摘要過氧亞硝酸根離子（ONOO?）是非?；钴S的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）物種，因具有高氧化性和強硝化性而備受關(guān)注。ONOO?作為一種重要的生理活性分子，其在體內(nèi)的水平異常會損害細胞中的蛋白質(zhì)和DNA，從而導(dǎo)致生物體內(nèi)炎癥和其它嚴(yán)重疾病的發(fā)生。近年來，研究者利用熒光檢測技術(shù)實現(xiàn)了對生物活性分子的快速且靈敏的監(jiān)測，并借助成像工具進行了高分辨率示蹤，其中開發(fā)了許多用于檢測ONOO?的有機小分子熒光探針。本文評述了近年來基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和激發(fā)態(tài)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ESIPT）等多種熒光響應(yīng)機理構(gòu)建的ONOO?熒光檢測方法的最新研究進展。

關(guān)鍵詞過氧亞硝酸根離子；熒光檢測；熒光響應(yīng)機理；評述

過氧亞硝酸根離子（ONOO?）是一種內(nèi)源性氧化劑和親核試劑，在一些病理狀態(tài)和衰老過程中起中介作用，由于具有瞬態(tài)和低穩(wěn)定態(tài)特性，在生物化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展迅速。在生物體內(nèi)， ONOO?可通過超氧自由基和一氧化氮（NO）之間的擴散控制反應(yīng)而生成，對細胞成分具有強硝化性，可對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 造成不可逆的損害[1]；此外， ONOO?的異常表達被認為是許多疾病的關(guān)鍵致病因素，包括神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、炎癥和癌癥等[2]。因此，建立靈敏且高效的生物系統(tǒng)內(nèi)ONOO?活性分析檢測方法對基礎(chǔ)研究、臨床診斷和病理探究等方面具有重要意義。

目前， ONOO?的檢測方法有分光光度法[3]、化學(xué)發(fā)光法[4]、電子順磁共振法[5]、免疫化學(xué)法[6]、色譜法[7]和熒光光譜法[8]等。其中，熒光光譜法因具有操作簡便、靈敏度高、可實時監(jiān)測以及易實現(xiàn)原位成像等優(yōu)點而備受關(guān)注[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，探針分子通常會經(jīng)過氧化反應(yīng)（苯硼酸或苯硼酸酯、酰肼、苯并吡喃和吲哚酮）、水解反應(yīng)（二苯基亞磷酸酯）以及基于C=C/C=N 鍵氧化裂解等對ONOO?進行反應(yīng)識別[11-15]?；谶@些識別反應(yīng)類型已開發(fā)出基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ESIPT）和聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）等多種熒光響應(yīng)機理的熒光檢測方法。隨著熒光成像技術(shù)的快速發(fā)展，這些基于不同熒光機理設(shè)計的熒光探針已在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病、炎癥、肝腎肺功能性疾病、腫瘤及癌細胞檢測等病理模型中實現(xiàn)了對ONOO?的檢測應(yīng)用[16]。本文以熒光響應(yīng)機理為基礎(chǔ)，系統(tǒng)地評述了近年來有機小分子探針對ONOO?的熒光檢測及其檢測響應(yīng)機理的研究進展。

1 有機小分子熒光探針檢測ONOO?的研究進展

1.1 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移

ICT 指一類具有典型的D-π-A 或D-A 結(jié)構(gòu)的熒光探針分子所引起的熒光響應(yīng)機理，可以產(chǎn)生明顯的推-拉電子效應(yīng)，在特定的激發(fā)波長條件下，通過π電子共軛體系使供體基團與受體基團部分反應(yīng)前后的能隙差發(fā)生變化，進而實現(xiàn)ICT，產(chǎn)生強烈的熒光信號。此類響應(yīng)機理通常在比率型熒光探針分子中應(yīng)用廣泛，能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)分析物的靈敏檢測。

硼酸芐酯或硼酸酯結(jié)構(gòu)骨架經(jīng)常應(yīng)用于ICT 型探針分子的設(shè)計合成策略，用于構(gòu)建比率型[17-23]或“Turn-on”型[24-29]熒光探針分子，實現(xiàn)對ONOO?的高效檢測。以萘酰亞胺結(jié)構(gòu)探針分子為例簡述其反應(yīng)機理。如圖1 所示， ONOO?首先攻擊硼原子，并通過氧化重排生成硼酸苯酯，通過水解和去除二烯酮生成化合物1；負氧離子的給電子能力強于烷氧基，這將導(dǎo)致ICT 效應(yīng)在激發(fā)態(tài)下形成強“推-拉”體系，并導(dǎo)致去質(zhì)子化化合物1 的吸收峰和熒光峰的波長大于原分子（圖1A）[19]。2022 年， Sun 等[19]基于上述機理，通過引入對甲苯磺酰胺作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向基團構(gòu)建了一種比率型熒光探針F1（圖1B），該探針具有靈敏度高（6 s）和選擇性強的特點，被成功應(yīng)用于抑郁小鼠的海馬中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處內(nèi)源性O(shè)NOO?的成像檢測。Wang 等[27]引入硼酸芐酯基團構(gòu)建了“Turn-on”型探針分子F2（圖1B），在寬pH 值范圍（pH 7.0～11.5）內(nèi)對ONOO?顯示出高熒光響應(yīng)，在同一激發(fā)波長（421 nm）下，響應(yīng)前存在弱的ICT 效應(yīng)，熒光不明顯；響應(yīng)后分子本身強的ICT 效應(yīng)使500 nm 處出現(xiàn)強熒光發(fā)射，基于此成功監(jiān)測了癌細胞和正常細胞中ONOO?的含量。相較于比率型熒光探針分子，“Turn-on”型探針分子與ONOO?響應(yīng)后的熒光檢測效果更好。

磷酸二苯酯或二苯基磷酰胺結(jié)構(gòu)骨架經(jīng)常應(yīng)用于ICT 型探針分子的設(shè)計合成策略[30-35]。2019 年，Yuan 等[30]在異氟爾酮分子骨架中引入基于磷酸二苯酯結(jié)構(gòu)合成了探針分子F3， F3 與ONOO?響應(yīng)后可觀察到665 nm 處的熒光明顯增強，實現(xiàn)了活細胞和斑馬魚中ONOO?的熒光檢測，推測其相關(guān)反應(yīng)機理為：ONOO?首先攻擊磷原子并通過氧化重排生成化合物2，進一步水解脫除二苯基磷酸形成強ICT 效應(yīng)分子化合物3，達到熒光增強的目的（圖2A）?；谙嗤淖R別基團及熒光機理， Luo 等[34]以苯并吡喃腈為母核構(gòu)建了雙光子熒光探針分子F4（圖2B）， F4 與ONOO?反應(yīng)，導(dǎo)致原探針結(jié)構(gòu)中的磷酰胺鍵斷裂并形成氨基，使得ICT 效應(yīng)恢復(fù)，在685 nm 處發(fā)出近紅外熒光信號，檢出限為151 nmol/L，實現(xiàn)了大鼠癲癇模型中ONOO?的熒光成像檢測。Sonawane 等[35]基于苯并吲哚菁結(jié)構(gòu)設(shè)計了探針分子F5（圖2B）。與F4 相比， F5 雖然在近紅外區(qū)沒有熒光響應(yīng)，但其特有的鹽類結(jié)構(gòu)使得探針的水溶性增強，具有更高的ONOO?檢測靈敏度（檢出限為47.8 nmol/L， 吸收紅移91 nm）。

大共軛結(jié)構(gòu)骨架經(jīng)常被引入ICT 型探針分子的設(shè)計合成策略，以獲得比率型熒光探針分子[36-39]。2020 年， Lu 等[37]基于雙鍵氧化機理，以羅丹明結(jié)構(gòu)為母核構(gòu)建了探針分子F6（圖2C），吸收光譜表明，F(xiàn)6 在600 nm 處出現(xiàn)明顯的吸收峰， 414 nm 有一個弱的吸收峰；熒光光譜顯示，隨著加入的ONOO?濃度增大， 564 nm 處的熒光發(fā)射逐漸增強， 700 nm 處的熒光發(fā)射強度不斷降低，這可能是因為ONOO?觸發(fā)了探針分子結(jié)構(gòu)中的聯(lián)二烯橋斷裂，破壞了熒光分子特定的ICT 結(jié)構(gòu)。F6 被成功應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理模型中ONOO?表達水平的檢測，檢出限低至28.06 nmol/L。2021 年， Li 等[38]設(shè)計并合成了探針分子F7（圖2C），其識別機理與F6 類似。F7 與ONOO?作用后，在500 nm 激發(fā)波長下，在548 nm 處的熒光強度增強，在662 nm 處的熒光強度減弱。F7 具有優(yōu)異的靈敏度，基于I548/I662 比率型熒光變化檢出限為47 nmol/L。對比實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在母核結(jié)構(gòu)相同的條件下（圖2C），延長共軛骨架可增加探針分子的發(fā)射波長，并可更好地應(yīng)用于ONOO?的高靈敏檢測。

此外，還有其它結(jié)構(gòu)的ICT型探針分子結(jié)構(gòu)[40-44]。Liu等[40]基于萘酰亞胺結(jié)構(gòu)設(shè)計合成了“Turn-on”型探針分子F8（圖3A），與ONOO?發(fā)生反應(yīng)后，裸露的氨基使得化合物4 的ICT 效應(yīng)增強，在548 nm 處的熒光明顯增強，與其它“Turn-on”型探針不同的是， F8 與ONOO?作用后吸收峰由460 nm 藍移至431 nm。Wang 等[44]設(shè)計合成了“Turn-off”型探針分子F9，在ONOO?存在的條件下， F9 的熒光信號在19 s 內(nèi)降低了40 倍。F9 可以特異性靶向肝臟，用于監(jiān)測藥物引起的肝毒性后的體內(nèi)肝保護藥物的治療效果（圖3A）。

扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（TICT）是一種會淬滅熒光并大幅降低染料光穩(wěn)定性的光物理過程。在此過程中，分子的給體或受體片段逐漸扭轉(zhuǎn)至垂直構(gòu)型，使得電荷完全分離。抑制TICT 的發(fā)生能夠顯著提高熒光強度和光穩(wěn)定性，多數(shù)的TICT 型熒光探針分子主要應(yīng)用于細胞微環(huán)境中黏度的檢測。近年來， TICT型熒光探針分子也被用于ONOO?和黏度的雙響應(yīng)熒光檢測[45-46]。2020 年， Deng 等[45]將長共軛的N，N-二甲基苯基及苯硼酸引入喹啉結(jié)構(gòu)中，構(gòu)建了探針分子F10，在ONOO?的作用下， F10 脫除苯硼酸得到更強的熒光響應(yīng)（420 nm 激發(fā)，在635 nm 處熒光增強），被成功應(yīng)用于藥物誘導(dǎo)肝毒性中ONOO?和黏度的雙響應(yīng)檢測（圖3B）。長共軛結(jié)構(gòu)的引入，不僅可實現(xiàn)探針分子對ONOO?長發(fā)射波長的熒光響應(yīng)，而且可構(gòu)建ONOO?和黏度雙響應(yīng)探針分子，進一步擴大其生物成像應(yīng)用范圍。

1.2 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移

PET 是指熒光探針分子的基態(tài)受到光等外界因素刺激后，其熒光團的電子從最高能量占據(jù)軌道（HOMO）躍遷至最低能量未占軌道（LUMO），形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，進而發(fā)生輻射躍遷，由于受到識別基團分子軌道電子的影響，激發(fā)態(tài)電子回到基態(tài)的過程被阻礙，導(dǎo)致熒光發(fā)生猝滅。在實際熒光分子設(shè)計過程中，將PET 響應(yīng)機理引入到相關(guān)探針分子設(shè)計中，可得到開關(guān)型的熒光探針分子，表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性及靈敏度，在金屬離子和小分子檢測等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

氟硼二吡咯（BODIPY）經(jīng)常作為優(yōu)勢骨架結(jié)構(gòu)應(yīng)用于PET 型探針分子的設(shè)計與合成[47-49]。2016 年，Miao 等[47]基于BODIPY 結(jié)構(gòu)構(gòu)建了熒光探針F11（圖4A）， F11 與ONOO?結(jié)合之前具有強烈的PET 效應(yīng)，自身沒有熒光產(chǎn)生；與ONOO?反應(yīng)幾秒后， PET 猝滅過程即被阻斷，熒光響應(yīng)增強，基于此實現(xiàn)了ONOO?的超靈敏檢測（lt;2 nmol/L）。羅丹明及其衍生物也經(jīng)常作為優(yōu)勢骨架應(yīng)用于PET 型探針分子的設(shè)計與合成[50-54]。2018 年， Miao 等[50]設(shè)計了以Si-羅丹明為母核的熒光探針F12（圖4B），在ONOO?的氧化作用下， F12 的PET 效應(yīng)被有效抑制，熒光強度顯著增強，實現(xiàn)了對ONOO?的熒光檢測，并能夠?qū)崿F(xiàn)對活細胞、組織和動物外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO?的熒光成像標(biāo)記。此外，通過修飾其它常見類型的熒光母核也可實現(xiàn)對ONOO?的“Turn-on”響應(yīng)，得到具有不同熒光性能的PET 型熒光探針分子[55-57]。如以香豆素和萘二酰亞胺為母核的熒光染料通過引入不同的識別基團分別構(gòu)建了具有雙響應(yīng)性能的探針F13[56]與能夠產(chǎn)生雙光子響應(yīng)的探針F14[57]（圖4C）。

1.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

FRET 是通過合適的連接基團使供體（Donor， D）與受體（Acceptor， A）之間的能量發(fā)生轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生不同的熒光信號變化。在探針分子設(shè)計過程中引入FRET 熒光機理，可增加熒光探針分子的斯托克斯（Stokes）位移；另外，通過兩個發(fā)射波長強度的比值大小對目標(biāo)分析物進行比率型檢測可彌補單一發(fā)射波長對目標(biāo)分析物定量檢測的不足。

2016 年， Jia 等[ 58]通過乙?；?哌嗪-己酰基將兩類不同花菁類分子進行修飾得到探針F15，與ONOO?作用后， F15 分子結(jié)構(gòu)被破壞，抑制了分子內(nèi)的FRET 效應(yīng)，使得熒光發(fā)生顯著變化。F15 被用于線粒體內(nèi)ONOO?的比率型成像檢測研究。Cheng 等[59]通過在苯并吡喃鎓受體結(jié)構(gòu)中引入香豆素穩(wěn)定供體熒光團，制備了線粒體靶向雙光子定量熒光探針F16，利用FRET 效應(yīng)的變化成功實現(xiàn)了炎癥小鼠模型中內(nèi)源性O(shè)NOO?的檢測和成像。在此基礎(chǔ)上， Xu 等[60]繼續(xù)引入萘酰亞胺結(jié)構(gòu)構(gòu)建熒光探針F17，用于關(guān)節(jié)炎模型中ONOO?的早期檢測和評估。Sun 等[61]將萘酰亞胺熒光團與羅丹明B 熒光團通過柔性哌啶連接形成雙光子熒光探針F18， F18 以二甲基氨基為溶酶體靶基團，分子中酰肼部分可特異性識別ONOO?，成功實現(xiàn)了在活細胞、組織和斑馬魚中ONOO?的雙發(fā)射通道成像檢測。Liu 等[62]通過哌啶及酰胺烷基鏈將Si-羅丹明結(jié)構(gòu)與氧雜蒽結(jié)構(gòu)結(jié)合，制備了近紅外熒光和光聲雙模態(tài)分子探針F19。F19 本身具備FRET 效應(yīng)，在ONOO?存在條件下，氧雜蒽雙鍵被氧化為醛基，熒光團原有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)被破壞。F19被用于藥物性急性腎損傷中ONOO?的成像分析。2021 年， Liu 等[63]將羅丹明螺內(nèi)酰胺與萘酰亞胺熒光團結(jié)合制備了線粒體靶向探針F20，利用F20 能夠在不同的熒光波長下對過氧亞硝酸鹽和溶酶體融合引發(fā)的線粒體吞噬過程進行研究。

FRET 型探針分子中通常包含1～2 種熒光團，如花菁類染料、香豆素類、萘酰亞胺結(jié)構(gòu)、羅丹明及其衍生物等，利用這些探針分子可實現(xiàn)ONOO?的比率型檢測，具有響應(yīng)迅速和靈敏度高等優(yōu)點（表1）。

1.4 激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移

ESIPT 是處于激發(fā)態(tài)的熒光探針分子內(nèi)質(zhì)子供體（如羥基或氨基基團）與相鄰質(zhì)子受體（如亞胺或羰基基團）之間發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移從而形成互變異構(gòu)體，導(dǎo)致探針分子的發(fā)射波長紅移。

2016 年， Sedgwick 等[64]基于苯并噻唑結(jié)構(gòu)引入識別基團芐基硼酸酯得到探針分子F21，在ONOO?存在條件下，探針分子脫除芐基硼酸酯生成“Turn-on”型高熒光強度化合物6，化合物6 的熒光強度是探針F21 的4.5 倍（圖5A）。2-（2-羥基苯基）苯并噻唑分子結(jié)構(gòu)（HBT）[65-72]常被用作ESIPT 型探針分子的優(yōu)勢骨架，通過與目標(biāo)化合物的作用使得質(zhì)子供體羥基與相鄰的氫鍵受體亞胺結(jié)構(gòu)之間發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，進而形成互變異構(gòu)體，導(dǎo)致探針分子的熒光增強（圖5B）。2021 年， Li 等[69]基于HBT 結(jié)構(gòu)制備了蝶形熒光探針F22， ESIPT 效應(yīng)及固態(tài)熒光性質(zhì)使得F22 具有大Stokes 位移（216 nm），對ONOO?具有高靈敏度，檢出限為5 nmol/L， 定量限為21 nmol/L， 可應(yīng)用于潛在指紋檢測。Li 等[70]在HBT 基礎(chǔ)上引入2-肼基喹啉得到“ESIPT+AIE”型探針分子F23，在pH 3～10 條件下， F23 對ONOO?實現(xiàn)快速靈敏響應(yīng)（檢測時間6 s，檢出限為5.1 nmol/L）。Fu 等[71]將2-苯并噻唑乙腈結(jié)構(gòu)與萘酰亞胺結(jié)合制備了探針分子F24，與ONOO?作用后， F24 在518 nm 下熒光增強34 倍，并在1～14 mmol/L 的范圍內(nèi)顯示出良好的線性關(guān)系，檢出限為37 nmol/L（圖5B）。

此外，當(dāng)探針分子結(jié)構(gòu)中質(zhì)子供體為羥基質(zhì)子且受體為羰基時，也容易產(chǎn)生ESIPT 效應(yīng)[73-75]。Wang 等[74]在分子結(jié)構(gòu)中引入三苯胺結(jié)構(gòu)，構(gòu)建“ESIPT+AIE”型探針分子F25， Stokes 位移為142 nm，當(dāng)ONOO?濃度在0～10 μmol/L 范圍時存在線性響應(yīng)，檢出限為10 nmol/L，在632 nm 下熒光增強161 倍，可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中ONOO?的成像檢測。Yu 等[75]在黃酮熒光團結(jié)構(gòu)中引入芐基硼酸酯，構(gòu)建大Stokes位移（133 nm）ESIPT型探針分子F26，成功實現(xiàn)了HeLa細胞和斑馬魚中ONOO?的檢測（圖5C）。

綜上， ESIPT 型探針分子具有大的Stokes 位移，對ONOO?表現(xiàn)出高靈敏度和高選擇性，可實現(xiàn)低濃度范圍內(nèi)的線性檢測。

1.5 其它響應(yīng)機理及雙響應(yīng)機理。

隨著熒光技術(shù)的迅速發(fā)展，基于其它響應(yīng)機理的熒光探針分子也被用于ONOO?的檢測研究[76-78]。2022 年， Wen 等[76]基于π共軛機理構(gòu)建了探針分子F27。ONOO?不存在時，電子云聚焦在共軛苯并吡喃腈結(jié)構(gòu)單元上；ONOO?存在時，羅丹明內(nèi)酯開環(huán)，使電子云集中在黃嘌呤核上并產(chǎn)生比率熒光信號變化（480 nm 激發(fā)，在570 nm 處熒光發(fā)射增強， 670 nm 處熒光減弱），成功應(yīng)用于活體細胞、炎癥組織和APAP 誘導(dǎo)的肝毒性中ONOO?的波動監(jiān)測（圖6A）。鍵內(nèi)能量轉(zhuǎn)移（TBET）熒光探針通過化學(xué)反應(yīng)調(diào)節(jié)能量受體的能級間隙而控制能量傳遞，該機理不需要能量供體和受體之間的光譜重疊，只需要能量間隙存在差異，即可實現(xiàn)兩個發(fā)射信號的基線分離，從而減少發(fā)射之間的串?dāng)_，高能量傳遞效率可顯著提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，因此這種機理已成為構(gòu)建比率型熒光探針的經(jīng)典策略。Hu 等[77]基于TBET 機理構(gòu)建了線粒體靶向雙光子比率熒光探針F28。隨著線粒體黏度降低和ONOO?含量升高，在810 nm 雙光子激發(fā)下， F28 的最大發(fā)射波長由621 nm 移至495 nm， 兩個發(fā)射峰的基線顯著分離（Δλ = 126 nm），提高了生物成像的分辨率和可靠性（圖6B）。

此外，研究者結(jié)合以上兩種響應(yīng)機理開發(fā)了新型熒光探針分子用于ONOO?的檢測研究。2018 年，Guo 等[79]基于TBET 和ICT 雙機理構(gòu)建了近紅外（720 nm）熒光探針F29， ONOO?存在時，硼酸酯轉(zhuǎn)化為苯酚，導(dǎo)致供體的能量增加以匹配受體的能量，同時實現(xiàn)供體和受體之間的TBET 和ICT 效應(yīng)，導(dǎo)致紅移區(qū)域中的熒光“Off-on”，并產(chǎn)生較大的發(fā)射偏移（183 nm）， 檢出限為3.54 mmol/L（圖7A）。Zhou 等[80]設(shè)計合成了“PET+ICT”型雙光子熒光探針F30，其檢測機理如下：1，4-二羥基苯通過PET 效應(yīng)有效地猝滅了分子自身的熒光，抑制了ICT 過程， ONOO?存在時， 1，4-二羥基苯易被氧化脫除，由于增強的ICT 效應(yīng)和形成羥基所誘導(dǎo)的PET 抑制效應(yīng)，使得萘酰亞胺的強熒光恢復(fù)，基于此實現(xiàn)了急性肝損傷小鼠肝臟中ONOO?的檢測（圖7A）。2022 年， Sun 等[81]選擇HBT 骨架結(jié)合氰基苯形成“PET+ESIPT”型熒光探針F31，當(dāng)pH 值從8.0 降至3.0 時，探針在525 和710 nm 處的熒光信號增加了約4 倍。其中， 525 nm 處的熒光變化主要歸因于PET 效應(yīng)， 710 nm 處的熒光增強主要歸因于酸誘導(dǎo)的開閉循環(huán)。ONOO?存在時，525 nm 處的熒光增加了5 倍，而710 nm 處的熒光強度顯著減弱，由此產(chǎn)生了不同的熒光強度變化，在I525/I710 處表現(xiàn)出明顯的比率型熒光變化（圖7A）。Zhou 等[82]在羅丹明基礎(chǔ)上通過連接基團引入萘酰亞胺結(jié)構(gòu)，得到具有“PET+FRET”型響應(yīng)雙機理的探針分子F32（圖7B）， F32 能夠?qū)崿F(xiàn)在不同通道下分別監(jiān)測細胞中pH 值和內(nèi)源性O(shè)NOO?熒光成像變化，實現(xiàn)了比率型檢測。Jing 等[83]將苯并吡喃鎓與香豆素?zé)晒鈭F通過哌啶連接形成雙位點“ICT+FRET”型熒光探針F33（圖7B），可實現(xiàn)線粒體中GSH 與ONOO?的同時檢測，并且發(fā)現(xiàn)GSH 的耗竭和ONOO?的間接形成與APAP 誘導(dǎo)的肝損傷有關(guān)， GSH 可有效緩解APAP 誘導(dǎo)的肝損傷。

2 總結(jié)與展望

隨著熒光檢測技術(shù)的飛速發(fā)展， ONOO–的熒光檢測方法研究取得了很大進展，并且在疾病病理模型中廣泛應(yīng)用。本文主要對探針分子本身或與ONOO–響應(yīng)前后所產(chǎn)生的ICT、PET、FRET、ESIPT 及其它雙效應(yīng)熒光響應(yīng)機理方面的研究進展進行了評述。從目前的研究情況分析， ONOO–的熒光檢測研究仍存在發(fā)展空間：（1）熒光探針分子具有不可逆的響應(yīng)特性，無法實現(xiàn)ONOO–的動態(tài)/實時檢測；（2）探針分子的發(fā)射波長僅停留在可見光區(qū)或NIR-Ⅰ區(qū)，尤其是NIR-Ⅱ區(qū)ONOO–的熒光檢測報道甚少，因此，需要基于ICT 響應(yīng)機理引入長共軛結(jié)構(gòu)，進一步開發(fā)新型長波長的探針分子，以增加其組織穿透深度，更加有效地應(yīng)用到疾病的診斷和治療中；（3）探針分子的水溶性有限，生物毒性較高，抗干擾性和穩(wěn)定性較差，因此，可在后續(xù)設(shè)計過程中結(jié)合雙響應(yīng)機理構(gòu)建多功能分子，借助聚合物或者納米技術(shù)提高水溶性及生物相容性；（4）探針分子在疾病病例模型中的選擇性和靈敏度有待提高，因此，仍需基于PET 和FRET響應(yīng)機理設(shè)計合成生物活性穩(wěn)定、靈敏度高、特異性強和靶向性好的熒光探針。未來，希望基于更多新型響應(yīng)機理建立ONOO–的熒光探針設(shè)計合成策略，也可通過多種響應(yīng)機理結(jié)合的形式進一步改善探針的光穩(wěn)定性、生物分析的選擇性和靈敏度以及目標(biāo)組織和器官的靶向性。

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