P2X7R/NLRP3/Caspase-1通路在難治性癲癇患者外周血中的表達(dá)［J］. 癲癇與神經(jīng)電生理學(xué)雜志， 2022， 31（5）： 269-273.

［7］ENGEL J Jr. Evolution of concepts in epilepsy surgery［J］. Epileptic Disord， 2019， 21（5）： 391-409.

［8］FERNANDEZ-BACA VACA G， PARK J T. Focal EEG abnormalities and focal ictal semiology in generalized epilepsy［J］. Seizure， 2020， 77： 7-14.

［9］SHAWARBA J， KASPAR B， RAMPP S， et al. Advantages of magnetoencephalography， neuronavigation and intraoperative MRI in epilepsy surgery re-operations［J］. Neurolgical Research， 2021， 43（6）： 434-439.

［10］FISHER R S， CROSS J H， FRENCH J A， et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy： Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology［J］. Epilepsia， 2017， 58（Supp.l）： 522-530.

［11］PITSCH J， VAN LOO K M J， GALLUS M， et al. CD8+ T-lymphocyte-driven limbic encephalitis results in temporal lobe epilepsy［J］. Annals of Neurology， 2021， 89（4）： 666-685.

［12］LI X L， ZHOU R， PENG H， et al. Microglia PKM2 mediates neuroinflammation and neuron loss in mice epilepsy through the astrocyte C3-neuron C3R signaling pathway［J］. Brain Science， 2023， 13（2）： 262.

［13］孔惠敏， 管劉娟， 孫娟， 等. 耐藥性癲癇患兒外周血microRNAs的表達(dá)差異分析［J］. 中華實(shí)用兒科臨床雜志， 2022， 37（3）： 186-190.

［14］趙午駿， 黎瀚， 王彬， 等. 非編碼RNA在癲癇發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展［J］. 中華神經(jīng)科雜志， 2021， 54（1）： 48-54.

［15］王新宇， 郭沐潔， 聶瓊， 等. 分子影像技術(shù)在癲癇診治中的研究進(jìn)展［J］. 中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志， 2022， 31（5）： 474-479.

［16］CHEN T S， LAI M C， HUANG H Y I， et al. Immunity， ion channels and epilepsy［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（12）： 6446.