楊江流 海珍珍 賈芳 周學章

摘要：細菌對抗生素的多重耐藥和交叉耐藥亟需聯(lián)合其他有效的靶向替代策略進行控制。碳酸酐酶（carbonic anhydrases，CAs）是催化CO2水合生成HCO3-和H+的可逆反應的一組金屬酶超家族，其活性影響細菌的增殖、生物合成及其在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染。靶向抑制CAs活性可降低細菌的生存和適應性，并且不會產(chǎn)生與傳統(tǒng)抗生素相同的耐藥性。細菌CAs有望成為開發(fā)尚無臨床耐藥性的新型抗菌藥物靶標。本文對細菌CAs的分類和結構、生理功能以及細菌現(xiàn)有的CA抑制劑（CA inhibitors，CAIs）的研究進展進行了綜述，可為新型抗菌藥物研發(fā)、解決臨床耐藥問題提供參考。

關鍵詞：細菌碳酸酐酶；抑制劑；細菌耐藥性；控制

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Inhibition of bacterial carbonic anhydrase as a new strategy to combat bacterial drug resistance

Abstract Bacterial multi-resistance and cross-resistance to antibiotics urgently need to be controlled in combination with other effective targeted alternative strategies. Carbonic anhydrase （CAs） is a metalloenzyme superfamily that catalyzes the reversible reaction of CO2 hydrating to HCO3- and H+， and its activity affects bacterial proliferation， biosynthesis and persistent infection of pathogens in the host. Targeted inhibition of CAs activity may reduce bacterial survival and adaptation， but it does not produce the same antibiotic resistance as conventional antibiotics. Bacterial CAs hold promise as targets for the development of novel antibacterial drugs that are not yet clinically resistant. The paper provided reviews of the classifications and structures of bacterial CAs， their physiological functions， and the progress of research on existing CA inhibitors in bacteria， which can provide a reference for the development of new antibacterial drugs and solve clinical drug resistance problems.

Key words Bacteria carbonic anhydrase; Inhibitors; Bacterial resistance; Control

近幾十年，抗生素耐藥性在致病菌中的出現(xiàn)和傳播已成為一個日益嚴峻的公共衛(wèi)生問題。由于細菌對已知的所有抗生素都可能存在耐藥，導致常規(guī)治療對耐藥細菌引起的感染通常沒有作用，甚至對“最后一道防線” 抗生素也失去了效力。而目前抗生素研發(fā)投資的下降和新抗生素開發(fā)的創(chuàng)新不足[1]，迫切需要人們利用系統(tǒng)生物學、基因組學和結構生物學的方法重新理解細菌耐藥的分子機制，利用有關抗生素耐藥性的新知識指導設計不受或規(guī)避耐藥機制影響的新型治療藥物[2]。

對抗耐藥性的一個可行的方法是鑒定對病原微生物的生命周期和/或毒力至關重要的酶，并開發(fā)能夠干擾其活性的分子[3-4]。碳酸酐酶（CAs，EC 4.2.1.1）是一組金屬酶超家族，其活性影響細菌的增殖、生物合成及其在宿主體內(nèi)的持續(xù)感染[5]。通過抑制CA活性可能會降低細菌的生存和宿主適應性，而且不會產(chǎn)生與傳統(tǒng)抗生素相同的耐藥性。另外，由于許多細菌CAs屬于不同的酶家族，這些酶家族有的在人類中不存在（如β-和γ-CAs），或者與人類CAs亞型具有明顯的結構差異[6]。因此，細菌CAs可能成為開發(fā)不產(chǎn)生臨床耐藥性的新型抗菌藥物有希望的目標。本文對細菌CAs的結構、功能及現(xiàn)有的細菌CAIs進行了總結，可以為CAs作為對抗抗生素耐藥性的一種新策略提供參考。

1 CAs概況

CAs于1933年由Meldrum和Roughton在研究血液CO2/碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運的實驗中發(fā)現(xiàn)，他們注意到生物體內(nèi)大量代謝生成的CO2在體外生理pH值下顯示相對較低的水合速率，暗示應該有一種高效的催化劑使這兩種物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化[5]。這種催化劑后來被證明是一種金屬酶，并被命名為碳酸酐酶（CAs）。CAs普遍存在于生命體的3個領域（古細菌、細菌和真核生物）（表1）。在細胞中，CAs位于不同的亞細胞區(qū)室（例如，細胞質(zhì)、周質(zhì)、鞭毛、線粒體和質(zhì)體）中，可高效（kcat=104～106 /s）催化CO2水合生成碳酸氫鹽和質(zhì)子這種簡單但生理上至關重要的反應：CO2+H2O?HCO3?+H+，在生物體pH調(diào)控、呼吸、光合作用和碳代謝相關的多種生物過程中發(fā)揮關鍵作用[6]?，F(xiàn)已確定的CAs家族分為α、β、γ、δ、ζ、η、θ和ι[7-8]8類，雖然8類CAs在進化上起源于同一祖先，但它們在系統(tǒng)發(fā)育上是不相關的，表現(xiàn)為不同類別CAs的代表性氨基酸序列顯示出低序列相似性和不同的折疊結構。相比之下，CO2可逆水合的機制在所有CA類別中則嚴格保守，包括參與CA輔因子的金屬離子、催化位點的氨基酸序列以及其低聚狀態(tài)。說明CA超家族具有普遍的收斂進化（convergent evolution）特征[9-11]。

CA催化位點包含的催化所必需的金屬離子輔因子由來自CA蛋白質(zhì)骨架的3個氨基酸殘基和1個H2O/OH-配位（H2O/OH-在酶的可逆催化中充當親核試劑）組成。大多數(shù)CAs使用Zn2+作為金屬輔助因子，一些CAs也可以配位如Co2+、Cd2+、Fe2+和Mn2+等金屬離子[5，7，12-13]

（表1）。另外，參與金屬配位的氨基酸殘基在CA類之間存在差異。例如，由3個His殘基配位的α-、γ-、δ-和θ-CAs；由1個His和2個Cys殘基配位的β-和ζ-CAs；而在η-類中由2個His和1個Gln殘基配位[13-14]。在硅藻ι-CAs中，參與Mn2+配位的假定殘基是2個His、1個Asp和1個Glu，但Mn2+是否具有催化作用尚未明確[15]。

CAs晶體結構顯示，α-CAs通常以單體或二聚體形式發(fā)揮催化活性；β-CAs作為二聚體、四聚體或八聚體時具有活性；γ-CAs必須以三聚體形式實現(xiàn)其催化功能，且γ-CAs單體中串聯(lián)重復的六肽對于三聚體中β螺旋結構的左手折疊至關重要[16-18]；θ-CAs的X射線結構與β-CAs非常相似；ζ-CAs被認為是由3個重復序列（R1、R2和R3）通過共價鍵連接形成可能的單體結構，每個重復序列都含有自己的活性位點，Zn2+和Cd2+可以在ζ-CAs的活性位點自發(fā)交換以適應海洋的貧金屬環(huán)境[19]（表1）。目前還缺乏關于δ-和η-CAs的結構信息。另外，α-、η-、θ- 和ι-CAs可催化酯/硫酯水解的酯酶活性，而在其他CAs家族中沒有檢測到[7，13]。

2 細菌CAs的分類和結構

在尋找具有新作用機制抗生素的過程中，人們開始對病原菌生命周期至關重要的CAs進行了詳細研究。近幾年對引起嚴重感染的大多數(shù)細菌病原體CAs克隆并進行了鑒定和表征。目前已知的4類細菌CAs包括α-、β-、γ-和ι-CAs，具有前文述及的CAs的普遍結構特征。以下結合每類具有代表性的細菌病原體CAs進行總結。

2.1 α-CAs

已發(fā)現(xiàn)的細菌α-CAs僅存在于革蘭陰性菌基因組中[11]。細菌α-CAs的一個共同特征是在氨基酸序列的N末端存在分泌信號肽，該信號肽允許α-CAs在細胞周質(zhì)定位。近幾年，來自淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）、干燥奈瑟菌（Neisseriaceae sicca）、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）和霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的α-CA已經(jīng)被克隆，并對其進行了詳細描述。淋病奈瑟菌α-CA（α-NgCA）的分子量為28 kDa，與人CA II（hCAII）高度同源，兩者具有基本相同的三維結構，α-NgCA中僅有的2個Cys殘基通過二硫鍵連接并在細胞周質(zhì)定位。α-NgCA多以單體形式存在，顯示出高CO2水合酶活性（類似于hCA II）以及水解對硝基苯乙酸酯的酯酶活性[21-22]。hCAII活性位點中的所有氨基酸殘基在α-NgCA中都是保守的，并且具有相似的結構位置。α-NgCA的金屬輔因子Zn2+位于酶活性位點疏水腔的底部，可由3個His殘基和磺酰胺部分的N原子（或可由未受抑制的酶中的水分子）四面體配位（圖1A）。與其他細菌α-CAs一樣，α-NgCA少數(shù)螺旋區(qū)域的長缺失導致結合Zn2+的3個表面顯著縮短，使活性位點腔疏水部分的入口擴大[21]。因此，與哺乳動物α-CAs相比，細菌α-CAs顯示出更緊湊的結構。細菌CAs的三維結構顯示，α-CAs的催化口袋較β-CAs大，γ-CAs最?。毦?CAs尚無晶體結構）。因此，α-CAs的催化效率比β-CAs和γ-CAs的要高[11，23-24]，

而一些細菌γ-CAs的催化轉(zhuǎn)換數(shù)（Kcat）高于β-類，例如牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）和霍亂弧菌γ-CA的Kcat值高于其對應菌β- CA的Kcat值[25-26]。

2.2 β-CAs

在一些缺乏α-CAs的革蘭陰性細菌中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在β-、γ-和ι-CAs。X射線晶體已經(jīng)解析了如大腸埃希菌（Escherichia coli）、流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）、結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）、類鼻疽伯克霍爾德菌（Burkholderia pseudomallei）和霍亂弧菌以及其他幾種細菌的β-CA[16， 27-31]。這些酶的三維結構相當保守，目前發(fā)現(xiàn)的所有結晶的細菌β-CAs都具有二聚體或四聚體活性。與α-和γ-CAs不同的是，β-CAs類的成員具有顯著的α螺旋特性，酶的活性位點呈現(xiàn)出一個相當長的通道，通道底部的Zn2+由一組不同的氨基酸殘基配體進行四面體配位[32]（圖1B）。β-CAs的活性高度依賴于細菌生理pH值，當pH值<8.3時，酶活性位點處于封閉狀態(tài)（“封閉活性位點”），酶無催化活性；當pH值＞8.3時，“封閉活性位點”轉(zhuǎn)化為有催化活性的“開放活性位點”， 酶催化活性增加；pH值接近9.0時顯示出最大活性。這與β-CAs中Zn2+結合的保守Asp殘基的移動以及水分子與Zn2+的配位有關。

大多數(shù)細菌β-CAs表現(xiàn)出優(yōu)異的CO2水合酶活性，但缺乏酯酶活性，類似于從其他生物體（植物、節(jié)肢動物等）分離的β-CAs。從病原體中克隆、純化并鑒定的相當數(shù)量的β-CAs可以在體外被磺胺類藥抑制（可達低納摩爾范圍）[6]。然而，在體內(nèi)僅可觀察到幽門螺桿菌、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、豬布魯菌（Brucella suis）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的生長被抑制[33-35]。

2.3 γ-CAs

在古細菌中，F(xiàn)erry小組首次報道了來自嗜熱甲烷八疊球菌（Methanosarcina thermophila）的γ-CA（carbonic anhydrase methanosarcina，Cam），Cam采用左旋的平行β螺旋折疊形成活性三聚體，3個含Zn2+的活性位點位于2個單體之間的界面，1個Glu殘基（α-CAs中為His殘基）作為質(zhì)子穿梭殘基（proton shuttle residue，PSR） 將催化過程中產(chǎn)生的質(zhì)子轉(zhuǎn)移出活性位點[36]。盡管γ-CAs類成員間具有顯著的結構相似性，但這些蛋白質(zhì)顯示出從非活性CA（如流產(chǎn)布魯菌的γ-CA和嗜熱桿菌HB8 γ-CA）到強活性CA（如Cam）完全不同的催化活性水平[37]。這些密切相關的蛋白質(zhì)活性差異的分子基礎尚不清楚，γ-CAs的功能在很大程度上仍未確定[38]。

類鼻疽伯克霍爾德菌是1種廣泛存在于環(huán)境和人體中的革蘭陰性菌，感染人類可引起類鼻疽。該菌對多種抗生素存在廣泛耐藥性。最近對來自類鼻疽伯克霍爾德菌的γ-CA（BpsγCA）進行了晶體學結構表征，BpsγCA表現(xiàn)出與先前表征的其他γ-CA家族成員相似的結構[37]。BpsγCA具有非常穩(wěn)定的三聚體結構，每個單體結構由1個左旋平行β螺旋、1個反平行β鏈和1個與β螺旋軸反平行的長α螺旋組成（圖1C）。在單體-單體之間的界面上具有3個活性位點，每個活性位點都包含一個由3個His殘基和1個H2O/OH-進行四面體配位的Zn2+。研究發(fā)現(xiàn)，2-β-巰基乙醇（BME）分子可以通過氫鍵固定在與Zn2+結合的水分子上，使BME位于BpsγCA活性位點的碳酸氫鹽結合口袋處[37]。這一發(fā)現(xiàn)，以及結合幾種hCA抑制劑（如酚、羧酸和多胺）可以錨定在Zn2+配位的水分子上的抑制機制，可能為BpsγCA的選擇性抑制劑的設計提供思路。

2.4 ι-CAs

2019年，Jensen等[7]在研究硅藻Thalassosira pseudonana的基因組時首先發(fā)現(xiàn)了ι-CA（LCIP63-ιCAs），LCIP63-ιCAs的同系物在其他硅藻、藻類、細菌和古細菌的基因組中也被發(fā)現(xiàn)。LCIP63-ιCAs及其同系物顯示出與先前鑒定的任何已知CA類完全不同的一級序列和催化所必需的相同的保守氨基酸殘基。細菌ι-CAs的多肽鏈在N末端呈現(xiàn)出19個或更多氨基酸殘基的前肽序列，并包含一個或兩個重復的結構域。氨基酸序列與一組注釋為SgcJ/EcaC氧化還原酶家族的蛋白質(zhì)同源，具有疏水口袋，可以構成假定的底物結合或催化活性位點。值得注意的是，在所有ι-CAs的C末端結構域中存在（H）HHSS氨基酸殘基基序，可能是ι-CAs的一個特定結構特征[15]。

2020年，Del Prete等[20]在領地伯克霍爾德菌（Burkholderia territorii）基因組中鑒定了重組ι-CA（BteCAι）。BteCAι可以以二聚體形式存在，是CO2水合成碳酸氫鹽和質(zhì)子的良好催化劑。結構預測模型表明，BteCAι由2個等效單體形成，表現(xiàn)為“蝴蝶”結構，其中Zn2+活性位點的離子輔因子可能由1個單體的2個His和另1個單體的1個His配位。BteCAι對磺胺、氨基磺酸鹽和磺酰胺的抑制敏感（圖1D）。

3 細菌CAs的生理功能

在細菌中，CAs催化的反應是唯一已知的快速獲得和平衡內(nèi)源性CO2、H2CO3、HCO3-和CO32-的途徑[10]。憑借其催化活性，CAs為細菌生物合成提供不可或缺的CO2和碳酸氫鹽，確保微生物的生存和/或滿足微生物的代謝需求。體內(nèi)實驗已證明，大氣CO2濃度下的細菌生長取決于細菌CAs的活性。羅氏真養(yǎng)菌（Ralstonia eutropha， 一種在土壤和水中發(fā)現(xiàn)的兼性化能自養(yǎng)菌）Δcan（can編碼β-CA）突變株25-1與野生株H16相比，僅在CO2濃度升高的情況下允許異養(yǎng)生長（高CO2需求表型），表明細菌在低CO2濃度下的生長需要足夠的CA活性[40]。大腸埃希菌中的兩種β-CA（CynT和CynT2）均可催化CO2生成HCO3-，以防止在大氣CO2濃度下氰酸鹽依賴性碳酸氫鹽水解和細菌膨脹導致的碳酸氫鹽耗竭[41]。布魯菌屬和立克次體屬細菌[42]、流感嗜血桿菌[43]以及結核分枝桿菌[44]中的CA基因缺失使得它們只能適應高CO2水平的生態(tài)位。幽門螺桿菌基因組編碼的CA對胃內(nèi)病原體的酸適應和生存至關重要[45]。

體內(nèi)證據(jù)表明CAs還參與了人類致病菌（如霍亂弧菌[46]、豬布魯菌[47]、腸炎沙門菌[48-49]、銅綠假單胞菌[50]和腸球菌[35]等）的致病性和毒力。研究表明，碳酸氫鹽通過上調(diào)霍亂弧菌ToxT（一種直接激活編碼霍亂毒素活性的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白）來刺激霍亂毒素毒力基因的表達[11]，CAIs的加入可顯著降低毒力基因表達。HCO3-在被霍亂弧菌定植的小腸上部以高濃度存在，表明霍亂弧菌可能使用CA作為一種宿主定植系統(tǒng)并增強細菌毒力[51]。當腸道血清型鼠傷寒沙門菌感染巨噬細胞時，預測的細菌β-CA基因（mig5）上調(diào)，該基因編碼的蛋白質(zhì)參與了小鼠腸道細菌定植的適應[48]。銅綠假單胞菌在感染過程中可能導致軟組織鈣化或結石形成，引發(fā)囊性纖維化和感染性心內(nèi)膜炎。研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌攜帶的β-CA（psCA1）在細胞CaCO3沉積中起主要作用。psCA1基因的缺失顯著降低了細胞周圍的鈣沉積，同時減弱了病原體的毒力（與感染野生型銅綠假單胞菌相比，感染ΔpsCA1突變體的蠟蟲未觀察到死亡）。另外，氨基苯磺酰胺和乙酰唑胺（AAZ）在納摩爾水平上可抑制psCA1活性，顯著減少CaCO3的沉積[50]。

4 細菌CAIs種類

目前已在多種細菌病原體中鑒定出屬于α-、β-和/或γ-CA類的CAs[11]，而在已知的8類CA中，只有α-CAs存在于人類[52]。基于這一結果，β-和γ-CAs已被列為潛在的新型抗菌藥物靶標。文獻報道細菌CAs可被磺胺類及其等排物、陰離子、二硫代氨基甲酸酯鹽類和羧酸類等化合物抑制[53-54]。

4.1 磺胺類藥及其等排物

從發(fā)現(xiàn)磺胺作為抑菌劑開始，一系列磺胺類抗菌藥物已進入臨床應用，其中許多化合物仍被廣泛使用?；前芳捌涞扰盼铮ㄈ绨被撬猁}和磺酰胺）具有結構通式A-SO2NH-R[A可以是脂肪族、芳香族、雜環(huán)基團或糖支架，R可以是氫（伯磺胺/氨基磺酸鹽/磺酰胺），或包含雜原子的多個部分（如-OH、-NH2等），以及如A所述的有機支架]。包含伯磺胺部分（-SO2NH2）的磺胺及其等排物以四面體幾何結構結合到CAs去質(zhì)子化的Zn2+上（其中磺胺部分的氮原子與Zn2+配位），CAs氨基酸殘基參與錨定抑制劑以形成擴展的氫鍵網(wǎng)絡，芳香族/雜環(huán)部分與酶活性中心空腔的親水和疏水殘基相互作用，進而特異地抑制細菌CAs活性[39]。因此，磺胺類及其等排物對細菌CAs的抑制可能用于對抗許多病原體對現(xiàn)有抗菌藥物的耐藥性。圖2展示了這些磺胺類抑制劑的簡單衍生物（化合物1～24）和臨床使用中的藥物或制劑（AAZ-HCT）。

一系列含有-SO2NH2基團的化合物已在體外和體內(nèi)（包括耐藥菌感染小鼠模型）被證實是CAs的有效抑制劑。AAZ在體外和小鼠生殖道感染模型中抑制了淋病奈瑟菌的生長[55]。以AAZ為支架合成的兩種衍生物（參考文獻[56]中的化合物22和26）能以耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus， VRE）編碼的α-和γ-CA為靶點，高效抑制VRE活性[56]；另外，在兩種VRE感染的小鼠模型（小鼠VRE去定植模型和VRE敗血癥模型）中測試時，AAZ的表現(xiàn)優(yōu)于利奈唑胺（一種抗VRE感染的一線藥物）[57]。依索唑胺（EZA）是一種經(jīng)授權的利尿劑和CAIs，可以在體外殺死幽門螺桿菌，表明它具有轉(zhuǎn)化為抗幽門螺桿菌藥物的潛力[58]。Portela等[59]證明，使用兩種強效細菌CAs磺胺衍生物抑制劑（芳基磺?；寤交酋０稴ULFA1和SULFA2）預處理對牙本質(zhì)強度和預防變形鏈球菌在牙齒中的定殖具有積極治療效果。

4.2 陰離子

陰離子，如無機金屬絡合陰離子（硫氰酸鹽、氰化物、疊氮化物、硫化氫、氨基磺酸鹽）或羧酸鹽（三硫代碳酸酯，TTC），可以與CAs酶活性位點四面體或三角-雙錐體結構中的金屬離子結合抑制酶活性[60]。和磺胺類藥一樣，陰離子抑制劑在病原體細菌中也進行了大量研究（表2）。相對于磺胺類藥物抑制劑的亞微摩爾至納摩爾濃度抑制常數(shù)（KI），陰離子抑制劑抑制效率通常較低（KI通常為毫摩爾或亞毫摩爾）。陰離子抑制劑對于理解CAs在許多生理過程的催化機制，以及設計具有有機支架的新型抑制劑，從而發(fā)現(xiàn)此類藥物的全新家族都有重要意義。Del Prete等[61]研究了一組無機陰離子和小分子對霍亂弧菌VchCAα、VchCAβ和VchCAγ的抑制作用發(fā)現(xiàn)，硫酸鹽是VchCAα和VchCAγ的中度抑制劑（KI=0.85～

9.65 mmol/L），最有效的VchCAγ抑制劑是N， N-二乙基二硫代氨基甲酸酯、氨基磺酸酯、氨基磺酰胺、苯硼酸和苯砷酸，其KI值范圍為44～91 mmol/L，最活躍的VchCAα抑制劑是亞硫酸氫鹽、亞硫酸氫鹽、三硫代碳酸酯、N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯、氨基磺酰胺、氨基磺酸酯、苯硼酸和苯砷酸，其中KI值在 8～88 μmol/L

之間；而最有效的VchCAβ抑制劑是磺酰胺、氨基磺酸、苯硼酸和苯砷酸，其中KI值在54～86 μmol/L 之間。

4.3 二硫代氨基甲酸酯鹽類

二硫代氨基甲酸酯（DTC）是化學式為R（R'）CNS2（-）（R，R'=H、烷基和芳基）的單陰離子1，1-二硫代酸酯配體，DTC陰離子及其過渡金屬和主族元素的金屬鹽作為多位點的廣譜抗真菌殺菌劑，到目前為止仍沒有任何有關其耐藥性的記載。DTC作為CAIs是最近在研究無機陰離子作為CAIs時發(fā)現(xiàn)的。三硫代碳酸酯（TTC，CS32-）對hCA II有相對較弱的抑制作用，酶動力學和X射線晶體學顯示，TTC通過其3個等效硫原子之一與hCA II催化位點的Zn2+配位，第二個硫原子與酶保守的Thr199氨基酸殘基相互作用，第三個硫原子沒有與酶發(fā)生相互作用。通過氮原子和有機支架取代TTC的第三個硫原子后合成了DTC，由于DTC的有機支架參與了與CAs活性位點的相互補充作用，DTC表現(xiàn)出對許多CAs異構體的微摩爾至低納米摩爾的抑制作用。已有研究證實這些化合物對一些致病性結核分枝桿菌[33]、牙齦卟啉單胞菌[26，62]和淋病奈瑟菌[63]CA的微摩爾抑制作用。

4.4 羧酸類

羧酸類（圖3）是一類非經(jīng)典CAIs，包括苯酚、多胺、富勒烯、香豆素及其衍生物[64]。它們可以單齒或雙齒的方式結合在CAs活性位點外阻止底物進入，或者錨定在Zn2+配位的H2O/OH-上，抑制CAs的催化活性，從而阻止底物的結合催化[65-66]，表現(xiàn)出經(jīng)典磺胺CAIs的非典型結合機制[64]。羧酸類已在霍亂弧菌、結核分枝桿菌，肺炎鏈球菌和淋病奈瑟菌等少數(shù)病原體細菌中進行了研究（表2）。

5 細菌CAIs的代謝及安全性

作為臨床上主要使用的CAIs，磺胺類抑制劑已經(jīng)在數(shù)百萬患者中使用超過70年，證明其具有良好的藥代動力學特性和耐受性。例如，臨床研究最好的AAZ的I期臨床試驗中，89.5%的特發(fā)性顱內(nèi)高壓患者能夠耐受>1 g/d的劑量6個月，45%的患者在同一時間段內(nèi)耐受高達4 g/d的劑量，在成人口服250 mg后，其血漿消除半衰期為4～6 h，藥物全部通過尿液排泄，不產(chǎn)生代謝產(chǎn)物[94-95]。研究還表明，由于hCAI和hCAII在紅細胞中的表達，AAZ很容易進入血液中的紅細胞部分，有效地形成了一個封存藥物的池使AAZ的消除半衰期延長了一倍（～12 h）[94]。AAZ已被批準用作利尿劑，并用于治療青光眼、癲癇以及與充血性心力衰竭的相關癥狀。由于α-CA存在于人體大多數(shù)組織中，并且大多數(shù)臨床可用的CAIs對該酶的15種亞型中的多數(shù)具有相對的非選擇性（取決于劑量），所以患者經(jīng)常會出現(xiàn)由CA抑制引起的輕微副作用，并且在極少數(shù)情況下發(fā)生更嚴重的不良事件。如CA磺胺抑制類藥物的典型副作用，包括刺痛、惡心、疲勞、體重減輕和厭食癥，但在多數(shù)情況下會自行消失[96]。關于碳酸酐酶抑制劑安全性和代謝特征的詳細描述可參閱文獻[96]。

除臨床已有的α-CA抑制劑以外，細菌其他CAIs（特別是新合成的CAIs）的安全性和藥代動力學的研究很少。一項關于單硫代氨基甲酸酯（MTC）和二硫代氨基甲酸酯（DTC）系列的14種化合物對結核分枝桿菌β-CA3的抑制研究表明，該系列中的4種DTCs（參考文獻[97]中的8～10和12）顯示出非常顯著的抑制效力（KI=2.4～43 nmol/L），有9種化合物在暴露5 d時對發(fā)育中的斑馬魚幼蟲沒有不良的表型影響[97]。以AAZ為支架合成的兩種新化合物（參考文獻[81]中的20和23）對淋病奈瑟菌的最小抑制濃度值為0.25 μg/mL，

抗菌活性比AAZ提高了8～16倍，并且可能對NgCA具有靶向作用。此外，濃度高達1 μg/mL的兩種化合物對人宮頸管細胞系（End1/E6E7）和結直腸腺癌細胞系（Caco-2）沒有表現(xiàn)出任何毒性影響[81] 。

6 細菌CAIs的耐藥性

與傳統(tǒng)抗生素相比，對細菌CAIs耐藥的產(chǎn)生及相應的分子機制只有個別報道。一般認為，細菌不容易產(chǎn)生對CAIs的耐藥性，相關的報道也證實了這一結論。例如，AAZ和EZA對淋病奈瑟菌均表現(xiàn)出抑菌活性，抗生素后效應（post-antibiotic effects）長達10 h，并且細菌對這兩種藥物的單步自發(fā)耐藥突變頻率（<5.42×10?9）低于利福平（1.1×1.0?7～1.5×1.0?7）[80]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，EZA對幽門螺桿菌具有高抗菌活性，與利福平、甲硝唑和四環(huán)素相比，EZA對幽門螺桿菌具有較低的單步自發(fā)耐藥突變頻率（<5×10-9），表明細菌對EZA不容易形成耐藥性[58]。該研究還發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌在中性pH值時對EZA的抗性與3個基因突變有關。筆者認為UppS基因（編碼磺胺類化合物靶標的十一碳烯基焦磷酸合酶）的突變（Glu173Lys）可能消除了EZA與該酶的有利相互作用或引入與EZA的空間位阻沖突（steric clashes），Cys29Arg和移碼突變可能影響細菌代謝酶的整體調(diào)節(jié)和EZA進入幽門螺桿菌的途徑，三者共同作用賦予EZA耐藥性。另外，EZA與臨床使用的抗幽門螺桿菌抗生素之間沒有交叉耐藥性[58]。未來需要對EZA和其他細菌CAIs引起的耐藥性遺傳決定因素深入研究，以探索CAIs成為開發(fā)新型抗菌藥物的潛力。

7 結論與展望

目前，許多細菌已被研究是否存在CAs。一些細菌的CAs已被制備為重組酶，并從生物化學的角度對其進行了詳細表征，發(fā)現(xiàn)了各種類型的抑制劑。許多細菌CAs可被經(jīng)典的CAIs有效的抑制，如磺胺類及其衍生物和陰離子，其中一些可被二硫代氨基甲酸酯和羧酸抑制。最近關于AAZ及其衍生物作為VRE抑制劑的有效性的研究是該領域的一個突破。與臨床使用的利奈唑胺相比，磺胺類藥物對VRE的效率要高幾個數(shù)量級[57]。

盡管目前在鑒定細菌CAs的結構與功能以及具有抗菌活性的CAIs方面取得了一些進展，但相對于人類CAs藥物的發(fā)現(xiàn)，該領域仍處于起步階段。迄今為止，還沒有一種微生物CAs被證實為藥物靶標，以細菌CAs作為可行的抗菌靶點仍存在相當大的挑戰(zhàn)。例如，與人類CA亞型相比，對細菌表達的許多CA亞家族了解相對較少， CAs在細菌之間甚至在同一物種內(nèi)的多樣性和重要性可能限制了其開發(fā)為廣譜抗生素的潛力；另外，CAs不是物種特異性酶，細菌CAIs（如磺胺類和異羥肟酸）的脫靶效應可能會干擾宿主CAs活性，導致宿主的毒副作用以及減少藥物到達作用部位，從而阻止細菌CAIs成為可行的抗微生物靶標。因此，將來需要設計針對細菌而非人CAs的特異性和選擇性的、不基于經(jīng)典的磺胺類、氨基磺酸鹽或氨基磺酰胺類的細菌CAIs（如酚類、多胺類、羧酸類和香豆素及其衍生物），使細菌CAs成為可行的抗菌藥物靶點。

參 考 文 獻

Frieri M， Kumar K， Boutin A. Antibiotic resistance[J]. J Infect Public Health， 2017， 10（4）： 369-378.

Munita J M， Arias C A. Mechanisms of antibiotic resistance[J]. Microbiol Spectr， 2016， 4（2）： VMBF-0016-2015.

Stokes J M， Lopatkin A J， Lobritz M A， et al. Bacterial metabolism and antibiotic efficacy[J]. Cell Metab， 2019， 30（2）： 251-259.

Egorov A M， Ulyashova M M， Rubtsova M Y. Bacterial enzymes and antibiotic resistance[J]. Acta Natur， 2018， 10（4）： 33-48.

Meldrum N U， Roughton F J. Carbonic anhydrase. Its preparation and properties[J]. J Physiol， 1933， 80（2）： 113-142.

Capasso C， Supuran C T. Bacterial， fungal and protozoan carbonic anhydrases as drug targets[J]. Expert Opin Ther Targets， 2015， 19（12）： 1689-1704.

Jensen E L， Clement R， Kosta A， et al. A new widespread subclass of carbonic anhydrase in marine phytoplankton[J]. Isme J， 2019， 13（8）： 2094-2106.

Supuran C T. Emerging role of carbonic anhydrase inhibitors[J]. Clin Sci （Lond）， 2021， 135（10）： 1233-1249.

Smith K S， Ferry J G. Prokaryotic carbonic anhydrases[J]. FEMS Microbiol Rev， 2000， 24（4）： 335-366.

Supuran C T， Capasso C. An overview of the bacterial carbonic anhydrases[J]. Metabolites， 2017， 7（4）： 56.

Capasso C， Supuran C T. An overview of the alpha-， beta- and gamma-carbonic anhydrases from bacteria： Can bacterial carbonic anhydrases shed new light on evolution of bacteria[J]？ J Enzyme Inhib Med Chem， 2015， 30（2）： 325-332.

Hirakawa Y， Senda M， Fukuda K， et al. Characterization of a novel type of carbonic anhydrase that acts without metal cofactors[J]. BMC Biol， 2021， 19（1）： 105.

Supuran C T. Structure and function of carbonic anhydrases[J]. Biochem J， 2016， 473（14）： 2023-2032.

Supuran C T， Capasso C. The η-class carbonic anhydrases as drug targets for antimalarial agents[J]. Expert Opin Ther Targets， 2015， 19（4）： 551-563.

Nocentini A， Supuran C T， Capasso C. An overview on the recently discovered iota-carbonic anhydrases[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2021， 36（1）： 1988-1995.

Ferraroni M， Del Prete S， Vullo D， et al. Crystal structure and kinetic studies of a tetrameric type II β-carbonic anhydrase from the pathogenic bacterium Vibrio cholerae[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2015， 71（Pt 12）： 2449-2456.

De Simone G， Monti S M， Alterio V， et al. Crystal structure of the most catalytically effective carbonic anhydrase enzyme known， SazCA from the thermophilic bacterium Sulfurihydrogenibium azorense[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2015， 25（9）： 2002-2006.

Fiore A D， Capasso C， Luca V D， et al. X-ray structure of the first extremo-α-carbonic anhydrase， a dimeric enzyme from the thermophilic bacterium Sulfurihydrogenibium yellowstonense YO3AOP1[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2013， 69（Pt 6）： 1150-1159.

Alterio V， Langella E， Viparelli F， et al. Structural and inhibition insights into carbonic anhydrase CDCA1 from the marine diatom Thalassiosira weissflogii[J]. Biochimie， 2012， 94（5）： 1232-1241.

Del Prete S， Nocentini A， Supuran C T， et al. Bacterial ι-carbonic anhydrase： A new active class of carbonic anhydrase identified in the genome of the Gram-negative bacterium Burkholderia territorii[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2020， 35（1）： 1060-1068.

Huang S， Xue Y， Sauer-Eriksson E， et al. Crystal structure of carbonic anhydrase from Neisseria gonorrhoeae and its complex with the inhibitor acetazolamide[J]. J Mol Biol， 1998， 283（1）： 301-310.

Chiric? L C， Elleby B， Jonsson B H， et al. The complete sequence， expression in Escherichia coli， purification and some properties of carbonic anhydrase from Neisseria gonorrhoeae[J]. Eur J Biochem， 1997， 244（3）： 755-760.

Ozensoy Guler O， Capasso C， Supuran C T. A magnificent enzyme superfamily： Carbonic anhydrases， their purification and characterization[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2016， 31（5）： 689-694.

Capasso C， Supuran C T. Inhibition of bacterial carbonic anhydrases as a nvel approach to escape drug resistance[J]. Curr Top Med Chem， 2017， 17（11）： 1237-1248.

Del Prete S， Vullo D， De Luca V， et al. Comparison of the sulfonamide inhibition profiles of the α-， β- and γ-carbonic anhydrases from the pathogenic bacterium Vibrio cholerae[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2016， 26（8）： 1941-1946.

Prete S D， Vullo D， Osman S M， et al. Sulfonamide inhibition study of the carbonic anhydrases from the bacterial pathogen Porphyromonas gingivalis： the β-class （PgiCAb） versus the γ-class （PgiCA） enzymes[J]. Bioorg Med Chem， 2014， 22（17）： 4537-4543.

Supuran C T. Bacterial carbonic anhydrases as drug targets： toward novel antibiotics？[J]. Front Pharmacol， 2011， 2： 34.

Angeli A， Ferraroni M， Pinteala M， et al. Crystal structure of a tetrameric type II β-carbonic anhydrase from the pathogenic bacterium Burkholderia pseudomallei[J]. Molecules， 2020， 25（10）： 2269.

Cronk J D， Oneill J W， Cronk M R， et al. Cloning， crystallization and preliminary characterization of a beta-carbonic anhydrase from Escherichia coli[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr， 2000， 56（Pt 9）： 1176-1179.

Rowlett R S， Tu C， Lee J， et al. Allosteric site variants of Haemophilus influenzae beta-carbonic anhydrase[J]. Biochemistry， 2009， 48（26）： 6146-6156.

Covarrubias A S， Bergfors T， Jones T A， et al. Structural mechanics of the pH-dependent activity of beta-carbonic anhydrase from Mycobacterium tuberculosis[J]. J Biol Chem， 2006， 281（8）： 4993-4999.

Vullo D， Nishimori I， Minakuchi T， et al. Inhibition studies with anions and small molecules of two novel β-carbonic anhydrases from the bacterial pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2011， 21（12）： 3591-3595.

Aspatwar A， Winum J Y， Carta F， et al. Carbonic anhydrase inhibitors as novel drugs against Mycobacterial β-carbonic anhydrases： An update on in vitro and in vivo studies[J]. Molecules， 2018， 23（11）： 2911.

Shahidzadeh R， Opekun A， Shiotani A， et al. Effect of the carbonic anhydrase inhibitor， acetazolamide， on Helicobacter pylori infection in vivo： A pilot study[J]. Helicobacter， 2005， 10（2）： 136-138.

Abutaleb N S， Elhassanny A E M， Flaherty D P， et al. In vitro and in vivo activities of the carbonic anhydrase inhibitor， dorzolamide， against vancomycin-resistant enterococci[J]. Peer J， 2021， 9： e11059.

Kisker C， Schindelin H， Alber B E， et al. A left-hand beta-helix revealed by the crystal structure of a carbonic anhydrase from the archaeon Methanosarcina thermophila[J]. Embo J， 1996， 15（10）： 2323-2330.

Di Fiore A， De Luca V， Langella E， et al. Biochemical， structural， and computational studies of a γ-carbonic anhydrase from the pathogenic bacterium Burkholderia pseudomallei[J]. Comput Struct Biotechnol J， 2022， 20： 4185-4194.

Wang W， Zhang Y， Wang L， et al. Molecular structure of thermostable and zinc-ion-binding γ-class carbonic anhydrases[J]. Biometals， 2019， 32（2）： 317-328.

Nocentini A， Capasso C， Supuran C T. Carbonic Anhydrase inhibitors as novel antibacterials in the era of antibiotic resistance： Where are we now[J]？ Antibiotics （Basel）， 2023， 12（1）： 142.

Kusian B， Sültemeyer D， Bowien B. Carbonic anhydrase is essential for growth of Ralstonia eutropha at ambient CO（2） concentrations[J]. J Bacteriol， 2002， 184（18）： 5018-5026.

Merlin C， Masters M， Mcateer S，? et al. Why is carbonic anhydrase essential to Escherichia coli[J]？ J Bacteriol， 2003， 185（21）： 6415-6424.

Ueda K， Nishida H， Beppu T. Dispensabilities of carbonic anhydrase in proteobacteria[J]. Int J Evol Biol， 2012， 2012： 324549.

Langereis J D， Zomer A， Stunnenberg H G， et al. Nontypeable Haemophilus influenzae carbonic anhydrase is important for environmental and intracellular survival[J]. 2013， 195（12）： 2737-2746.

Carta F， Maresca A， Covarrubias A S， et al. Carbonic anhydrase inhibitors. Characterization and inhibition studies of the most active beta-carbonic anhydrase from Mycobacterium tuberculosis， Rv3588c[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2009， 19（23）： 6649-6654.

Marcus E A， Moshfegh A P， Sachs G， et al. The periplasmic alpha-carbonic anhydrase activity of Helicobacter pylori is essential for acid acclimation[J]. J Bacteriol， 2005， 187（2）： 729-738.

Abuaita B H， Withey J H. Bicarbonate induces Vibrio cholerae virulence gene expression by enhancing ToxT activity[J]. Infect Immun， 2009， 77（9）： 4111-4120.

Joseph P， Ouahrani-Bettache S， Montero J L， et al. A new β-carbonic anhydrase from Brucella suis， its cloning， characterization， and inhibition with sulfonamides and sulfamates， leading to impaired pathogen growth[J]. Bioorg Med Chem， 2011， 19（3）： 1172-1178.

Valdivia R H， Falkow S. Fluorescence-based isolation of bacterial genes expressed within host cells[J]. Science， 1997， 277（5334）： 2007-2011.

Rollenhagen C， Bumann D. Salmonella enterica highly expressed genes are disease specific[J]. Infect Immun， 2006， 74（3）： 1649-1660.

Lotlikar S R， Kayastha B B， Vullo D， et al. Pseudomonas aeruginosa β-carbonic anhydrase， psCA1， is required for calcium deposition and contributes to virulence[J]. Cell Calcium， 2019， 84： 102080.

Vullo D， Isik S， Del Prete S， et al. Anion inhibition studies of the α-carbonic anhydrase from the pathogenic bacterium Vibrio cholerae[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2013， 23（6）： 1636-1638.

Alterio V， Di Fiore A， Dambrosio K， et al. Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases： How to design specific drugs targeting 15 different isoforms[J]？ Chem Rev， 2012， 112（8）： 4421-4468.

Capasso C， Supuran C T. Anti-infective carbonic anhydrase inhibitors： A patent and literature review[J]. Expert Opin Ther Pat， 2013， 23（6）： 693-704.

Supuran C T. Advances in structure-based drug discovery of carbonic anhydrase inhibitors[J]. Expert Opin Drug Discov， 2017， 12（1）： 61-88.

Abutaleb N S， Elhassanny A E M， Seleem M N. In vivo efficacy of acetazolamide in a mouse model of Neisseria gonorrhoeae infection[J]. Microb Pathog， 2022， 164： 105454.

Kaur J， Cao X， Abutaleb N S， et al. Optimization of acetazolamide-based scaffold as potent inhibitors of vancomycin-resistant Enterococcus[J]. J Med Chem， 2020， 63（17）： 9540-9562.

Abutaleb N S， Elkashif A， Flaherty D P， et al. In vivo antibacterial activity of acetazolamide[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2021， 65（4） ： e01715-20.

Modak J K， Tikhomirova A， Gorrell R J， et al. Anti-Helicobacter pylori activity of ethoxzolamide[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2019， 34（1）： 1660-1667.

Portela M B， Barboza C M， Da Silva E M， et al. Dentine biomodification by sulphonamides pre-treatment： Bond strength， proteolytic inhibition， and antimicrobial activity[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2023， 38（1）： 319-329.

De Simone G， Supuran C T. （In）organic anions as carbonic anhydrase inhibitors[J]. J Inorg Biochem， 2012， 111： 117-129.

Del Prete S， Vullo D， De Luca V， et al. Anion inhibition profiles of α-， β- and γ-carbonic anhydrases from the pathogenic bacterium Vibrio cholerae[J]. Bioorg Med Chem， 2016， 24（16）： 3413-3417.

Supuran C T， Capasso C. Carbonic anhydrase from Porphyromonas gingivalis as a drug target[J]. Pathogens， 2017， 6（3）： 30.

Nocentini A， Hewitt C S， Mastrolorenzo M D， et al. Anion inhibition studies of the α-carbonic anhydrases from Neisseria gonorrhoeae[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2021， 36（1）： 1061-1066.

Lomelino C L， Supuran C T， Mckenna R. Non-classical inhibition of carbonic anhydrase[J]. Int J Mol Sci， 2016， 17（7）： 1150.

Supuran C T. How many carbonic anhydrase inhibition mechanisms exist[J]？ J Enzyme Inhib Med Chem， 2016， 31（3）： 345-360.

Aspatwar A， Tolvanen M E， Ortutay C， et al. Carbonic anhydrase related proteins： Molecular biology and evolution[J]. Subcell Biochem， 2014， 75： 135-156.

Campestre C， De Luca V， Carradori S， et al. Carbonic anhydrases： New perspectives on protein functional role and inhibition in Helicobacter pylori[J]. Front Microbiol， 2021， 12： 629163.

Urbanski L J， Vullo D， Parkkila S， et al. An anion and small molecule inhibition study of the β-carbonic anhydrase from Staphylococcus aureus[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2021， 36（1）： 1088-1092.

Del Prete S， Isik S， Vullo D， et al. DNA cloning， characterization， and inhibition studies of an α-carbonic anhydrase from the pathogenic bacterium Vibrio cholerae[J]. J Med Chem， 2012， 55（23）： 10742-10748.

Giovannuzzi S， Hewitt C S， Nocentini A， et al. Coumarins effectively inhibit bacterial α-carbonic anhydrases[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2022， 37（1）： 333-338.

De Luca V， Carginale V， Supuran C T， et al. The Gram-negative bacterium Escherichia coli as a model for testing the effect of carbonic anhydrase inhibition on bacterial growth[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2022， 37（1）： 2092-2098.

Del Prete S， Bua S， Supuran C T， et al. Escherichia coli γ-carbonic anhydrase： Characterisation and effects of simple aromatic/heterocyclic sulphonamide inhibitors[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2020， 35（1）： 1545-1554.

Del Prete S， De Luca V， Nocentini A，? et al. Anion inhibition studies of the beta-carbonic anhydrase from Escherichia coli[J]. Molecules， 2020， 25（11）： 2564.

Rahman M M， Tikhomirova A， Modak J K， et al. Antibacterial activity of ethoxzolamide against Helicobacter pylori strains SS1 and 26695[J]. Gut Pathog， 2020， 12： 20.

Vullo D， Sai Kumar R S， Scozzafava A， et al. Anion inhibition studies of a β-carbonic anhydrase from Clostridium perfringens[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2013， 23（24）： 6706-6710.

Vullo D， Kumar R S S， Scozzafava A， et al. Sulphonamide inhibition studies of the β-carbonic anhydrase from the bacterial pathogen Clostridium perfringens[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2018， 33（1）： 31-36.

K?hler S， Ouahrani-Bettache S， Winum J Y. Brucella suis carbonic anhydrases and their inhibitors： Towards alternative antibiotics[J]？ J Enzyme Inhib Med Chem， 2017， 32（1）： 683-687.

Aspatwar A， Kairys V， Rala S， et al. Mycobacterium tuberculosis β-Carbonic Anhydrases： Novel targets for developing antituberculosis drugs[J]. Int J Mol Sci， 2019， 20（20）： 5153.

Burghout P， Vullo D， Scozzafava A，? et al. Inhibition of the β-carbonic anhydrase from Streptococcus pneumoniae by inorganic anions and small molecules： Toward innovative drug design of antiinfectives[J]？ Bioorg Med Chem， 2011， 19（1）： 243-248.

Abutaleb N S， Elhassanny A E M， Nocentini A， et al. Repurposing FDA-approved sulphonamide carbonic anhydrase inhibitors for treatment of Neisseria gonorrhoeae[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2022， 37（1）： 51-61.

Hewitt C S， Abutaleb N S， Elhassanny A E M， et al. Structure-activity relationship studies of acetazolamide-based carbonic anhydrase inhibitors with activity against Neisseria gonorrhoeae[J]. ACS Infect Dis， 2021， 7（7）： 1969-1984.

Rubin D H F， Ma K C， Westervelt K A， et al. CanB is a metabolic mediator of antibiotic resistance in Neisseria gonorrhoeae[J]. Nat Microbiol， 2023， 8（1）： 28-39.

Supuran C T. Legionella pneumophila carbonic anhydrases： underexplored antibacterial drug targets[J]. Pathogens， 2016， 5（2）： 44.

Nishimori I， Vullo D， Minakuchi T， et al. Anion inhibition studies of two new β-carbonic anhydrases from the bacterial pathogen Legionella pneumophila[J]. Bioorg Med Chem Lett， 2014， 24（4）： 1127-1132.

Nishimori I， Minakuchi T， Vullo D， et al. Inhibition studies of the β-carbonic anhydrases from the bacterial pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium with sulfonamides and sulfamates[J]. Bioorg Med Chem， 2011， 19（16）： 5023-5030.

Dedeoglu N， De Luca V， Isik S， et al. Cloning， characterization and anion inhibition study of a β-class carbonic anhydrase from the caries producing pathogen Streptococcus mutans[J]. Bioorg Med Chem， 2015， 23（13）： 2995-3001.

An W， Holly K J， Nocentini A， et al. Structure-activity relationship studies for inhibitors for vancomycin-resistant Enterococcus and human carbonic anhydrases[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2022， 37（1）： 1838-1844.

Kaur J， Cao X， Abutaleb N S， et al. Optimization of acetazolamide-based scaffold as potent inhibitors of vancomycin-resistant Enterococcus[J]. J Med Chem， 2020， 63（17）： 9540-9562.

Urbanski L J， Bua S， Angeli A， et al. Sulphonamide inhibition profile of Staphylococcus aureus β-carbonic anhydrase[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2020， 35（1）： 1834-1839.

Del Prete S， Vullo D， Di Fonzo P， et al. Comparison of the anion inhibition profiles of the β- and γ-carbonic anhydrases from the pathogenic bacterium Burkholderia pseudomallei[J]. Bioorg Med Chem， 2017， 25（6）： 2010-2015.

Akgul O， Angeli A， Selleri S， et al. Taurultams incorporating arylsulfonamide： First in vitro inhibition studies of α-， β- and γ-class carbonic anhydrases from Vibrio cholerae and Burkholderia pseudomallei[J]. Eur J Med Chem， 2021， 219： 113444.

Del Prete S， Vullo D， Osman S M， et al. Sulfonamide inhibition profiles of the β-carbonic anhydrase from the pathogenic bacterium Francisella tularensis responsible of the febrile illness tularemia[J]. Bioorg Med Chem， 2017， 25（13）： 3555-3561.

Del Prete S， Vullo D， Osman S M， et al. Anion inhibitors of the β-carbonic anhydrase from the pathogenic bacterium responsible of tularemia， Francisella tularensis[J]. Bioorg Med Chem， 2017， 25（17）： 4800-4804.

Ritschel W A， Paulos C， Arancibia A， et al. Pharmacokinetics of acetazolamide in healthy volunteers after short- and long-term exposure to high altitude[J]. J Clin Pharmacol， 1998， 38（6）： 533-539.

Ten Hove M W， Friedman D I， Patel A D， et al. Safety and tolerability of acetazolamide in the idiopathic intracranial hypertension treatment Trial[J]. J Neuroophthalmol， 2016， 36（1）： 13-19.

Swenson E R. Safety of carbonic anhydrase inhibitors[J]. Expert Opin Drug Saf， 2014， 13（4）： 459-472.

Aspatwar A， Hammaren M， Parikka M， et al. In vitro inhibition of Mycobacterium tuberculosis β-carbonic anhydrase 3 with mono- and dithiocarbamates and evaluation of their toxicity using zebrafish developing embryos[J]. J Enzyme Inhib Med Chem， 2020， 35（1）： 65-71.