[摘 " 要] " 目的：探討缺氧和鐵死亡相關(guān)基因?qū)Ψ蜗侔┑念A后價值，構(gòu)建預測肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）患者預后的列線圖模型。方法：從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫識別缺氧和鐵死亡相關(guān)肺腺癌預后差異表達基因，利用LASSO-Cox回歸構(gòu)建基因風險評分系統(tǒng)，進一步構(gòu)建肺腺癌預后模型，分別使用校準曲線、受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析、決策曲線分析評價其預測效果。采用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）檢測LUAD與癌旁組織中風險差異基因的表達水平。結(jié)果：成功構(gòu)建了8基因風險評分系統(tǒng)，建立了可有效預測LUAD患者預后的列線圖模型，具有良好的預測效果。LUAD組織中核心蛋白聚糖（decorin，DCN）和血小板衍生生長因子 B 亞基（platelet derived growth dactor subunit B，PDGFB）明顯下調(diào)，二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）、巨噬細胞移型抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）、核糖核苷酸還原酶調(diào)節(jié)亞基M2（ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM2）和溶質(zhì)載體家族2（solute carrier family 2 member 1，SLC2A1）明顯上調(diào)（均P＜0.05）。結(jié)論：本研究構(gòu)建的預測肺腺癌患者預后的列線圖模型可為個性化治療提供參考。

[關(guān)鍵詞] " 肺腺癌；缺氧；鐵死亡；預后模型

[中圖分類號] " R734.2 [文獻標志碼] " A [DOI] " 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.06.001

Construction of a Prognostic Model for Lung Adenocarcinoma Based

on Hypoxia- and Ferroptosis-Related Genes

WU Meng1， WANG Hongbing2

（1Department of Tumor Chemotherapy， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001;

2Department of Medical Oncology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University）

[Abstract] " Objective： To explore the prognostic value of hypoxia- and ferroptosis-related genes in lung adenocarcinoma （LUAD） and construct a nomogram model for predicting the prognosis of patients with LUAD. Methods： Hypoxia- and ferroptosis-related differentially expressed genes in lung adenocarcinoma were identified from the cancer genome atlas （TCGA） database. A gene risk scoring system was constructed "using LASSO-Cox regression， followed by the construction of a prognostic model for lung adenocarcinoma. The predictive effect of the model was evaluated through calibration curve， receiver operating characteristic （ROC） curve， and decision curve analysis. Quantitative reverse transcription PCR （RT-qPCR） was used to verify the differential expression of risk genes between LUAD tissues and the adjacent normal tissues. Results： An eight-gene risk scoring system and a nomogram model for predicting the prognosis of LUAD patients were constructed， demonstrating good predictive effect. The expression of decorin （DCN） and platelet derived growth factor subunit B （PDGFB） decreased obviously， and the expression of dipeptidyl peptidase 4 （DPP4）， macrophage migration inhibitory factor （MIF）， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）， lactate dehydrogenase A （LDHA）， ribonucleotide reductase regulatory subunit M2 （RRM2）， and solute carrier family 2 member 1（SLC2A1） increased significantly （Plt;0.05）. Conclusion： This nomogram model for predicting the prognosis of lung adenocarcinoma patients constructed in this study can provide reference for personalized treatment.

[Key words] " lung adenocarcinoma; hypoxia; ferroptosis; prognostic model

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）約占肺癌的65%[1]。隨著疾病篩查及診療手段的提高，患者生存時間得到一定延長，但總體預后不容樂觀。臨床上常根據(jù)腫瘤分期及單基因預測患者預后，制定治療方案，但往往與實際情況相差較大。由于腫瘤快速、不受控制增殖，導致耗氧與供氧的失衡，缺氧是實體瘤微環(huán)境的典型特征之一。既往研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可能提高腫瘤的侵襲性，并導致對治療的抵抗[2]。另外，鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的鐵依賴的由脂質(zhì)過氧化和活性氧積累引起的程序性細胞死亡形式[3]。相關(guān)研究表明，缺氧與鐵死亡存在一定的聯(lián)系，F(xiàn)UHRMANN等[4]發(fā)現(xiàn)缺氧抑制鐵蛋白吞噬作用，從而增加線粒體鐵蛋白，防止鐵死亡的發(fā)生；YANG等[5]發(fā)現(xiàn)，腫瘤缺氧微環(huán)境以缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）依賴的方式促進實體瘤對鐵死亡的抵抗。HIF-1α與在缺氧下促進腫瘤鐵死亡的HIF-2α結(jié)合可能是缺氧誘導鐵死亡抵抗的主要驅(qū)動因素。本研究旨在探討缺氧聯(lián)合鐵死亡相關(guān)基因在LUAD中的預后價值，構(gòu)建預測肺腺癌患者預后的列線圖模型。

1 " 資料與方法

1.1 " 資料來源 " 本研究共納入3個獨立隊列，包括1個癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）隊列（n=509）和2個基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（gene erpression omnibus，GEO）隊列：GSE 68465（n=442）和GSE 72094（n=398）。將TCGA隊列作為訓練集，GEO隊列作為外部驗證集。其中GSE 68465數(shù)據(jù)集僅涉及是否化療，并未詳細描述具體化療方案，而GSE 72094未公布任何治療相關(guān)信息，因此本研究模型構(gòu)建未納入腫瘤治療相關(guān)信息。

1.2 " 風險評分系統(tǒng)的構(gòu)建和驗證 " 在TCGA隊列中，使用R語言“l(fā)imma”包識別缺氧和鐵死亡相關(guān)差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），閾值設(shè)置為Log2（差異倍數(shù)）gt;1且偽發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate，F(xiàn)DR）lt;0.05。采用單因素Cox回歸分析篩選預后基因。利用LASSO-Cox回歸分析在TCGA隊列中選擇具有較高預后價值的DEGs，構(gòu)建風險評分系統(tǒng)。根據(jù)各基因歸一化表達水平及其對應(yīng)的回歸系數(shù)計算患者的風險評分，風險評分=各基因表達量×對應(yīng)系數(shù)。根據(jù)風險評分中位數(shù)，將納入患者分為高風險組和低風險組。使用R語言“survival”和“survminer”包進行Kaplan-Meier生存分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估風險評分系統(tǒng)的預測能力。以同樣的分析方法在2個GEO隊列（外部驗證集）中驗證風險評分系統(tǒng)的穩(wěn)健性。通過Cox回歸分析檢驗風險評分是否可以作為LUAD獨立預后標志。

1.3 " 列線圖預后模型的構(gòu)建和驗證 " 基于多因素Cox回歸分析中的獨立風險因素，構(gòu)建個體化預測LUAD患者1年、2年及3年生存概率的列線圖模型，通過校準曲線、ROC曲線及曲線下面積（area under curve，AUC）、決策曲線分析（decision curve analysis，DCA）評估模型的準確性和臨床應(yīng)用價值。

1.4 " 定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR） " 經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核同意，患者簽署知情同意書，收集徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院手術(shù)治療的20例LUAD患者的新鮮腫瘤組織和配對癌旁組織標本，每份標本50～100 mg，采用RT-qPCR檢測組織中風險差異基因的表達水平。

1.5 " 統(tǒng)計學處理 " 使用R軟件（4.0.3版）進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析。腫瘤組織與癌旁正常組織間基因表達水平比較采用t檢驗。通過對數(shù)秩檢驗（Mantel-Cox）和Kaplan-Meier（KM）生存分析比較兩個風險組的生存時間。使用單因素和多因素Cox回歸模型篩選預后相關(guān)因素。分別使用校準曲線、ROC曲線、DCA分析評價其預測效果。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 " 結(jié) " " "果

2.1 " 3個獨立隊列LUAD患者臨床特征 " 見表1。

2.2 " 缺氧和鐵死亡相關(guān)預后DEGs的識別 " 在TCGA隊列中，識別出59個與缺氧和鐵死亡相關(guān)的DEGs和76個預后相關(guān)基因，兩者交集后得到預后DEGs，經(jīng)癌癥和正常基因表達譜分析及交互分析網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器（web server for cancer and normal gene expression profiling and interaction analysis，GEPIA）及Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫驗證，確認17個缺氧和鐵死亡相關(guān)預后DEGs。見圖1。

2.3 " 風險評分系統(tǒng)的構(gòu)建 " LASSO-Cox回歸分析得到8基因風險評分系統(tǒng)：0.067×GAPDH+0.349×LDHA+0.002×MIF+0.153×PDGFB+0.088×RRM2+0.002×SLC2A1-0.046×DCN-0.007×DPP4（基因表達值）。

2.4 " 風險評分系統(tǒng)預測性能驗證 " TCGA隊列中，低風險組患者生存時間明顯長于高風險組患者，ROC曲線1年、2年和3年AUC分別為0.677、0.701和0.712。風險評分和生存時間分布情況顯示，高風險組生存時間普遍較低風險組短，與Kaplan-Meier生存分析結(jié)果一致。主成分分析（principal component analysis，PCA）和t分布隨機鄰近嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）分析表明，風險評分可很好區(qū)分高低風險。對GSE 68465隊列中442例患者使用與TCGA隊列相同的公式計算風險評分值，獲得的結(jié)果與TCGA隊列相似，ROC曲線1、2和3年AUC分別為0.715、0.694和0.681。對GSE 72094隊列中398例患者使用與TCGA隊列相同的公式計算風險評分值，與TCGA 隊列、GSE 68465隊列的結(jié)果相似，ROC曲線1、2和3年AUC值分別為0.674、0.664和0.635。

2.5 " 風險評分系統(tǒng)獨立預后價值 " 單因素Cox回歸分析顯示，風險評分對總生存率（overall survival，OS）的影響有統(tǒng)計學意義（HR=3.832，95%CI=2.550～5.758，Plt;0.001）。在GSE 68465隊列（HR=3.985，95%CI=2.252～7.050，Plt;0.001）和GSE 72094隊列（HR=6.577，95%CI=3.094～13.983，Plt;0.001）中驗證，獲得相同的結(jié)果。在TCGA隊列中，多因素Cox 回歸分析仍然證明風險評分是OS的獨立影響因素（HR=3.443，95%CI=2.263～5.238，Plt;0.001）。同樣，該結(jié)果在GSE 68465隊列（HR=3.969，95%CI=2.241～7.030，Plt;0.001）和GSE 72094隊列（HR=4.894，95%CI=2.262～10.591，Plt;0.001）中得到驗證。

2.6 " 構(gòu)建預測LUAD患者生存情況的列線圖模型 " 為了將8基因特征風險評分的預后價值轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，基于多因素Cox回歸分析中的獨立風險因素（包括風險評分及TNM分期），構(gòu)建一個可以預測LUAD患者1年、2年及3年生存概率的列線圖模型（圖2）。讀取列線圖時需向上畫垂直線即可得到各風險因素對應(yīng)的分值，把兩項分值相加并在總分刻度尺上標記其對應(yīng)的位置，向下畫垂線即可分別得到1年、2年和3年的生存概率。

2.7 " 列線圖模型的驗證 " 校準曲線分別比較1年、2年和3年列線圖模型預測生存概率與Kaplan-Meier分析得到的實際生存概率，結(jié)果顯示，預測生存概率與實際生存概率高度一致，說明本模型準確度高。列線圖模型ROC曲線顯示1年、2年、3年的AUC值分別為0.703、0.735和0.748，表明本模型預測性較好，區(qū)分度高，具有良好的預測價值。DCA分析表明列線圖模型即TNM分期聯(lián)合基因模型在更大的閾概率范圍內(nèi)獲得了較兩者單獨應(yīng)用更高的凈收益率，為患者帶來更大獲益，見圖3。

2.8 " 實驗驗證 " RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相較于癌旁正常組織，LUAD組織中DCN和PDGFB基因明顯下調(diào)，DPP4、MIF、GAPDH、LDHA、RRM2和SLC2A1基因明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

3 " 討 " " "論

缺氧和鐵死亡在腫瘤發(fā)展中起著重要作用[6]，缺氧通過誘導多種信號通路促進癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。鐵死亡作為一種新型程序性細胞死亡形式，主要通過鐵依賴性脂質(zhì)過氧化來執(zhí)行，可能作為肺癌潛在的治療靶點[8-9]。本研究構(gòu)建基于缺氧和鐵死亡相關(guān)基因的肺腺癌預后列線圖模型，顯示出良好的預測性能，可有效地區(qū)分高風險和低風險患者，通過驗證集進一步證明模型的穩(wěn)健性。本模型不僅可以為臨床醫(yī)生提供有價值的預后信息，還有助于制定個性化的治療策略，針對缺氧和鐵死亡途徑的靶向治療可能為高風險患者提供新的治療選擇。

盡管本模型在驗證集中表現(xiàn)良好，但仍存在一些局限性。首先，本研究主要基于公開數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，可能存在選擇偏倚。其次，在臨床實踐中常以TNM分期作為預后及后續(xù)治療的重要參考因素，本研究雖納入TNM分期構(gòu)建模型，但獲取的數(shù)據(jù)有限，也未納入治療相關(guān)信息。未來應(yīng)開展大規(guī)模的多中心大樣本臨床研究以及深入的分子機制研究，進一步驗證和完善預后模型。

總之，本研究成功構(gòu)建了新的8基因風險評分系統(tǒng)，并在此基礎(chǔ)上建立了可有效預測LUAD患者預后的列線圖模型，為患者個性化治療提供參考。

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[收稿日期] 2024-11-12

（本文編輯 " 王曉蘊）