代蕊 陳崎 爽爽 張巖 張志強 米福貴

摘要：為探究紫花苜蓿（Medicago sativa L.）茉莉酰氨基酸結(jié)合物合成酶（Jasmonoyl amino acid conjugate synthase，JAR1）的基因功能，本試驗對‘草原4號紫花苜蓿中克隆到的MsJAR1基因進行了生物信息學和表達模式分析，發(fā)現(xiàn)MsJAR1基因cDNA序列長度為1 740 bp，開放閱讀框（ORF）編碼 579 個氨基酸殘基，含有GH3保守結(jié)構(gòu)域。MsJAR1與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、紅三葉（Trifolium pratense）、豌豆（Pisum sativum）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、相思子（Abrus precatorius）的同源性均在80%以上。煙草亞細胞定位顯示該蛋白定位于葉綠體。MsJAR1基因在老葉中表達量最高，花器官次之；薊馬取食、鹽和干旱脅迫可誘導該基因表達，初步推測其參與紫花苜蓿應(yīng)答薊馬取食及干旱和鹽脅迫防御反應(yīng)。本研究為進一步探究紫花苜蓿MsJAR1基因功能提供了參考。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；MsJAR1；基因克??；表達模式

中圖分類號：S892.6??? 文獻標識碼：A???? 文章編號：1007-0435（2024）05-1370-08

Cloning and Expression Analysis of MsJAR1 in Medicago sativa

DAI Rui1， CHEN Qi1， SHUANG Shuang1， ZHANG Yan1， ZHANG Zhi-qiang1，2*， MI Fu-gui1，2*

（1. Colleg of Grassland， Resources and Environment，Inner Mongolia Agricultural University，Inner Mongolia Autonomous

Region， Hohhot， 010010， China; 2. Technology Engineering Center of Drought and Cold-resistant Grass Breeding in North of

the National Forestry and Grassland Administration， Institute of Grassland and Resources Environment， Inner Mongolia

Agricultural University， Hohhot， Inner Mongalia 010010， China）

Abstract：To explore the function of jasmonoyl amino acid conjugate synthase（JAR1） gene in alfalfa，a novel gene， MsJAR1 （OK602801），was cloned，characterized and bioinformatic analyzed from Medicago sativa L.. The results showed that the cDNA sequence of MsJAR1 gene was 1 740 bp in length，and the open reading frame encoded 579 amino acid polypeptide，containing the GH3 conserved domain. Amino acid sequence alignment indicated that the homology of deduced MsJAR1 with Medicago truncatula，Trifolium pratense，Pisum sativum，Cicer arietinum and Abrus precatorius was all more than 80%. Subcellular localization analysis in tobacco showed that the MsJAR1 protein located in the chloroplast. The MsJAR1 gene expression was the highest in old leaves，followed by floral organs. In addition，thrips feeding，salt and drought stress could induce the expression of MsJAR1 gene，which provided a reference for further exploring the function of MsJAR1 gene in alfalfa.

Key words：Alfalfa;MsJAR1; Gene cloning;Expression analysis

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是經(jīng)濟效益較高且世界上種植面積最廣的豆科牧草之一［1］，具有飼草產(chǎn)量高、蛋白含量高、適口性好等優(yōu)點［2］。隨著我國草地畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，對優(yōu)質(zhì)苜蓿的需求逐年增加，苜蓿種植面積也不斷擴大。我國幅員遼闊，不同區(qū)域的氣候地形差異較大，不同苜蓿種植地區(qū)蟲害發(fā)生狀況不同，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國已報道的苜蓿害蟲常見種為苜蓿薊馬（Frankliniella occidentalis）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）、小葉葉蟬（Empoasca flavescens）等［3］。近年來，隨苜蓿種植面積增加，薊馬種群增速較快，對苜蓿生產(chǎn)的危害日漸顯著［4］。

植物與植食性昆蟲之間存在著復雜的分子互作機制［5］，其中，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）途徑［6］是最常見信號途徑之一。當植物處于逆境時，會產(chǎn)生信號促使JA合成，在茉莉酸-異亮氨酸合成酶（Jasmonoyl amino acid conjugate synthase，JAR1）作用下形成茉莉酸-異亮氨酸（Jasmonic acid-isoleucine，JA-Ile）復合物。JA-Ile與茉莉酸受體蛋白COI1結(jié)合，會使轉(zhuǎn)錄因子MYC2的表達不再被抑制，繼而激活下游的靶基因［7］，生成多種次級代謝產(chǎn)物，從而調(diào)控植物的抗逆性。

近些年，國內(nèi)外眾多學者對不同植物JAR1基因做過研究，為深入分析JAR1基因的生物學功能提供了理論指導。在黃燈籠辣椒中發(fā)現(xiàn)CcJAR1基因為茉莉酸氨基合酶基因，主要在抗病分子機制中發(fā)揮重要作用［8］；擬南芥受到鹽脅迫時引起的JA信號傳導激活則依賴JAR1和蛋白酶體的功能［9］；橡膠樹JAR1過表達后，在JA、吲哚乙酸（Indoleacetic acid，IAA）、乙烯利（Ethephon，ET）、脫落酸（Abscisic acid，ABA）和赤霉素（Gibberellic acid，GA）處理下，會對HbJAR1基因的表達起到不同程度的上調(diào)作用［10］；豌豆幼苗經(jīng)蚜蟲取食后，JA/MeJA濃度顯著上升，導致JA/MeJA相關(guān)基因（LOX1、LOX2、OPR1 和 JAR1）上調(diào)表達，從而觸發(fā)對豌豆蚜的抗性響應(yīng)［11］。本研究以‘草原4號紫花苜蓿為研究材料，從中克隆得到JAR1基因，并對其進行生物信息學分析、亞細胞定位和表達模式分析，以期為該基因相關(guān)功能的研究與挖掘提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

試驗材料為‘草原4號紫花苜蓿。選取顆粒飽滿的苜蓿種子，于2022年4月種植于以營養(yǎng)土和蛭石作為基質(zhì)的花盆中，置于光照16 h、黑暗8 h且溫度為22℃的室內(nèi)進行培養(yǎng)，隔天澆水，在溫室中培養(yǎng)45 d，用250 mM Nacl模擬鹽脅迫處理，以正常生長條件下的幼苗為對照，在不同時間處理條件下（0 h，2 h，4 h，8 h，12 h和24 h）取樣；使用空氣干旱法［12］對苜蓿植株進行干旱脅迫，在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h和24 h下取樣；將生長40 d左右的幼苗每株接種100只薊馬，并用300目尼龍布罩住，以未經(jīng)過薊馬處理的幼苗為對照，同時在第0 d，3 d，7 d，10 d和14 d收集樣本；在紫花苜蓿結(jié)莢期，分別對植物根、莖、老葉、嫩葉、花、莢和種子進行取樣，用于組織特異性分析；以上處理每個樣品均重復3次，液氮速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取保存樣品各150 mg，將液氮倒入研缽進行磨樣，使用TRIzon Rragent（康為世紀生物科技有限公司）試劑從葉片樣品中提取總RNA，利用Nano Drop檢測RNA質(zhì)量，將所提取RNA放置于-80℃保存。利用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis試劑盒（康為世紀生物科技有限公司）獲得樣品cDNA，置于-20℃儲存，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 目的基因克隆 以前期‘草原4號紫花苜蓿全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，篩選出茉莉酸信號途徑中編碼茉莉酰氨基酸結(jié)合物合成酶（JAR1）的基因，設(shè)計特異性引物：Jar1-F：5′-TTCTCTGCCACCCCAGAG-3′和Jar1-R：5′-TCAATTGAATGCAGTACTG-3′。以‘草原4號紫花苜蓿的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR體系為50 μL，包含cDNA模板4 μL（10 ng·μL-1），2×Es Taq Master Mix（Dye） 25 μL，上下游引物各2 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 17 μL。擴增程序為：94℃預變性2 min；98℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，34個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存。用凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司，中國）回收產(chǎn)物，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取陽性單菌落，經(jīng)過菌落以及菌液PCR檢測后，送北京擎科生物科技股份有限公司測序。

1.2.3 生物學信息分析 利用NCBI Blast在線網(wǎng)站進行序列比對，使用DNAMAN軟件進行系統(tǒng)進化樹制作，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹［13］；SMART（http：//smart.embl.de）在線工具分析保守結(jié)構(gòu)域；利用Expasy Prot Param tool工具分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在線網(wǎng)站預測蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件預測蛋白三級結(jié)構(gòu)［14］。

1.2.4 qRT-PCR分析 利用Primer 3.0在線軟件設(shè)計qRT-PCR引物JAR1-PCR-：5′-GCGGACTAATTTTCCGCGAG-3′和JAR1-PCR-R：5′-GGGAACGGTGACTCTGCTAC-3′。不同組織部位的cDNA為模板取 4 μL，上下引物各0.4 μL，SYBR qPCR Master Mix 10 μL（康為世紀生物科技有限公司），ddH2O 5 μL，ROX Reference Dye（50×）0.2 μL。反應(yīng)程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；95℃ 15 s；40個循環(huán)。每樣品3次重復，并采用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達量［15］。內(nèi)參引物為Actin-F：5′-TTTGAGACTTTCAATGTGCCCGCC-3′和Actin-R：5′-TAGCATGTGGGAGTGCATAACCCT-3′。

1.2.5 亞細胞位置預測與定位 利用PSORT軟件對MsJAR1蛋白進行亞細胞定位預測；構(gòu)建pCPB-MsJAR1-GFP瞬時表達載體，以空載體pCPB-GFP為對照，將構(gòu)建好的瞬時表達載體與空載體對照同時注射到煙草不同葉片中，48 h后在共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，最終確定MsJAR1蛋白位置。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與處理 使用Excel 2010 統(tǒng)計計算相關(guān)數(shù)據(jù)，使用SPSS Statistics 18.0 軟件進行方差分析，使用t檢驗比較5%顯著性水平下的平均值。使用Origin 2019 軟件制作條形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsJAR1基因克隆

采用TRIzon法提取‘草原4號紫花苜蓿葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，設(shè)計特異性引物，經(jīng)過擴增、切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌及測序，最終獲得一條全長1 740 bp 的cDNA序列（圖1）。該基因序列ORF框編碼含579個氨基酸殘基（圖2），基因登錄號為OK602801。

2.2 MsJAR1基因生物信息學分析

2.2.1 MsJAR1蛋白理化性質(zhì) MsJAR1蛋白保守結(jié)構(gòu)域具有JAR1特征性結(jié)構(gòu)域，屬于GH3家族成員（圖3A）。紫花苜蓿MsJAR1蛋白分子式為C2942 H4615 N763O857 S24，其中異亮氨酸（Leu）含量最高為10.4%，谷氨酸（Glu）含量為8.3%，纈氨酸（Val）含量為7.1%；蛋白分子量為65 156.04 Da，等電點為6.24，脂肪指數(shù)為93.03，平均親水指數(shù)為-0.109，不穩(wěn)定指數(shù)為35.47，MsJAR1蛋白為親水性穩(wěn)定蛋白（圖3B）。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，MsJAR1氨基酸序列包含43.35%的Alpha螺旋、5.18%的bate折疊、15.20%的延伸鏈和36.27%的不規(guī)則卷曲，Alpha螺旋和不規(guī)則卷曲占主要成分（圖3C）。利用SWISS-MODEL對編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相符（圖3D）。

2.2.2 MsJAR1序列比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建 利用DNAMAN軟件及NCBI-Blast（www.ncbi.nlm.nih.gov）分析后發(fā)現(xiàn)，MsJAR1氨基酸序列與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、紅三葉（Trifolium pratense）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、相思子（Abrus precatorius）、花生（Arachis hypogaea）中相關(guān)氨基酸的相似度分別為97.67%，89. 33%，88.17%，85.85%，81.34%（圖4A）。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，MsJAR1蛋白與其他豆科植物的JAR1氨基酸序列如蒺藜苜蓿、紅三葉、豌豆（Pisum sativum）、相思子、木豆（Cajanus cajan）、大豆（Glycine max）等聚為一類（圖4B）。

2.3 MsJAR1蛋白亞細胞定位

PSORT軟件預測結(jié)果顯示，MsJAR1蛋白初步定位于葉綠體內(nèi)（圖5），然后采用煙草瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)以進一步確定MsJAR1蛋白在細胞中的確切定位。以空載體pCPB-GFP為對照，利用激光共聚焦顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)MsJAR1-GFP主要定位在葉綠體細胞中（綠色熒光），同葉綠體自發(fā)熒光（紅色熒光）融合；而空載體的GFP熒光呈現(xiàn)彌散的狀態(tài)存在于整個細胞中（圖6）。

2.4 MsJAR1表達模式分析

經(jīng)對MsJAR1基因在紫花苜蓿根、莖、老葉、嫩葉、花、豆莢和種子中的表達量進行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因在所有組織中均有表達，其中老葉中的表達量最高，約為種子的90倍，花中的表達量約為種子的45倍；嫩葉和莖中的表達量接近，是種子表達量的18倍左右（圖7A）。薊馬侵染誘導下，MsJAR1基因表達量在3 d，7 d和10 d被顯著誘導（圖7B）；不同時間鹽脅迫處理下，MsJAR1基因的表達量全部上調(diào)，其中8 h和2 h的表達量分別為對照（0 h）的20倍和15倍，而24 h的表達量無顯著影響（圖7C）；不同時間干旱脅迫處理下，其表達量均顯著上調(diào)，與0 h相比4 h和12 h基因的表達量較高，介于1.5倍和2.0倍之間（圖7D）。

3 討論

JAR1可以催化JA形成JA-Ile［16］，激活JA信號途徑。JA信號途徑通過調(diào)控植物下游防御基因的表達，激活下游靶基因，生成多種次級代謝產(chǎn)物并啟動植物的防御反應(yīng)［17］。目前JAR1基因已在大豆、擬南芥、水稻、葡萄、桑樹、白楊等植物中有過報道［18-21］。本研究從‘草原4號紫花苜蓿中克隆到全長1 740 bp的cDNA序列，編碼一個含579個氨基酸殘基的蛋白。序列分析發(fā)現(xiàn)MsJAR1基因與蒺藜苜蓿、紅三葉、豌豆和相思子中的同源基因親緣關(guān)系較近，推測MsJAR1基因與這幾個物種在功能上具有相似性。蛋白質(zhì)作為基因功能的主要執(zhí)行者，需要在正確的亞細胞區(qū)隔中定位并維持生物體內(nèi)多種生化過程高效進行［22-24］，以保證生物體正常生命活動。煙草瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)現(xiàn)MsJAR1蛋白定位在葉綠體，這與長春花中CrJAR1蛋白［7］和辣椒CaJAR1蛋白［25］結(jié)果相似，MsJAR1進入葉綠體能夠發(fā)揮相應(yīng)調(diào)控功能。

植物對逆境環(huán)境的耐受性與植物激素密切相關(guān)，茉莉酸作為植物體內(nèi)源信號分子，可介導植物生長的多種方面，如花器發(fā)育、根系生長、毛狀體形成等［26］，并且在植物抗逆響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［27］。通過qRT-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)MsJAR1基因在不同組織部位均有表達，但主要在老葉中表達，花器官次之，說明MsJAR1基因可能對葉片及花期階段的相關(guān)化合物合成起到調(diào)控作用，這與番茄SlJAR1基因的研究結(jié)果［28］相似。擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，葉片在受到機械損傷后傷口會迅速誘導JA-Ile的累積［29］。由于薊馬的取食能夠激活JA的合成以及JA信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因的表達［30-31］，因此，當薊馬在植株上造成傷口時，會導致JA-Ile含量的增加，從而發(fā)揮抗蟲作用。本研究發(fā)現(xiàn)，MsJAR1基因的表達量在被薊馬取食3 d、7 d、10 d所誘導，說明MsJAR1基因可能參與苜?？顾E馬應(yīng)答反應(yīng)。

通過蛋白結(jié)構(gòu)域分析可知MsJAR1蛋白屬于GH3家族成員，GH3家族可通過維持激素穩(wěn)態(tài)在植物生長發(fā)育和抵抗脅迫中起到重要作用［32］。MsJAR1基因的表達會隨著物種及環(huán)境刺激的不同發(fā)生變化。在水稻和大豆的研究中發(fā)現(xiàn)，外源茉莉酸甲酯處理能夠提高水稻幼苗耐鹽性和大豆幼苗對鹽脅迫的抗性［33-34］，JA信號調(diào)控基因OsJAZ9與OsbHLH062互作提高抗氧化能力［35-36］，增加對鹽脅迫的耐受性。在擬南芥中，JAR1基因的過表達導致JA-Ile含量增加，從而會提高植株對干旱脅迫的耐受性［37］；與突變體相比，JAR1過表達植株在輕度干旱條件下能夠通過澆水減緩葉片的萎蔫程度，此外，過表達株系的葉片相對含水量（RWC）較高，在干旱脅迫下受到的影響較小，表明JAR1基因的過表達延長了擬南芥對干旱脅迫的耐受性［37］。本研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿MsJAR1基因在兩種脅迫條件下均被高度誘導，說明MsJAR1可能參與紫花苜蓿鹽脅迫和干旱脅迫的防御反應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究成功克隆到‘草原4號紫花苜蓿MsJAR1基因，其開放閱讀框長1 740 bp，編碼579個氨基酸殘基，屬于GH3家族成員。亞細胞定位顯示該蛋白定位于葉綠體，在葉片和花中表達量最高，且受薊馬取食、鹽脅迫和干旱脅迫誘導表達，說明MsJAR1基因可能參與苜蓿對薊馬、干旱和鹽脅迫的防御反應(yīng)。

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（責任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-12-06；修回日期：2024-01-18

基金項目：內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學校“青年科技英才支持項目”（NJYT23009）；國家自然科學基金（32160333；32060388）；苜蓿分子育種體系構(gòu)建及種質(zhì)創(chuàng)制（BR22-11-12）；苜蓿新品種選育及制繁種關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)（CCPTZX2023B04）;內(nèi)蒙古自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新項目（S202311029）資助

作者簡介：

代蕊（1999-），女，蒙古族，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，主要從事草育種方面研究，E-mail：18747659997@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：zhangzq19890102@126.com;Mfgui@yahoo.com.cn