摘 要： 以35株生豬屠宰場(chǎng)及養(yǎng)殖場(chǎng)來源的金黃色葡萄球菌分離菌株為試驗(yàn)材料，分析金黃色葡萄球菌對(duì)苯扎溴銨敏感性與生物被膜形成能力的相關(guān)性。采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)苯扎溴銨的敏感性，結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物被膜形成能力，基于全基因組測(cè)序結(jié)果分析屠宰環(huán)節(jié)的26株金黃色葡萄球菌多位點(diǎn)序列分型（multi-locus sequence typing，MLST）情況，以及消毒劑抗性與生物被膜形成相關(guān)基因的攜帶情況。結(jié)果表明，35株菌中，苯扎溴銨的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）范圍為1 mg·L-1～16 mg·L-1，強(qiáng)成膜能力菌株共16株，占總數(shù)的45.71%（16/35），其中93.75%（15/16）來自于屠宰鏈的下游。ST7是強(qiáng)成膜能力菌株的優(yōu)勢(shì)序列型（93.75%，15/16）。金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力和苯扎溴銨MBC值呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.690），而消毒劑抗性與相關(guān)基因攜帶情況無關(guān)。綜上，金黃色葡萄球菌可通過形成生物被膜提高對(duì)消毒劑的耐受性，減弱了苯扎溴銨的消毒效果，增加了養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)中細(xì)菌污染和傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞： 金黃色葡萄球菌；生物被膜；苯扎溴銨；相關(guān)性

中圖分類號(hào)：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3669-09

收稿日期：2023-09-16

基金項(xiàng)目：“十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFD1800400）

作者簡(jiǎn)介：崔恒潔（1998-），女，湖北荊州人，碩士，主要從事食源性致病菌研究，E-mail： 912761217@qq.com

通信作者：孟憲榮，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生和動(dòng)物性食品安全方向的科研工作，E-mail： xianrongmeng@mail.hzau.edu.cn

Correlation Analysis of Benzalkonium Bromide Sensitivity and Biofilm Formation Ability

in Staphylococcus aureus

CUI" Hengjie1， QIN" Jinlong1， ZHU" Zhihao1， BAO" Xue1， LI" Shaowen1， 2， MENG" Xianrong1， 2*

（1.College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，" China;

2.Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Hubei Province， College of Veterinary Medicine，

Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，" China）

Abstract：" Overall 35 strains of Staphylococcus aureus （S. aureus） isolated from one pig slaughterhouse and different pig farms were used as experimental materials to analyze the correlation between the susceptibility of benzalkonium bromide and the biofilm formation ability. Sensitivity to benzalkonium bromide and ability to form biofilms of S. aureus strains were determined using the micro-dilution broth method and the crystal violet staining test， respectively. The multi-locus sequence typing （MLST） and the carrying of genes related to disinfectant resistance and biofilm formation of 26 strains of S. aureus from the slaughterhouse were analyzed based on whole-genome sequences. The results showed that among the 35 strains， the minimum bactericidal concentration （MBC） of benzalkonium bromide ranged from 1 mg·L-1 to 16 mg·L-1， and there were 16 strains with strong biofilm-forming ability， accounting for 45.71% （16/35） of the total， of which 93.75% （15/16） were recovered samples collected from downstream in the slaughter chain. ST7 was the dominant type of S. aureus with strong biofilm-forming ability （93.75%， 15/16）. The benzalkonium bromide MBC value of S. aureus was positively correlated with biofilm formation ability （Correlation coefficient=0.690）， not withthe disinfectance has nothing to do with the gene. In conclusion， biofilm formation may increase S. aureus resistance to disinfectants， weaken the disinfection effect of benzalkonium bromide， thus enhance the risk of bacterial contamination and transmission in breeding and slaughtering.

Key words： Staphylococcus aureus; biofilm; benzalkonium bromide; correlation

*Corresponding author： MENG Xianrong， E-mail： xianrongmeng@mail.hzau.edu.cn

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， S. aureus）是一種重要的人獸共患病原菌，可通過產(chǎn)生腸毒素導(dǎo)致人食物中毒，我國每年約有20%～25%的細(xì)菌性食物中毒病例由S. aureus引起［1］。豬肉是我國第一大肉類消費(fèi)品，保障豬肉食品安全尤為重要。屠宰作為豬肉流入市場(chǎng)前的最后一道關(guān)卡，是保障肉類食品安全的關(guān)鍵，也是易造成食源性致病菌污染的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)步驟［2］。

陳星雨［3］2019年對(duì)湖北省不同屠宰場(chǎng)進(jìn)行S. aureus污染狀況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)某屠宰場(chǎng)S. aureus檢出率顯著高于其他屠宰場(chǎng)，冷庫環(huán)節(jié)S. aureus分離率為49.18%，顯著高于電麻環(huán)節(jié)（27.27%），S. aureus在該屠宰場(chǎng)沿屠宰鏈進(jìn)行傳播，交叉污染問題嚴(yán)重。苯扎溴銨是一種國內(nèi)最常見的季銨鹽類陽離子表面活性消毒劑，殺菌力強(qiáng)，對(duì)皮膚和組織無刺激性，對(duì)金屬、橡膠制品無腐蝕作用［4］，是屠宰企業(yè)常用消毒劑的主要成分［5］。陳姿頤［6］以該屠宰場(chǎng)分離的119株S. aureus為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)其對(duì)新潔爾滅（有效成分為苯扎溴銨）的敏感性，發(fā)現(xiàn)其最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration， MBC）普遍較高。分離菌對(duì)新潔爾滅敏感性低的原因尚不清楚。

生物被膜是細(xì)菌在生物或非生物表面聚集形成的一種聚合物，呈三維結(jié)構(gòu)，由胞外基質(zhì)及其包裹著的菌體組成。以生物被膜形式存在的細(xì)菌不同于浮游細(xì)菌，它們對(duì)抗生素等殺菌劑、惡劣環(huán)境及宿主免疫防御機(jī)制有很強(qiáng)的抗性［7］。生物被膜的形成導(dǎo)致殺菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的作用效果減弱，給病原菌的防控帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)［8-9］。為此，本研究在陳星雨［3］和陳姿頤［6］研究的基礎(chǔ)上，擬通過測(cè)定S. aureus的生物被膜形成能力及其對(duì)苯扎溴銨的敏感性，并分析二者的相關(guān)性，探討該生豬屠宰場(chǎng)S. aureus高檢出率的原因，為屠宰企業(yè)有效防控S. aureus污染提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

2019年3月和4月于湖北省某生豬屠宰場(chǎng)各環(huán)節(jié)及其配套養(yǎng)殖場(chǎng)采樣后分離、鑒定并保存35株S. aureus，具體菌株信息見表1。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 29213，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 藥品與試劑

Baird-Parker（BP）瓊脂基礎(chǔ)、卵黃亞碲酸鉀增菌劑、Mueller-Hinton（MH）瓊脂、MH肉湯、Lysogeny Broth（LB）產(chǎn)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；苯扎溴銨產(chǎn)自上海麥克林生化科技有限公司；冰乙酸（分析純）、葡萄糖（分析純）產(chǎn)自上海國藥集團(tuán)；1%結(jié)晶紫溶液產(chǎn)自北京索萊寶生物科技有限公司；E.Z.N.A. bacteria DNA Extraction Kit產(chǎn)自美國Omega Bio-tek公司。

1.3 金黃色葡萄球菌對(duì)苯扎溴銨敏感性的測(cè)定

將凍存菌液于BP培養(yǎng)基上活化，挑取典型單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10 h，然后將菌液濃度調(diào)整為1×106 CFU·mL-1，置于冰上備用。在96孔板中用MH肉湯對(duì)苯扎溴銨進(jìn)行倍比稀釋，使其濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg·L-1，每孔90 μL。取上述稀釋好的菌液10 μL接種至孔板中，第12列不加，作為陰性對(duì)照。37℃孵育20～24 h，觀察結(jié)果。以抑制菌液可見生長的最低濃度為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC），從高于MIC孔兩個(gè)濃度梯度的疑似澄清孔中吸取50 μL培養(yǎng)液，均勻涂布到MH瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后觀察。以平板中菌落數(shù)小于5個(gè)的最低濃度作為該消毒劑對(duì)S. aureus的MBC。

1.4 金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力的測(cè)定

將S. aureus濃度調(diào)整為1×106 CFU·mL-1，以1∶9的比例接種至含1%葡萄糖的MH肉湯中，每孔共100 μL，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，30℃孵育24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)物，用超純水洗滌3次，每次150 μL·孔-1，晾干；向孔內(nèi)加入125 μL 1%結(jié)晶紫染色液，染色15 min，使用流水緩慢清洗染液，晾干；向孔內(nèi)加入33%冰乙酸，每孔150 μL，振蕩溶解10 min，置于酶標(biāo)儀下測(cè)定其D630 nm值。

依據(jù)臨界值Dc（Dc等于空白孔的平均D值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)差），以界定生物被膜的形成能力并對(duì)菌株進(jìn)行分類：若Dc＜D≤2 Dc，則為弱成膜菌（+）；若2 Dc＜D≤4 Dc，為中等成膜菌（++）；若D＞4 Dc，則為強(qiáng)成膜菌（+++）［10］。

1.5 全基因組測(cè)序

對(duì)26株屠宰場(chǎng)來源S.aureus進(jìn)行全基因組測(cè)序以進(jìn)一步在基因水平上進(jìn)行分析。使用E.Z.N.A. bacteria DNA Extraction Kit提取S. aureus基因組DNA，委托安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司進(jìn)行細(xì)菌二代測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina，測(cè)序系統(tǒng)為NovaSeq 6000測(cè)序系統(tǒng)。下機(jī)數(shù)據(jù)使用FastQ-tools （https：∥github.com/dcjones/fastq-tools）進(jìn)行質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)過濾，然后使用SPAdes ver 3.14.1進(jìn)行基因組組裝［11］，Quast ver 5.0.2評(píng)估基因組組裝質(zhì)量［12］，Prokka進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和基因組注釋［13］。

1.6 金黃色葡萄球菌分子分型

利用屠宰場(chǎng)來源的26株S. aureus全基因組測(cè)序結(jié)果，按照MLST數(shù)據(jù)庫要求的數(shù)據(jù)格式導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫（https：∥pubmlst.org/bigsdb？db=pubmlst_saureus_seqdefamp;page=sequenceQuery），最終獲得對(duì)應(yīng)菌株的ST型。

1.7 全基因組在線分析

將基因組信息與CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）數(shù)據(jù)庫（https：∥card.mcmaster.ca/analyze/rgi）和NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)比匹配和注釋獲取消毒劑抗性相關(guān)和生物被膜相關(guān)基因（判定標(biāo)準(zhǔn)為identity≥80%；coverage≥80%）［14］。包括編碼附屬基因調(diào)節(jié)因子Agr、細(xì)胞間黏附操縱子IcaADBC及其負(fù)調(diào)節(jié)因子IcaR、纖維蛋白原結(jié)合蛋白FnBPA和FnBPB、凝集因子ClfA和ClfB、附屬調(diào)控蛋白SarA、絲氨酸-天冬氨酸重復(fù)序列蛋白SdrC、SdrD和SdrE、應(yīng)激因子SigB、核酸酶Nuc的基因以及與消毒劑抗性相關(guān)的qac基因。

1.8 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 20.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，-1表示負(fù)相關(guān)性，1表示正相關(guān)性，越接近于-1或者1則相關(guān)性越強(qiáng)。使用Adobe Illustrator 2021和R包中pheatmap對(duì)基因組分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 金黃色葡萄球菌對(duì)苯扎溴銨的敏感性

35株S. aureus對(duì)苯扎溴銨的敏感性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。苯扎溴銨對(duì)S. aureus的MBC范圍為1 mg·L-1～16 mg·L-1，通過與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較，可將菌株分為“敏感、較不敏感、不敏感”三個(gè)梯度，比值≤1判定為敏感，比值為2判定為較不敏感，比值≥4判定為不敏感［15-16］，其對(duì)應(yīng)的苯扎溴銨MBC值分別為1 mg·L-1～2 mg·L-1、4 mg·L-1和8 mg·L-1～16 mg·L-1。結(jié)果顯示對(duì)苯扎溴銨不敏感的菌株最多，占總數(shù)的45.71%（16/35），而敏感和較不敏感的菌株分別為34.29%（12/35）和20.0%（7/35）。

2.2 金黃色葡萄球菌生物被膜的形成能力

通過結(jié)晶紫染色試驗(yàn)對(duì)S. aureus生物被膜進(jìn)行定量檢測(cè)，得到臨界值Dc為0.0721（±0.006），來源于各環(huán)節(jié)的35株S. aureus生物被膜形成能力如表2所示。S. aureus均可形成生物被膜，強(qiáng)成膜菌最多，占總數(shù)的45.71%（16/35），中等成膜菌和弱成膜菌分別為34.29%（12/35）和20.0%（7/35）。

2.3 菌株來源與苯扎溴銨敏感性的相關(guān)性分析

不同采樣環(huán)節(jié)S. aureus分離株對(duì)苯扎溴銨的敏感性如圖1所示。苯扎溴銨對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)和電麻環(huán)節(jié)生豬鼻腔拭子的分離株的MBC值為1 mg·L-1～4 mg·L-1；對(duì)燙毛池水的分離株的MBC值為8 mg·L-1；來源于脫毛和卸頭環(huán)節(jié)的分離株中對(duì)苯扎溴銨表現(xiàn)為敏感、較不敏感或不敏感；來源于劈半和冷庫環(huán)節(jié)的不敏感菌株所占比例最大，其中苯扎溴銨對(duì)劈半肉樣和冷庫肉樣的分離株的MBC值均為16 mg·L-1。隨著屠宰環(huán)節(jié)的遞進(jìn)，分離株對(duì)苯扎溴銨的敏感性逐漸降低，其中16株不敏感S. aureus均來自屠宰中后期環(huán)節(jié)（脫毛處至冷庫）。

2.4 菌株來源與生物被膜形成能力的相關(guān)性分析

不同采樣環(huán)節(jié)的強(qiáng)、中、弱成膜菌分布情況如圖2所示。養(yǎng)殖場(chǎng)和電麻環(huán)節(jié)生豬鼻腔拭子中僅分離得到1株強(qiáng)成膜菌，中等及弱成膜菌占絕大多數(shù)（91.67%，11/12）；從脫毛環(huán)節(jié)開始，屠宰加工的中后期環(huán)節(jié)都檢測(cè)到強(qiáng)成膜菌株。其中，脫毛環(huán)節(jié)和卸頭環(huán)節(jié)強(qiáng)成膜菌檢出率分別為42.86%（3/7）和33.33%（1/3）；劈半環(huán)節(jié)來源的S. aureus均為強(qiáng)成膜菌，燙毛池水樣中檢出1株S. aureus，也具有強(qiáng)生物被膜形成能力；冷庫環(huán)節(jié)強(qiáng)成膜菌檢出率也較高，該環(huán)節(jié)體表拭子強(qiáng)成膜菌的檢出率為75.0%（3/4），顯著高于肉樣中的檢出率（50.0%，1/2）。16株強(qiáng)成膜菌中15株來自屠宰中后期環(huán)節(jié)（脫毛處至冷庫），占比93.75%（15/16）。

2.5 生物被膜形成能力與苯扎溴銨敏感性的相關(guān)性分析

對(duì)35株S. aureus的成膜能力與其對(duì)苯扎溴銨的敏感性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3所示。斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)為0.690（P＜0.01），表明S. aureus成膜能力和苯扎溴銨MBC值呈正相關(guān)，即生物被膜形成能力越強(qiáng)的菌株對(duì)苯扎溴銨的敏感性越低。

2.6 分子分型與生物被膜、消毒劑抗性相關(guān)基因分析

26株生豬屠宰場(chǎng)來源的S. aureus的MLST分型結(jié)果如圖4所示。共鑒定出3種序列型（ST），即ST7、ST9和ST2867。菌株數(shù)量分別為17株、6株和1株，另有2株未定型。ST7是強(qiáng)成膜菌的優(yōu)勢(shì)型（93.75%，15/16），而ST9和ST2867皆為弱成膜菌或中等成膜菌。電麻環(huán)節(jié)和卸頭環(huán)節(jié)生豬鼻腔拭子中S. aureus的分離株存在3種ST型；脫毛環(huán)節(jié)存在ST7和ST9；ST7是劈半和冷庫環(huán)節(jié)中S. aureus的優(yōu)勢(shì)型，占91.67%（11/12）。

菌株的生物被膜形成和消毒劑抗性相關(guān)基因的檢測(cè)結(jié)果表明，所有菌株含有豐富的生物被膜相關(guān)基因，agrA、clfA、clfB、icaA、icaB、icaC、icaD、icaR、fnbA、fnbB、sarA、sdrC、sdrD、sdrE、sigB和nuc基因檢出率均大于80.77%。僅2株S. aureus攜帶消毒劑抗性相關(guān)基因qacL，其他消毒劑抗性相關(guān)基因如qacA、qacB、qacC、qacE、qacEΔ1、qacG、qacH和qacR均未檢出。

3 討 論

消毒是屠宰場(chǎng)和養(yǎng)殖場(chǎng)解決細(xì)菌交叉污染問題、保障生產(chǎn)衛(wèi)生安全的主要手段。本研究中測(cè)定的苯扎溴銨對(duì)生豬屠宰場(chǎng)和養(yǎng)殖場(chǎng)來源S. aureus的MBC值低于國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的推薦使用濃度［17］。該場(chǎng)中S. aureus檢出率仍高達(dá)28.58%［3］。實(shí)際生產(chǎn)環(huán)境中的有機(jī)物可能影響消毒劑殺菌效果［18-19］。

另外，地球上約有40%～80%的細(xì)菌是以生物被膜的形式存在，S. aureus正是易形成生物被膜的致病菌之一［20-21］。生物被膜由微生物及其分泌物積聚而形成，廣泛存在于各種潮濕表面上，如食品加工設(shè)備、墻壁等［22］。張陽［23］對(duì)廈門某屠宰車間分離的S. aureus進(jìn)行生物被膜形成能力檢測(cè)，強(qiáng)成膜菌占比48.39%（30/62）。相較于浮游菌，生物被膜形成會(huì)降低季銨鹽類化合物殺菌效果［24］?？紤]到消毒劑敏感性測(cè)定試驗(yàn)針對(duì)的主要是浮游菌，因此應(yīng)加大消毒劑對(duì)生物被膜菌的作用效果研究，以滿足實(shí)際消毒實(shí)踐的需要。

結(jié)合分型結(jié)果進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，88.24%（15/17）的ST7型S. aureus為強(qiáng)成膜菌。唐子云等［25］的研究發(fā)現(xiàn)S. aureus成膜能力與ST型存在相關(guān)性，ST7型S. aureus易于形成生物被膜，與本研究結(jié)果一致。另外，結(jié)合菌株來源信息分析發(fā)現(xiàn)，ST7在屠宰后期（劈半和冷庫環(huán)節(jié)）以及環(huán)境樣本（燙毛池水）中顯示出高檢出率，而ST9和ST2867未被檢出，提示這些環(huán)節(jié)的ST7型S. aureus來源于屠宰過程中的工人或環(huán)境，該屠宰場(chǎng)環(huán)境中可能存在ST7型S. aureus持留與交叉污染問題。Kocot和Olszewska［26］發(fā)現(xiàn)，生物被膜在抗逆過程中起到重要作用，且培養(yǎng)72 h的S. aureus生物被膜比24 h的抗性更高，推測(cè)可能是死細(xì)胞作為物理屏障起到了保護(hù)作用。成熟后期生物被膜的總黏附量無明顯上升，長期的營養(yǎng)限制可能導(dǎo)致死細(xì)胞富集于基質(zhì)中，作為存活細(xì)菌的營養(yǎng)來源并增厚了胞外基質(zhì)屏障，導(dǎo)致消毒劑作用效果減弱［27］。本研究結(jié)果表明，93.75%（15/16）的強(qiáng)成膜菌對(duì)苯扎溴銨不敏感，S. aureus對(duì)苯扎溴銨的敏感性與其生物被膜形成能力呈負(fù)相關(guān)。Wang等［28］發(fā)現(xiàn)牛肉中分離的沙門菌也存在這種現(xiàn)象。苯扎溴銨屬于季銨鹽類陽離子消毒劑，S. aureus生物被膜的胞外基質(zhì)主要為胞外多糖［29］。帶負(fù)電的胞外多糖可與季銨鹽陽離子可逆性結(jié)合，顯著阻礙殺菌物質(zhì)的擴(kuò)散［30］。綜上，S. aureus對(duì)苯扎溴銨的敏感性在生豬養(yǎng)殖場(chǎng)及屠宰環(huán)節(jié)中呈規(guī)律性分布，其原因依賴于生物被膜形成能力，即S. aureus強(qiáng)生物被膜形成能力導(dǎo)致其對(duì)消毒劑的高耐受性，與菌株是否攜帶消毒劑抗性基因無關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)湖北省某生豬屠宰場(chǎng)的S. aureus分離株對(duì)苯扎溴銨的敏感性低，且分離株對(duì)苯扎溴銨的敏感性與其生物被膜形成能力呈負(fù)相關(guān)。強(qiáng)生物被膜形成菌株的優(yōu)勢(shì)序列型為ST7，推測(cè)ST7型S. aureus通過形成生物被膜抵抗消毒劑的殺滅作用，從而對(duì)屠宰場(chǎng)環(huán)境造成持續(xù)的污染。相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究，建議屠宰企業(yè)選用能有效清除生物被膜菌的消毒劑。

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（編輯 范子娟）