【關(guān)鍵詞】透明細胞腎細胞癌；脂代謝；α/β-水解酶結(jié)構(gòu)域5；遷移；侵襲

腎癌（renal cell carcinoma，RCC）是起源于腎小管上皮細胞的腺癌，也是常見的泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤之一，其最常見的病理類型為透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRcc），約占腎癌的75%～80%，超過30%的ccRcc病人初次就診已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，且遠處轉(zhuǎn)移預(yù)后極差。ccRcc作為RCC的主要亞型，細胞中含有高水平的甘油三酯和主要以膽甾醇酯形式存在的膽固醇。有研究表明，增加內(nèi)源性脂質(zhì)合成或外源性攝取對于腫瘤細胞生存和增殖是必需的，具體而言，脂質(zhì)代謝異常是ccRcc中最突出的變化之一，此外，脂質(zhì)代謝失衡可能與ccRcc侵襲有關(guān)[1]。

癌細胞代謝重編程被認為是癌癥的基本特征之一[2-4]，高度增殖的癌細胞表現(xiàn)出強烈的脂質(zhì)和膽固醇親和性，它們通過增加外源性脂質(zhì)和脂蛋白的攝取或過度激活它們的內(nèi)源性合成來滿足需求。脂代謝相關(guān)基因含α/β自水解酶結(jié)構(gòu)域５（α/β-hy?drolase domain-containing 5，ABHD5）既往被認為是脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）的輔因子，可協(xié)同ATGL水解甘油三酯，而近期研究發(fā)現(xiàn)ABHD5作為1個抑癌基因，在結(jié)腸癌中發(fā)揮重要的抑癌作用，其缺失后顯著促進結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[5-6]，并證實ABHD5可通過非經(jīng)典代謝途徑促進結(jié)腸癌的惡性進展和化療敏感性[7]，而ABHD5對ccRcc的生物學(xué)特性影響并沒有較多文獻報道，本研究利用數(shù)據(jù)庫分析、慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)、Transwell實驗、劃痕實驗等觀察ABHD5對ccRcc的作用及ccRcc細胞的體外遷移和侵襲的影響，探討ccRcc發(fā)生發(fā)展中新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人腎透明細胞癌786-O及Caki-1細胞株均購自iCell賽百慷，ABHD5 過表達慢病毒（pcSLenti-EF1-mCherry-P2APuro-CMV-ABHD5-3*FLAG-WPRE，病毒滴度：9.72×108 IU/mL）及對照（pcSLenti-EF1-mCherry-P2A-Puro-CMVMCS-3*FLAG-WPRE，病毒滴度：3.14×108 IU/mL）構(gòu)建自賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國）、McCoy’s 5A培養(yǎng)基、胎牛血清（南京生航生物技術(shù)有限公司）。Western及IP裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國上海）。ABHD5多克隆抗體、辣根酶標(biāo)記GAPDH單克隆抗體、辣根標(biāo)記Tubulin單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）、Sting單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）、Phospho-Sting多克隆抗體（江蘇親科生物研究中心有限公司）。辣根酶標(biāo)記羊抗兔（美國EarthOx Life Sciences公司）。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect RealTime）（Takara，日本）、實時熒光定量SYBR 染料ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 786-O細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，Caki-1 細胞使用含10% 胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)在5% CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)。轉(zhuǎn)染前，將狀態(tài)良好的目的細胞接種到24孔細胞培養(yǎng)板（每孔1.5×105個細胞），正常培養(yǎng)12 h后，按照賽業(yè)生物科技有限公司慢病毒使用說明推薦，每孔按MOI=10加入相應(yīng)的病毒體積轉(zhuǎn)染細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，并用嘌呤霉素進行篩選構(gòu)建慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。

1.2.2 蛋白免疫印跡實驗（Western blot） 收集細胞，加入適量裂解液提取總蛋白，利用BCA法對蛋白濃度進行定量，蛋白上樣量取15 μg，隨后使用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳；轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)至甲醇激活后的PVDF膜（默克公司、德國）上；TBST洗膜，5% BSA室溫封閉1 h，加入對應(yīng)的一抗（1∶1 000）后于恒溫搖床中4 ℃過夜；TBST洗3次膜，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗于室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，ECL化學(xué)發(fā)光法（江蘇親科生物研究中心有限公司）進行顯影。

1.2.3 RTq-PCR實驗 取收集的細胞樣本，加入Trizol充分裂解細胞，提取RNA并用Nanodrop測量其濃度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后用于后續(xù)熒光定量PCR反應(yīng)，加入2*ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。在實時熒光定量PCR儀中進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)的條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s；循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s；40 個循環(huán)。繪制溶解曲線?；虮磉_量采用2-ΔΔCt法進行分析。qPCR引物序列如下：ABHD5上游5’-TTTCTAGTAAGACGCCACTTGT-3’，下游5’-CATCACTGTCAAACCTAGGTCT-3’；GAPDH上游5’-CCGTAGACAAAATGGTGAAGGT-3’，下游5’-AACAATCTCCACTTTGCCACTG-3’；Cpt1a 上游5’-GCTGGCTTATCGTGGTGGT-3’，下游5’-CGCCACTCACGATGTTCTTC-3’；Lcad上游5’-TTCCTCGGAGCATGACATTTT-3’，下游5’-TGATGCCAAGCAAGCCCT-3’；Mcad上游5’-AGCAGAGAAGAAGGGTGACGAG-3’，下游5’-GGCTTCCACAATGAATCCAGTA-3’。

1.2.4 Transwell侵襲實驗 實驗在放有8 μm Transwell小室的24孔板中進行。4 ℃隔夜解凍基質(zhì)膠，并將膠、槍頭、離心管和Transwell 小室預(yù)冷，將Transwell 小室置于24 孔板內(nèi)，將8 μL 的基質(zhì)膠和64 μL無血清的培養(yǎng)基加入預(yù)冷的1.5 mL EP管中混勻，每孔60 μL加入上室，37 ℃敷箱3 h使膠凝固，敷育后吸取上室液體，加入100 μL無血清培養(yǎng)基進行基底膜水化并檢查是否有液體穿透;在24孔板下室內(nèi)加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。收集轉(zhuǎn)染后的對照及過表達細胞，無血清培養(yǎng)基重懸細胞后加入到Transwell小室內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后取出小室，棉簽輕輕擦拭掉上室內(nèi)細胞，4%多聚甲醛固定下層細胞20 min后用0.1%結(jié)晶紫染色液染色細胞10 min，棄去結(jié)晶紫后用PBS溶液洗2次，光學(xué)顯微鏡下觀察侵襲細胞數(shù)量，每張微孔膜隨機選3～5個視野進行細胞計數(shù)。

1.2.5 劃痕實驗 將786-O、Caki-1處于對數(shù)生長期的對照及ABHD5 過表達細胞使用0.25% 胰蛋白酶/EDTA 消化離心，使用含10%胎牛血清培養(yǎng)基重懸，充分吹打，單細胞懸液接種于6孔板中，每孔加入培養(yǎng)基1 h，過夜貼壁，待細胞融合至90% 時，使用10 μL 槍頭進行等寬劃痕，隨后加入PBS洗去細胞碎片，再加入1 mL無血清培養(yǎng)基于倒置顯微鏡下在不同的時間點拍照。結(jié)果使用Image J分析處理。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 ABHD5在ccRcc中的生信分析數(shù)據(jù)來源于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA，https：//www. cancer. gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）數(shù)據(jù)庫的ccRCC患者隊列，從TCGA官網(wǎng)下載患者轉(zhuǎn)錄組和臨床病理及隨訪信息進行分析。癌和癌旁表達差異分析以及ABHD5 與患者生存預(yù)后的關(guān)系用TCGA 在線分析網(wǎng)站GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）進行分析。免疫浸潤分?jǐn)?shù)計算來源于在線計算網(wǎng)站TIMER2.0（Tumor ImmuneEstimation Resource，http：//timer. comp-genomics. org/timer/）。正常腎臟與ccRcc的ABHD5蛋白的免疫組化染色數(shù)據(jù)來源于人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫（The Human Protein Atlas，HPA）（https：//www.proteinatlas.org/）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗結(jié)果均采用Graphpad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件分析，在經(jīng)過正態(tài)性和方差齊性驗證后，符合要求的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表達。兩獨立樣本t 檢驗用于比較2個樣本之間的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)來自3次獨立重復(fù)實驗（n=3）。檢驗水準(zhǔn)α=0.05

2 結(jié)果

2.1 ABHD5在正常腎臟組織及ccRcc組織差異表達

通過TCGA數(shù)據(jù)庫及The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，ccRcc中ABHD5表達較正常腎臟組織下降（圖1A、B），且其下降程度在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤中進一步增加（圖1C），與患者生存呈負相關(guān)（圖1D）。TCGA數(shù)據(jù)庫分析進一步提示，ccRcc 中ABHD5 缺失與抑制性免疫微環(huán)境密切相關(guān)，ABHD5低表達腫瘤中CD8+ T細胞數(shù)量及活性低于ABHD5高表達腫瘤（圖1E、F）。

2.2 對照及ABHD5過表達ccRcc癌細胞的構(gòu)建

為了進一步研究ABHD5對ccRcc細胞體外遷移及侵襲的影響，于體外對人ccRcc細胞786-O和Caki-1兩種細胞均轉(zhuǎn)染對照慢病毒（Control）和ABHD5過表達慢病毒（ABHD5OE），并利用Western blot驗證細胞內(nèi)ABHD5過表達情況，如圖所示，ccRcc 細胞786-O 和Caki-1中ABHD5的蛋白水平明顯升高（圖2A、B），并在mRNA水平對ABHD5過表達情況進一步進行驗證（圖2C、D）。

2.3 ABHD5過表達顯著抑制ccRcc細胞體外遷移及侵襲能力

本課題組進一步通過體外實驗驗證ABHD5過表達對ccRcc細胞遷移及侵襲能力的影響，通過劃痕實驗本研究發(fā)現(xiàn)，ABHD5過表達抑制ccRcc細胞體外遷移能力（圖3A、B）；通過Tranwell實驗發(fā)現(xiàn)，ABHD5過表達抑制ccRcc細胞體外侵襲能力（圖3C、D）。

2.4 ABHD5過表達不影響ccRcc細胞脂肪酸氧化相關(guān)基因的表達

ABHD5作為ATGL的重要輔因子，為了進一步研究其過表達是否影響ccRcc 細胞脂肪酸氧化能力，通過熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)，在ccRcc細胞786-O和Caki-1兩種細胞中，ABHD5過表達并未顯著影響ccRcc細胞脂肪酸合成及氧化相關(guān)基因的表達（圖4A、B）。

2.5 ABHD5過表達導(dǎo)致ccRcc細胞Sting信號的改變

Sting作為固有免疫的一個重要信號通路，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，在786-O細胞中，過表達ABHD5導(dǎo)致Sting信號的下調(diào)（圖5A），而在Caki-1細胞中，過表達ABHD5則會激活Sting信號（圖5B）。

3 討論

大多數(shù)癌細胞的代謝特征與正常組織完全不同，即使在有氧條件下，腫瘤細胞通過氧化磷酸化從線粒體ATP合成向高糖酵解率的轉(zhuǎn)變，長期以來被認為是癌癥的一個典型標(biāo)志，這被稱為Warburg效應(yīng)，這一效應(yīng)支持腫瘤細胞生物合成需求的增加，但研究發(fā)現(xiàn)各種癌癥自身能重新激活脂肪生成，使它們不依賴于外部提供的脂質(zhì)[8]，并且在大多數(shù)癌癥中，即使沒有明顯的脂質(zhì)積累，也存在脂質(zhì)代謝的各種改變[9]，脂質(zhì)代謝的改變對腫瘤的進展至關(guān)重要，部分因為建立新細胞膜對磷脂的需求增加，但也因為代謝變化有利于腫瘤生長的其他方面以及癌細胞和腫瘤微環(huán)境中的促癌信號。

ccRcc的“透明細胞”（或空細胞質(zhì)）外觀特征是由于細胞內(nèi)大量脂質(zhì)和一些糖原的積累[10]。這些大的脂質(zhì)庫表明，脂質(zhì)代謝重編程是透明細胞腎細胞癌的一個中心特征，且有研究表明，ccRcc細胞中中性脂質(zhì)（甘油三酯）、膽固醇、膽固醇酯的含量遠高于正常組織[11]，但脂質(zhì)積累在透明細胞腎細胞癌的生物學(xué)和發(fā)病機制中所發(fā)揮的作用仍不完全清楚。有研究者先前已經(jīng)證明，ABHD5缺失會促進有氧糖酵解，并刺激前列腺癌和結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲[5，12]。令人驚訝的是，ATGL（ABHD5的主要靶標(biāo)）的敲低則抑制了細胞增殖和遷移[5，12]，ABHD5 和ATGL 是否能相互作用來調(diào)節(jié)癌癥細胞的脂質(zhì)代謝。雖然ABHD5作為脂代謝相關(guān)基因，輔助ATGL水解甘油三酯，但本課題組通過實驗發(fā)現(xiàn)ABHD5過表達后并未顯著影響ccRcc細胞脂肪酸氧化關(guān)鍵基因的表達[13]，提示ABHD5可能具有獨立于ATGL的功能活性，ABHD5可能通過其非經(jīng)典代謝途徑發(fā)揮抑癌作用。

Sting通路是對病毒和細菌免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并有助于抗腫瘤免疫。因此本研究聚焦于Sting信號的變化，有趣的是，在786-O（人腎透明細胞癌）細胞中，過表達ABHD5 導(dǎo)致Sting 信號的下調(diào)，而在Caki-1（人腎透明細胞癌皮膚轉(zhuǎn)移細胞）中，過表達ABHD5則激活了Sting信號。由于Sting信號在腫瘤中發(fā)揮“雙刃劍”的作用，有研究表明，在ccRcc中，Sting基因擴增和mRNA水平增高，其缺失導(dǎo)致線粒體功能障礙，抑制腎癌細胞的生長[14]；而Sting信號的激活亦可在抑制休眠癌細胞發(fā)展為侵襲性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并可作為對抗癌細胞轉(zhuǎn)移進展的檢查點[15]。因此，從本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種不同來源的癌細胞在ABHD5的影響下，導(dǎo)致Sting信號發(fā)揮其“雙刃劍”作用，進而影響兩種癌細胞的遷移及侵襲。

在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中，免疫微環(huán)境的重編程具有重要作用，抑制性免疫微環(huán)境是導(dǎo)致ccRcc惡性進展的重要原因。大量的免疫抑制性細胞，包括調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor as?sociated macrophagy，TAM）、骨髓源性抑制細胞等廣泛浸潤及殺傷性T 細胞（CD8+T）細胞功能失活是ccRcc抑制性免疫微環(huán)境的主要特征。本研究結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，ABHD5與ccRcc免疫微環(huán)境浸潤的抗原呈遞細胞，如樹突狀細胞（dentritic cell，DC），及CD8+T細胞密切相關(guān)，提示ABHD5會影響ccRcc腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤，其缺失后引起CD8+T細胞殺傷活性顯著下降，導(dǎo)致抑制性免疫微環(huán)境的形成，促進ccRcc的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果首次揭示，ABHD5在ccRcc的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用，體外過表達ABHD5可以影響Sting信號進而在體外抑制786-O和Caki-1癌細胞遷移及侵襲，故ABHD5可能作為ccRcc早期診斷及精準(zhǔn)治療的重要指標(biāo)，且可能是ccRcc治療的重要潛在靶點。