蒲石 沈成全 胡鼎 趙新釗 秦瑞澤 劉昌學 王永華

［摘要］ 目的

探討TGF-β對膀胱癌組織中巨噬細胞來源腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAF）的影響及其機制。

方法 采用Kaplan-Meier法分析膀胱癌組織中α-SMA+CD68+CAF表達水平與患者的總生存率（OS）的關(guān)系；采用免疫熒光技術(shù)檢測α-SMA+CD68+CAF在膀胱癌組織中的浸潤情況；采用Western blot實驗檢測TGF-β對α-SMA+CD68+CAF體外誘導作用。同時構(gòu)建膀胱癌小鼠模型，采用免疫熒光技術(shù)和免疫組化法檢測TGF-β對膀胱癌小鼠體內(nèi)α-SMA+CD68+CAF的誘導作用及對CD8+T細胞浸潤的影響。

結(jié)果 膀胱癌組織中α-SMA與CD68的表達呈正相關(guān)，且α-SMA+CD68+CAF高表達的患者預后更差（χ2=9.05，P<0.05）。免疫熒光技術(shù)檢測結(jié)果顯示，膀胱癌組織中存在α-SMA+CD68+CAF。Western blot實驗檢測結(jié)果顯示，TGF-β可顯著促進α-SMA+CD68+CAF的生成。膀胱癌小鼠模型體內(nèi)實驗顯示，TGF-β可促進膀胱癌組織中α-SMA+CD68+CAF的生成，從而抑制CD8+T細胞的浸潤。

結(jié)論 TGF-β可顯著促進膀胱癌組織中巨噬細胞來源CAF的生成，從而抑制CD8+T細胞的浸潤。

［關(guān)鍵詞］ 轉(zhuǎn)化生長因子β；癌相關(guān)成纖維細胞；膀胱腫瘤；腫瘤相關(guān)巨噬細胞；免疫耐受；CD8陽性T淋巴細胞；細胞浸潤

［中圖分類號］ R737.14??? ［文獻標志碼］ A

隨著近年來腫瘤免疫治療的興起，以PD-1/PD-L1為代表的免疫檢查點抑制劑在腫瘤免疫治療中取得了良好的效果，但對于晚期膀胱癌患者存在著免疫治療反應(yīng)低及耐藥等問題，限制了其在臨床中的應(yīng)用[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌免疫治療耐藥的產(chǎn)生與免疫抑制腫瘤微環(huán)境的形成有關(guān)[2]，而腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAF）是免疫抑制腫瘤微環(huán)境形成的重要因素之一[3]，但膀胱癌中CAF的具體來源尚不清楚。近年來在腫瘤微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了表達成纖維標志物的腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）[4-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、TAM、CAF與膀胱癌患者免疫治療耐藥密切相關(guān)[7-8]，由此推測TGF-β可通過誘導TAM向CAF轉(zhuǎn)化，參與膀胱癌免疫治療耐藥性的產(chǎn)生。本研究通過體內(nèi)外實驗觀察膀胱癌組織中TGF-β對巨噬細胞來源的CAF的影響，探討膀胱癌中TAM向CAF轉(zhuǎn)化的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 膀胱癌組織中α-SMA與CD68表達相關(guān)性及Kaplan-Meier（K-M）生存曲線分析

通過TCGA-BLCA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）收集膀胱癌患者的臨床信息，以及膀胱癌組織中α-SMA與CD68 mRNA的表達水平，并通過Spearman方法分析α-SMA與CD68表達水平的相關(guān)性。根據(jù)CD68高表達膀胱癌組織中的α-SMA表達水平將患者分為高、低表達組，采用K-M法分析α-SMA+CD68+CAF表達水平與患者的總生存率（OS）的關(guān)系。

1.2 儀器與試劑

鼠源性膀胱癌細胞MB49購自武漢普諾賽生命科技有限公司。12只4周齡的C57B16/N小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。α-SMA、CD68、CD8、GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，TGF-β、重組小鼠巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）購自上海MedChemExpress LLC，十二烷基硫酸鈉（SDS）裂解液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，HRP偶聯(lián)二抗購自美國Jackson Immuno Research公司。FITC、PE抗體購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。熒光顯微鏡購買于美國Olympus life science公司，EVOS FL Auto顯微鏡購買于加拿大Thermo Fisher公司。

1.3 臨床樣本的收集

收集2023年5月—2023年8月于青島大學附屬醫(yī)院泌尿外科行全膀胱切除術(shù)的10例患者的膀胱癌組織及其正常膀胱組織，正常膀胱組織距癌灶邊緣5 cm以上。隨后將提取的膀胱癌組織及正常膀胱組織經(jīng)脫水、石蠟包埋后制成5 μm厚的石蠟切片。患者術(shù)前均未接受過新輔助化療、放療或免疫治療。

1.4 小鼠骨髓源性巨噬細胞（BMDM）向CAF的轉(zhuǎn)化誘導

4周齡C57B16/N小鼠脫頸處死后，用1 mL注射器從其脛骨、股骨和髂骨骨髓腔中抽取骨髓和細胞混合液，離心后收集骨髓細胞。將骨髓細胞接種于含有10%熱滅活胎牛血清（FBS）和含50 μg/L M-CSF的DMEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后，按照相關(guān)文獻報道的方法[9]，通過流式細胞術(shù)檢測細胞中CD68+巨噬細胞的濃度，當超過95%的細胞為CD68+細胞時，則認為BMDM培養(yǎng)成功。

將BMDM細胞接種于24孔板中，分為對照組和TGF-β組，TGF-β組中每孔加入含10% FBS及5 μg/L TGF-β的DMEM培養(yǎng)基150 μL，對照組中每孔加入含10% FBS以及PBS的DMEM培養(yǎng)基150 μL，將24孔板置于37 ℃含體積分數(shù)0.05的CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，用于后續(xù)實驗。

1.5 Western blot實驗檢測BMDM細胞中α-SMA蛋白表達量

取培養(yǎng)5 d后的上述兩組BMDM細胞，吸出24孔板中的原培養(yǎng)液，每孔加入1 mmol/L SDS裂解液裂解細胞，收集細胞懸液并12 000 r/min離心30 min，分離上清液，使用BCA試劑盒檢測各樣本中的蛋白濃度。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒制備SDS-PAGE凝膠，每孔上樣20 μL蛋白樣品后，80 V電泳30 min，120 V電泳1 h，隨后290 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h。室溫牛奶封閉2 h，將膜與α-SMA一抗（1∶4 000）4 ℃下孵育過夜。次日再將膜與HRP偶聯(lián)二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h。洗膜后用增強化學發(fā)光試劑盒顯影。采用Image J軟件檢測各個條帶的灰度值，以GAPDH（1∶10 000）為內(nèi)參，計算各目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.6 膀胱癌小鼠模型的建立

將12只C57BL/6N小鼠在25 ℃下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，取密度1×1010個/L的鼠源性膀胱癌細胞MB49細胞懸液500 μL，皮下接種于小鼠左腹股溝，將小鼠隨機分為對照組與實驗組，每組6只。當接種部位出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤時，實驗組小鼠尾靜脈注射含5 μg/L TGF-β的PBS 100 μL，對照組小鼠尾靜脈注射等體積PBS，兩組小鼠均每2 d注射一次。飼養(yǎng)至第30天時麻醉后處死兩組小鼠，完整剝離出腫瘤組織，置于4%甲醛中固定，依次經(jīng)脫水、石蠟包埋后制成5 μm厚的石蠟切片。

1.7 免疫熒光技術(shù)檢測膀胱癌患者及小鼠組織切片中的α-SMA、CD68表達

將膀胱癌患者的腫瘤組織和正常組織石蠟切片，以及小鼠腫瘤組織的石蠟切片60 ℃下烘烤2 h，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水、蒸餾水水化后，置于抗原修復液中高壓煮沸20 min，并以1% ABS封閉1 h。將切片分別與稀釋以后的α-SMA（1∶400）、CD68（1∶400）一抗在4 ℃下孵育過夜。次日室溫下與熒光二抗孵育1 h，使用DAPI染色劑染色細胞核。最后加入抗熒光淬滅劑，甘油封片，使用Olympus熒光顯微鏡觀察α-SMA、CD68的熒光染色情況，并用Image J軟件計算α-SMA+CD68+細胞占比（每個視野下α-SMA+CD68+雙陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值）。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.8 免疫組化檢測小鼠切片組織中α-SMA、CD8的表達

將小鼠腫瘤組織石蠟切片依次經(jīng)脫蠟、水化等處理以后，置于檸檬酸鈉抗原修復液（0.01 mol/L，pH 6）當中加熱20 min，冷卻至室溫后，用3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min。將切片分別與α-SMA（1∶200）、CD8（1∶10 000）一抗4 ℃下孵育過夜，第2天室溫下與同種屬的二抗孵育30 min，DAB顯色后，用蘇木素染色劑染色細胞核，脫水封片。使用EVOS FL Auto顯微鏡觀察切片染色情況并拍照，統(tǒng)計每個視野下α-SMA+細胞數(shù)目與CD8+T細胞數(shù)目。實驗重復3次，結(jié)果取均值。

1.9 流式細胞術(shù)檢測BMDM細胞中α-SMA、CD68表達

取培養(yǎng)5 d的兩組BMDM細胞，置于離心管中以1 000 r/min離心15 min，隨后以PBS緩沖液重懸細胞，再以1 000 r/min離心15 min，棄去上清液，隨后在每管中加入300 μL上樣緩沖液重懸，再依次加入5 μL FITC（陽性表示α-SMA+）和10 μL PE（陽性表示CD68+）染色液。最后使用流式細胞儀分析并計算α-SMA+CD68+細胞在BMDM細胞中的占比。

2 結(jié)? 果

2.1 α-SMA+CD68+與膀胱癌患者預后的相關(guān)性

對TCGA數(shù)據(jù)庫相關(guān)數(shù)據(jù)分析顯示，膀胱癌患者腫瘤組織中CAF標記物α-SMA和TAM標記物CD68的表達呈正相關(guān)（R=0.24，P<0.05）。K-M生存曲線分析結(jié)果顯示，α-SMA+CD68+高表達組患者OS明顯低于α-SMA+CD68+低表達組（χ2=9.05，P<0.05）。

2.2 α-SMA+CD68+細胞在膀胱癌患者腫瘤組織中的浸潤情況

免疫熒光染色結(jié)果顯示，膀胱癌患者的腫瘤組織當中存在CAF標記物α-SMA+和TAM標記物CD68+共定位表達的現(xiàn)象，正常組織和腫瘤組織中α-SMA+CD68+細胞占比分別為（0.33±0.18）%、（2.84±1.45）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.971，P<0.05）。見圖1。

2.3 TGF-β對α-SMA+CD68+細胞體外誘導作用

Western blot實驗的檢測結(jié)果顯示，對照組和TGF-β組BMDM細胞中α-SMA蛋白相對表達量為分別為0.01±0.01、0.69±0.08，差異有統(tǒng)計學意義（t=15.41，P<0.05）。見圖2。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，TGF-β組中α-SMA+CD68+細胞占比明顯高于對照組。見圖3。

2.4 TGF-β對膀胱癌小鼠體內(nèi)α-SMA+CD68+細胞的誘導作用及對CD8+T細胞浸潤的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組以及實驗組小鼠腫瘤組織當中α-SMA+CD68+細胞占比分別為（1.33±1.10）%、（23.25±9.15）%，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.120，P<0.05）。見圖4。切片免疫組化染色結(jié)果顯示，對照組和實驗組小鼠腫瘤組織中每個視野下α-SMA+細胞數(shù)目分別為（10.74±5.46）、（40.93±6.87）個，差異具有統(tǒng)計學意義（t=8.432，P<0.05），對照組和實驗組的腫瘤組織中每視野下CD8+T細胞數(shù)目分別為（61.81±11.25）、（10.07±5.54）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=10.10，P<0.05）。見圖5。

3 討? 論

腫瘤微環(huán)境是目前影響腫瘤治療的主要因素之一[10]，CAF是腫瘤微環(huán)境中最豐富的基質(zhì)細胞類型，具有高度異質(zhì)性和多功能性[11-13]，其與腫瘤的惡性進展、侵襲轉(zhuǎn)移以及不良預后密切相關(guān)[14-16]。有研究表明CAF可通過增強腫瘤微環(huán)境中細胞外基質(zhì)（ECM）的硬度從而阻礙免疫細胞的浸潤[17-18]。

此外CAF還可通過釋放細胞因子促進血管生成以加快腫瘤的惡性進展[19]。因此，深入探索CAF的形成分化、分子分型以及其在腫瘤免疫抑制微環(huán)境形成中的作用，對于闡明膀胱癌免疫治療耐藥性的機制，克服膀胱癌免疫治療目前面臨的反應(yīng)性低、耐藥性等瓶頸問題具有重要意義。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析巨噬細胞標志物CD68與成纖維細胞標志物α-SMA之間的相關(guān)性，并檢測臨床樣本中兩種標志物的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中α-SMA表達與CD68表達存在正相關(guān)，且在膀胱癌腫瘤組織中α-SMA、CD68共定位表達現(xiàn)象明顯高于正常膀胱組織，提示在膀胱癌腫瘤微環(huán)境中存在巨噬細胞來源的CAF細胞，即α-SMA+CD68+CAF細胞，目前已被證實腫瘤微環(huán)境中的CAF來源于多種細胞途徑，如內(nèi)皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等[20]。CHEN等[21]研究顯示，TGF-β可加快腎臟纖維化的進展，而骨髓源性巨噬細胞是纖維化中成纖維細胞的主要來源[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌和神經(jīng)母細胞癌中TAM與CAF水平顯著相關(guān)[4]，臨床上，巨噬細胞標志物的CAF也被認為是口腔鱗狀細胞癌患者預后不良的指標[24]，這提示α-SMA+CD68+CAF細胞可能在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，但對于α-SMA+CD68+CAF細胞的具體作用機制及相關(guān)信號通路目前尚不清楚。

為了進一步研究α-SMA+CD68+CAF細胞對腫瘤微環(huán)境的影響以及相關(guān)的信號通路，本研究通過TGF-β干預BMDM細胞的方式來嘗試體外誘導α-SMA+CD68+CAF細胞生成，通過Western blot方法檢測α-SMA蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β干預后BMDM細胞中α-SMA蛋白的表達水平明顯上調(diào)，這提示TGF-β可能在誘導α-SMA+CD68+CAF細胞生成過程中發(fā)揮作用。本研究的流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，TGF-β干預后α-SMA+CD68+CAF細胞數(shù)明顯多于對照組。上述結(jié)果提示TGF-TGF-β/Smad3通路是骨髓源性巨噬細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)化的重要通路[25]。TGF-β/Smad3信號傳導的失調(diào)與腫瘤發(fā)生和纖維化顯著相關(guān)，該通路可將成纖維細胞重編程從而導致CAF活化[26]，其主要通過調(diào)節(jié)ECM積累和CAF活化來發(fā)揮促腫瘤作用[22]。TANG等[9]通過單細胞測序研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中，Smad3可通過TGF-β/Smad3通路促進巨噬細胞來源的CAF生成，并通過促進ECM及新生血管生成來加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，TGF-β還可通過抑制免疫細胞的功能參與腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成[27]。本研究通過構(gòu)建膀胱癌小鼠模型來驗證TGF-β對于α-SMA+CD68+CAF細胞生成及免疫微環(huán)境的影響，通過免疫熒光技術(shù)檢測小鼠腫瘤組織中α-SMA與CD68的共定位表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入TGF-β后，小鼠腫瘤組織中α-SMA+CD68+CAF細胞明顯增多，這進一步說明TGF-β促進了α-SMA+CD68+CAF細胞的生成。研究顯示，CAF通過分泌ECM形成物理屏障，進而阻礙免疫細胞（如T細胞）浸潤，以及參與免疫抑制微環(huán)境的形成[28]，而TGF-β是促進腫瘤微環(huán)境當中CAF生成的關(guān)鍵信號通路[9]。本研究通過給予膀胱癌小鼠TGF-β處理并通過免疫組化檢測α-SMA與CD8+T細胞染色情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β的干預促進了小鼠腫瘤組織中α-SMA+細胞的生成，同時其還抑制了小鼠腫瘤組織中CD8+T細胞的浸潤，提示TGF-β可通過促進α-SMA+CD68+CAF生成，來抑制免疫細胞浸潤，從而參與免疫抑制微環(huán)境的形成。

總之，本研究在膀胱癌腫瘤微環(huán)境中檢測到了α-SMA+CD68+CAF細胞，并揭示了TGF-β參與免疫抑制腫瘤微環(huán)境形成的機制，可能是通過促進α-SMA+CD68+CAF的生成，進一步抑制了免疫細胞的浸潤。本研究有助于進一步闡明膀胱癌免疫治療的耐藥機制，為抑制膀胱癌免疫治療耐受提供了數(shù)據(jù)參考。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會的審核批準（文件號QYFYWZLL28770）。所有研究過程均遵照《赫爾辛基宣言》的規(guī)定進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學醫(yī)學倫理委員會的審核批準（文件號20230714C571820230-905032）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的規(guī)定進行。

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