劉艷萍 張得芳 文懷秀

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.019

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.019

收稿日期：2023-03-28? 修回日期：2023-08-04

基金項目：國家自然科學基金（32170239）；青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實驗室（2022-ZJ-Y01）。

第一作者：劉艷萍，女，碩士研究生，研究方向為微生物與植物互作。E-mail：1576354728@qq.com

通信作者：張得芳，女，博士，副研究員，研究方向為植物抗逆。E-mail：defangstart2011@163.com

文懷秀，女，博士，副研究員，研究方向為植物內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物及其功能。E-mail：whx@nwipb.cas.cn

摘? 要? 為探明唐古特白刺（Nitraria tangutorum Bobr.）的內(nèi)生真菌種屬及其組織分布特性，采用傳統(tǒng)組織塊法從生長于鹽堿土壤的白刺中分離內(nèi)生真菌，運用形態(tài)學和真菌ITS序列分析進行種屬鑒定，并通過MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，從白刺（根、莖、葉）分離得到23 株內(nèi)生真菌，共鑒定出21 株，其中鏈格孢屬（Alternaria）13 株，毛殼菌屬（Chaetomium）1株，籃狀菌屬（Talaromyces）3 株，細基格孢屬（Ulocladium）4 株，主要分布于唐古特白刺的根部，葉次之，莖則無。表明白刺內(nèi)生真菌分布具有組織差異，根是其侵染和定殖的主要部位。

關(guān)鍵詞? 唐古特白刺；內(nèi)生真菌；分離；鑒定；鹽堿土壤

土壤鹽堿化嚴重限制了林草植被及農(nóng)作物生長發(fā)育，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力、生態(tài)環(huán)境健康和經(jīng)濟等構(gòu)成極大威脅［1］。在長期的生物進化過程中，鹽生植物通過形成獨特的調(diào)節(jié)機制、適應鹽土生境的形態(tài)和生理特性以應對鹽堿脅迫［2］。研究表明，植物對脅迫的耐受性與其相關(guān)微生物有關(guān)［3］，與根際細菌的相互作用相比，寄主植物與內(nèi)生菌的相互作用可直接影響植物特性［4］。

植物內(nèi)生真菌是指在其生活史的部分階段或全部階段寄生于健康的植物組織或器官內(nèi)，且對植物不表現(xiàn)出明顯病害癥狀的一類真菌［5］。內(nèi)生真菌可以通過提供營養(yǎng)物質(zhì)來促進宿主植物生長發(fā)育以及產(chǎn)生活性物質(zhì)或信號轉(zhuǎn)導增強宿主抗逆能力［6-7］。許多研究表明內(nèi)生真菌具有一定的耐鹽堿能力，內(nèi)生菌可以通過促進鹽堿脅迫下植物對土壤養(yǎng)分和水分的吸收以緩解鹽害，從而提高植物生物量，維持植物正常生長發(fā)育［8］。內(nèi)生真菌對鹽堿脅迫下宿主植物的促生作用具體可表現(xiàn)在促進營養(yǎng)吸收［9］、誘導產(chǎn)生植物激素［10］、促進光合作用［11］等方面。此外，植物生理學的研究表明滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫是鹽脅迫對植物的主要危害［12-14］，而植物內(nèi)生菌對鹽堿脅迫的緩解機制通常表現(xiàn)在合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、誘導抗氧化系統(tǒng)、維持離子平衡、誘導抗鹽堿相關(guān)基因表達等方面［15-17］。

唐古特白刺（Nitraria tangutorum Bobr.）是蒺藜科（Zygophyllceae）白刺屬（Nitraria L.）的一種落葉灌木，在中國主要分布于青海、新疆、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等西北部、北部地區(qū)［18］。由于其根系發(fā)達，具有很強的抗風沙、抗鹽堿、抗旱耐熱能力而被作為中國西北荒漠地區(qū)改良鹽堿地、水土保持及防風固沙的先鋒樹種［19］。其果實有“沙漠櫻桃”之美譽，是西部蒙、藏、維等少數(shù)民族的習性用藥材，其入藥記載于《中國沙漠地區(qū)藥用植物》，具有健脾胃、滋補強壯、調(diào)經(jīng)活血的功能，其葉則作為民間藥用于治療痙攣、神經(jīng)痛和心律不齊等癥［20］。

近年來，對唐古特白刺耐鹽堿特性的研究主要集中在高鹽堿地引種試驗、白刺愈傷組織抗氧化酶活性、鹽脅迫下白刺超微結(jié)構(gòu)的改變、鹽脅迫誘導的代謝圖譜的變化以及響應鹽脅迫的蛋白質(zhì)組學分析等方面［21-25］，為揭示唐古特白刺的耐鹽堿機制奠定了基礎。唐古特白刺作為典型的鹽生植物可能與其內(nèi)生真菌形成了某種互作機制以適應鹽堿生境，因此了解白刺內(nèi)生真菌組成將有助于更好地解釋唐古特白刺的鹽堿適應性和耐鹽堿機制，但目前未見有關(guān)研究報道。

基于此，本試驗采用傳統(tǒng)的植物組織塊法分離鹽堿土壤中唐古特白刺內(nèi)生真菌，運用形態(tài)學和ITS序析進行內(nèi)生真菌種屬鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，探討白刺內(nèi)生真菌的種類及分布特點，為下一步研究白刺內(nèi)生真菌與其抗鹽堿特性之間的關(guān)系提供重要參考依據(jù)，同時為鹽堿地恢復與治理的菌劑開發(fā)提供物質(zhì)基礎。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

試驗所用的2 a生野生白刺新鮮植物樣本（包含根、莖、葉）于2021年7月在青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣諾木洪農(nóng)場附近鹽堿地（東經(jīng)94°44′～99°46′，北緯36°44′，海拔2 794 m）采集，采集時將白刺植株根部附近土壤連塊挖出，并且避免傷到其根系組織。共采集樣本10份，采集地土樣pH為8.90，土壤電導率為727 μS/cm，樣品采集完用信封密封后置于低溫采樣箱中，24 h內(nèi)返回實驗室，用流水沖洗根系表面土壤，無菌濾紙吸干表層水分以備后續(xù)菌株分離。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 植物組織表面消毒? 將沖洗干凈的白刺植物組織剪成3～5 cm的小段，用無菌去離子水浸泡1～2 h，放置濾紙上待水分吸干后移入無菌操作臺中，按照以下步驟進行表面消毒處理：先用無菌鑷子夾取樣品在75%乙醇中浸泡3 min，無菌水沖洗4～5次，快速將其放入到8% NaClO溶液中浸泡3～5 min，將樣品放入到無菌水中，充分洗滌4～5次，用無菌濾紙吸干組織表面殘留的水分。

1.2.2? 內(nèi)生真菌的分離純化? 內(nèi)生真菌分離采用傳統(tǒng)的組織塊培養(yǎng)法［26］，根、莖、葉各14個平板，每個平板3個組織塊，根、莖、葉各42個組織塊。利用解剖刀切取植物組織，葉片切成0.5 cm2，莖和根切成0.5 cm3小塊，接種到PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)。采用組織印跡法和漂洗液檢測法作為對照處理［27］，以驗證表面消毒是否徹底，分離出的真菌為內(nèi)生真菌。培養(yǎng)1周后將具有明顯菌落差異的真菌采用菌絲尖端切割法進行純化［28］。

1.2.3? 白刺內(nèi)生真菌的鑒定? 形態(tài)學鑒定：每天觀察并記錄PDA平皿中菌落的直徑、顏色、形態(tài)、生長速度。采用插片培養(yǎng)法觀察菌絲及孢子形態(tài)，用乳酸酚棉蘭染液進行染色后蓋上蓋玻片在光學顯微鏡（尼康儀器 （上海） 有限公司）下進行鏡檢，并結(jié)合各個菌株的菌落形態(tài)，對照《真菌鑒定手冊》［29］進行形態(tài)鑒定。分子生物學鑒定：按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明，提取真菌基因組DNA，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海捷瑞生物工程有限公司測序。

1.2.4? ITS序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建? 將測序所得ITS序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù) 據(jù) 庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov /Blast.Cgi）中進行Blast比對分析，選擇相似度最大的序列，使用MEGA7.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。kimura 2-parameter model計算進化距離，1 000 次重復檢驗發(fā)育樹的可靠性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 內(nèi)生真菌分離結(jié)果

從采自鹽堿土壤的唐古特白刺中共分離得到23株菌株，其中根中分離到的最多，共22 株，1 株來自葉，莖中未分離到。分離培養(yǎng)時所設置的對照組均未出現(xiàn)菌落，說明消毒徹底，所培養(yǎng)得到菌株均為內(nèi)生真菌。菌株編號見表1。

2.2? 內(nèi)生真菌形態(tài)學鑒定

觀察并記錄菌株在培養(yǎng)過程中的形態(tài)特征，培養(yǎng)時間均為7 d，形態(tài)學特征如圖1所示，菌絲顯微特征見圖2。將純化菌株的菌落特征與菌絲特性的觀察結(jié)果與《真菌鑒定手冊》進行比較，初步鑒定分離所得內(nèi)生真菌，形態(tài)學特征描述見? 表2。通過菌落及顯微鏡菌絲形態(tài)初步鑒定? BC-001～BC-007等共13 株菌屬于鏈格孢屬，顯微形態(tài)特征為菌絲細長、分枝、分隔，幼時無色或淡色，漸變?yōu)榍嗪稚?，褐色至暗色；分生孢子多?shù)為倒棒狀、倒梨形、卵形。其余幾株菌株形態(tài)差異大，通過ITS序列分析進行分子生物學鑒定。

a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w依次分別為YBC-001、YBC-002、YBC-003、YBC-004、YBC-005、YBC-006、YBC-007、YBC-008、YBC-009、YBC-010、YBC-011、YBC-012、YBC-013、YBC-014、YBC-015、YBC-016、YBC-017、YBC-018、YBC-019、YBC-020、YBC-021、YBC-022、YBC-023的菌落形態(tài)a，b，c，d，e，f，g，h，i，j，k，l，m，n，o，p，q，r，s，t，u，v，w are the colony morphology of YBC-001，YBC-002，YBC-003，YBC-004，YBC-005，YBC-006，YBC-007，YBC-008，YBC-009，YBC-010，YBC-011，YBC-012，YBC-013，YBC-014，YBC-015，YBC-016，YBC-017，YBC-018，YBC-019，YBC-020 ，YBC-021，YBC-022，and YBC-023，respectively

2.3? 唐古特白刺內(nèi)生真菌ITS序列分析

將測序所得菌株ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，搜索較高同源性序列的GenBank登錄號及序列相似度，下載與其相似度較高的菌株序列作為參考。已獲得的21 條內(nèi)生真菌的序列，與其相似序列的同源性均高于99%，同源性比對結(jié)果如表3所示。BC-001、BC-002、BC-003、BC-004、BC-005、BC-006、BC-007、BC-010、BC-013、BC-017、BC-018、BC-021、BC-022最接近鏈格孢屬（Alternaria），BC-008最接近毛殼菌屬（Chaetomium），BC-009、BC-015、BC-020最接近籃狀菌屬（Talaromyces），BC-011、BC-012、BC-014、BC-023最接近細基格孢屬（Ulocladium）。

還有2 株尚未確定種屬，能通過 ITS 序列鑒定的21 株內(nèi)生真菌全部隸屬于子囊菌門Ascomycota，分屬于3 綱（座囊菌綱Dothideomycetes、散囊菌綱Eurotiomycetes 、糞殼菌綱Sordariomycetes）3 目（格孢腔菌目 Pleosporales、散囊菌目 Eurotiales、糞殼菌目 Sordariales）3 科（格孢腔菌科Pleosporaceae、毛殼菌科 Chaetomiaceae、發(fā)菌科Trichocomaceae）4 屬（鏈格孢屬Alternaria、毛殼菌屬Chaetomium、籃狀菌屬Talaromyces、細基格孢屬Ulocladium）。其中鏈格孢屬（Alternaria）是白刺內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬，其余菌屬的菌株數(shù)目相當，均為1～4 個。

2.4? 唐古特白刺內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)前述BLAST比對分析結(jié)果，選取15 個近緣種的菌株，相似度均大于99%，21 個菌株全部隸屬于子囊菌門（Ascomycota），因此選取擔子菌門（Basidiomycota）的3個物種作為外類群，其物種信息見表4。利用聚類分析MEGA 7.0中的Neighbor-Joining程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析白刺內(nèi)生真菌各菌株的親緣關(guān)系，見圖3。

試驗獲得的菌種序列均與其相似菌株聚類在一起，表明這些菌株應為同一種屬。從圖1可見，根據(jù)親緣關(guān)系可被分為Ⅰ（自檢支持率99%）、Ⅱ（自檢支持率99%）和Ⅲ（自檢支持率99%）3枝，并且能夠與外源菌株明顯分開。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示出各菌株與其相似菌株的關(guān)系與 BLAST 比對結(jié)果一致，21株菌株聚為4枝，分別為鏈格孢屬Alternaria（13 株）、細基格孢屬Ulocladium（4 株）、籃狀菌屬Talaromyces（3 株）、毛殼菌屬Chaetomium（1 株），各菌株分類位置清晰。其中細基格孢屬和鏈格孢屬為相似屬，細基格孢屬被歸至鏈格孢屬，作為屬下不同的組群，因此二者親緣關(guān)系較近。

3? 討? 論

本試驗采用傳統(tǒng)的組織塊分離法從采自于鹽堿地的白刺中分離培養(yǎng)出21 株內(nèi)生真菌，經(jīng)ITS序列分析鑒定均為子囊菌類，分別屬于3 綱3 目4 屬。其中鏈格孢屬是白刺植株內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬，該屬內(nèi)生真菌也廣泛分布于其他鹽生植物中，如翅堿蓬、鹽角草、黑果枸杞、蘆葦、甘草等［30-34］，這是由于鏈格孢屬（Alternaria）種類多樣，可作為腐生菌、寄生菌和內(nèi)生菌，易侵染各種植物［35］。

本試驗從白刺根、莖、葉中分離內(nèi)生真菌，結(jié)果僅在白刺根、葉中分離出數(shù)量有限的內(nèi)生真菌，除了與試驗過程中分離培養(yǎng)條件、植物組織特性以及用于分離真菌的組織數(shù)目有關(guān)外，還可能與植物內(nèi)生真菌分離的難易程度有關(guān)，植物體內(nèi)存在的某些內(nèi)生真菌由于不適合生長在某種培養(yǎng)基上而出現(xiàn)特性退化和消失［36］。因此今后在內(nèi)生真菌分離中應采用多種選擇性分離培養(yǎng)基，優(yōu)化培養(yǎng)條件，盡可能多的分離獲得內(nèi)生真菌。此外，白刺內(nèi)生真菌的分布具有一定的組織差異性，本研究中內(nèi)生真菌對根的侵染頻率最高，可能是因為在植物整個生命周期中，根部生長發(fā)育最早，發(fā)育時間也最長，有利于真菌的生長定殖，并且根部生境直接與土壤相接觸，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，適宜真菌生長，土壤中存在的大量真菌亦可入侵根部組織從而演變?yōu)閮?nèi)生真菌［37］。

試驗中分離到的白刺內(nèi)生真菌大多數(shù)都是傳統(tǒng)病原菌，易造成植物病害，如鏈格孢屬（Alternaria）、細基格孢屬（Ulocladium）可以引起植物葉片枯萎或長斑［38-40］，造成一定的經(jīng)濟損失，籃狀菌（Talaromyces）的某些種如馬爾尼菲籃狀菌則為人類和動物的機會病原菌［41］。但作為內(nèi)生真菌定殖時對宿主植物具有有益作用，可以促進植物生長或提高耐鹽性，鏈格孢屬內(nèi)生真菌定殖鹽脅迫條件下的番茄植株具有更高的根莖生物量，同時還通過降低活性氧含量以應對鹽脅迫［42］。細基格孢屬能夠在初始pH為10、鹽濃度為10%的培養(yǎng)基中生長［43］。從藜麥中分離出的內(nèi)生真菌籃狀菌屬真菌Talaromyces minioluteus在鹽脅迫下能通過改善抗氧化酶和非酶系統(tǒng)來提高藜麥的耐鹽能力［44］?？梢娔承┱婢赡茏陨砭哂兄虏⌒?，但由于成為內(nèi)生真菌定殖于植物宿主，可轉(zhuǎn)變?yōu)橛幸娴恼婢ㄟ^直接和間接的機制應對宿主所處的脅迫環(huán)境條件［45］。相關(guān)研究認為，真菌在植物體內(nèi)的這種內(nèi)生菌-病原菌生活方式，可能是因為某些真菌在植物組織不同生育期扮演不同的角色，在健康植物組織中可是內(nèi)生真菌，但當寄主植物衰老、環(huán)境改變就會表現(xiàn)出其致病性，這是內(nèi)生菌-宿主共存后隨時間“協(xié)同進化”的體現(xiàn)［46-47］。

鹽生植物生存的高鹽環(huán)境對植物生長發(fā)育及其相關(guān)微生物具有明顯的抑制作用，但植物自身可為相關(guān)微生物提供相應生態(tài)位，以減輕環(huán)境對微生物的脅迫，同時，內(nèi)生真菌也可在不利環(huán)境中發(fā)揮功能作用，以協(xié)助寄主適應逆境和生長［48-49］。因此，筆者猜測，從生長于鹽堿土壤的白刺中分離得到的這些內(nèi)生真菌，與白刺本身具有的抗鹽堿作用之間有一定的關(guān)聯(lián)，可能是內(nèi)生真菌在長期進化中獲得了植物本身的部分特性，以適應特殊的生存環(huán)境，達到與植物共同進化的目的。而鏈格孢屬（Alternaria）作為鹽堿地上白刺內(nèi)生真菌主要優(yōu)勢種屬，其對白刺可能有著抗逆、促生等作用，相關(guān)假設有待深入研究驗證。

4? 結(jié)? 論

本研究從生長于鹽堿土壤的唐古特白刺中共分離并鑒定得到21 株內(nèi)生真菌，結(jié)合形態(tài)學鑒定以及真菌ITS序列分析發(fā)現(xiàn)分屬于4個屬：鏈格孢屬Alternaria（13 株）、細基格孢屬Ulocladium（4 株）、籃狀菌屬Talaromyces（3 株）、毛殼菌屬Chaetomium（1 株）。結(jié)果表明，唐古特白刺內(nèi)生真菌的分布存在明顯組織差異。

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Isolation and Identification of Endophytic Fungi in Nitraria tangutorum Bobr.in Saline Soil

LIU Yanping1，ZHANG Defang1，2 and WEN Huaixiu3

（1.Qinghai Academy of Agriculture and Forestry，Qinghai University，Xining? 810016，China; 2.Laboratory for

Research and Utilization of Qinghai Plateau Germplasm Resources，Xining? 810016，China; 3.Qinghai

Provincial Key Laboratory of Tibetan Medicine Research and Key Laboratory of Tibetan Medicine Research，

Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining? 810008，China）

Abstract? To explore the species and tissue distribution charateristics of endophytic fungi in Nitraria tangutorum Bobr.，we isolated fungi from N.tangutorum Bobr.growing in saline soil by traditional tissue block method.The species were identified by morphology and fungal ITS sequence analysis，and a phylogenetic tree was constructed by MEGA? 7.0.The results showed that 23 strains of endophytic fungi were isolated from different parts of N.tangutorum Bobr.（roots，stems，leaves），with 21 strains identified.These included thirteen strains of Alternaria， one strain of Chaetomiumthree strains of，Talaromyce，and four strains of Ulocladium.The predominant distribution was observed in，the roots of N.tangutorum Bobr.? followed by leaves，and stems.The results suggest? distinct tissue-based difference in the distribution of endophytic fungi，with the root being the most vulnerable infection and colonization.

Key words? Nitraria tangutorum Bobr.; Endophytic fungi; Isolation; Identification; Saline alkali soil

Received ??2023-03-28??? Returned? 2023-08-04

Foundation item? The National Natural Science Foundation of China （No.32170239）; Laboratory for Research and Utilization of Qinghai Tibet Plateau Germplasm Resources （No.2022-ZJ-Y01）.

First author? LIU Yanping，female，master student.Research area：interactions between microorganisms and plants.E-mail：1576354728@qq.com

Corresponding?? author? ZHANG Defang，female，Ph.D，associate research fellow.Research area：plant stress resistance.E-mail：defangstart2011@163.com

WEN Huaixiu，female，Ph.D，associate research fellow.Research area：secondary metabolites of plant endophytes and their functions.E-mail：whx@nwipb.cas.cn

（責任編輯：潘學燕? Responsible editor：PAN Xueyan）