關(guān)鍵詞三子散；指紋圖譜；化學(xué)模式識(shí)別；含量測(cè)定；質(zhì)量評(píng)價(jià)

蒙藥三子散收載于2020年版《中國(guó)藥典》（一部），由梔子、訶子及川楝子3味藥材組成。方中，梔子清血熱，川楝子清熱、燥黃水，訶子調(diào)和體素、解毒；諸藥合用，共湊清熱涼血、解毒之功效，在改善溫?zé)?、血熱、新久熱等病癥方面效果顯著，常與蒙醫(yī)放血療法配合，用于高血壓、高血脂等疾病的臨床治療[1―3]。

科學(xué)合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系和不斷創(chuàng)新完善的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式是傳統(tǒng)制劑高質(zhì)量發(fā)展的重要前提，三子散現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅包括性狀、鑒別、含量測(cè)定、用法用量項(xiàng)，而含量測(cè)定項(xiàng)中僅以方中梔子所含梔子苷為檢測(cè)指標(biāo)[2―3]，難以反映該制劑的整體特性和內(nèi)在品質(zhì)。近年來(lái)，三子散的相關(guān)研究多集中于物質(zhì)組成、血清移行成分、提取工藝等方面[1，4―6]，而針對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)體系構(gòu)建的研究則較為薄弱。指紋圖譜技術(shù)可有效提取所含成分信息，全面反映飲片或制劑的內(nèi)在化學(xué)特征，已被廣泛應(yīng)用于飲片的真?zhèn)舞b別、優(yōu)劣評(píng)估和制劑質(zhì)量的一致性、穩(wěn)定性評(píng)價(jià)等領(lǐng)域[7]?；瘜W(xué)模式識(shí)別方法具有將多變量信息進(jìn)行降維、分類處理的能力，可克服圖譜多維信息分析這一難題[8]?；诖耍狙芯繑M采用高效液相色譜（HPLC）法構(gòu)建15批三子散的指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析（clusteranalysis，CA）、主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis，OPLS-DA）篩選潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物；同時(shí)，采用HPLC法對(duì)所得潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物進(jìn)行定量分析，從而全面評(píng)價(jià)三子散的質(zhì)量，旨在為該制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系構(gòu)建及臨床安全應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-2030C型HPLC儀、AP135W型十萬(wàn)分之一電子天平（日本Shimadzu公司），BSA224S型萬(wàn)分之一天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，DS-7510DTH型數(shù)控超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)PU0918-0025，純度≥99.0%）、訶子酸對(duì)照品（批號(hào)PS2273-0020，純度≥98.0%）均由成都普思生物科技股份有限公司提供；柯里拉京對(duì)照品（批號(hào)111623-200302，純度≥98.2%）、鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)111959-201903，純度≥98.8%）、西紅花苷Ⅰ對(duì)照品（批號(hào)111588-202205，純度≥98.4%）、梔子苷對(duì)照品（批號(hào)110749-202320，純度≥97.1%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為純凈水。

各飲片均購(gòu)自內(nèi)蒙古北域藥業(yè)有限責(zé)任公司（具體信息見(jiàn)表1），經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室渠弼教授鑒定均為真品。采用隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)不同批次、不同產(chǎn)地飲片進(jìn)行組合，獲得15批三子散樣品（編號(hào)S1～S15，組合信息見(jiàn)表2）。

2 方法與結(jié)果

2.1 三子散的指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

以AgilentEclipseXDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱，甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～10min，15%A→20%A；10～18min，20%A→35%A；18～24min，35%A→40%A；24～35min，40%A→60%A；35～39min，60%A→65%A；39～43min，65%A→82%A；43～50min，82%A→95%A；50～60min，95%A→15%A；60～75min，15%A）；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；進(jìn)樣量為10μL。

2.1.2 對(duì)照品貯備液的制備

精密稱取對(duì)照品沒(méi)食子酸5.26mg、西紅花苷Ⅰ4.67mg、訶子酸4.78mg、柯里拉京3.13mg、梔子苷5.14mg、鞣花酸9.66mg，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲（功率200W，頻率70kHz）溶解，定容，混勻，得上述成分質(zhì)量濃度分別為526.00、467.00、478.00、313.00、514.00、966.00μg/mL的單一對(duì)照品貯備液，于4℃下保存，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備

取三子散樣品（編號(hào)S1）各飲片，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，按處方比例稱取各飲片粉末，充分混勻后精密稱取2.0g，置于50mL錐形瓶中，加5mL甲醇，稱重；超聲（功率200W，頻率70kHz）提取40min，冷卻至室溫；再次稱重，以甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，經(jīng)0.22μm濾膜濾過(guò)，即得指紋圖譜分析用供試品溶液。

2.1.4 飲片及陰性對(duì)照溶液的制備

取三子散樣品（編號(hào)S1）各飲片，粉碎，過(guò)四號(hào)篩，按處方比例稱取各飲片粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別制備梔子飲片、訶子飲片、川楝子飲片的對(duì)照溶液及缺梔子、缺訶子、缺川楝子的陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 精密度考察

取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以16號(hào)峰為參照（峰面積較大，保留時(shí)間適中且較為穩(wěn)定），得各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均不高于1.89%（n＝6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于0.28%（n＝6），表明方法的精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察

取三子散樣品（編號(hào)S1）各飲片，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以16號(hào)峰為參照，得各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均不高于2.11%（n＝6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于0.29%（n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察

取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以16號(hào)峰為參照，得各共有峰相對(duì)峰面積的RSD均不高于2.03%（n＝6），相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不高于0.31%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 指紋圖譜的生成及共有峰指認(rèn)

按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備15批三子散樣品的供試品溶液（編號(hào)S1～S15），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。將所得色譜圖轉(zhuǎn)換為“CDF”格式并導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，采用中位數(shù)法，以S1樣品為參照?qǐng)D譜進(jìn)行指紋圖譜分析（設(shè)置時(shí)間窗為0.1min），經(jīng)多點(diǎn)校正和Marker峰匹配后，生成15批三子散樣品的對(duì)照指紋圖譜（R）和疊加指紋圖譜（圖1）。最終確定共有峰21個(gè)，經(jīng)與各單一對(duì)照品貯備液圖譜（各單一對(duì)照品貯備液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣所得，圖2）比對(duì)，共指認(rèn)了6個(gè)，分別為沒(méi)食子酸（峰3）、梔子苷（峰10）、柯里拉京（峰11）、訶子酸（峰16）、鞣花酸（峰18）、西紅花苷Ⅰ（峰19）。

2.1.9 共有峰歸屬

取“2.1.4”項(xiàng)下各飲片對(duì)照溶液及陰性對(duì)照溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖3），并對(duì)各共有峰歸屬進(jìn)行指認(rèn)。結(jié)果顯示，訶子貢獻(xiàn)了18個(gè)色譜峰，占比85.71%，包括峰1～8（峰3為沒(méi)食子酸）、峰11～18（峰11為柯里拉京、峰16為訶子酸、峰18為鞣花酸）、峰20～21；梔子貢獻(xiàn)了4個(gè)色譜峰，占比19.05%，包括峰5、峰9、峰10（梔子苷）、峰19（西紅花苷Ⅰ）；由于川楝子所含特征成分的紫外吸收較弱[9]，在“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下并未檢測(cè)到相應(yīng)色譜信號(hào)；此外，峰1～4、峰6～8、峰11～18、峰20～21為訶子特征峰，峰9～10、峰19為梔子特征峰，峰5為梔子、訶子共有峰。

2.1.10 相似度評(píng)價(jià)

運(yùn)用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)15批三子散樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，15批三子散樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.994～0.999，表明其整體質(zhì)量差異性較小。然而，15批三子散樣品21個(gè)共有峰相對(duì)峰面積的RSD為6.14%～22.45%，提示不同批次樣品的成分含量可能存在較大差異。

2.2 三子散的化學(xué)模式識(shí)別分析

2.2.1 CA

以15批三子散樣品的21個(gè)共有峰峰面積為變量，借助微生信科研繪圖平臺(tái)（https：//www.bioinformatics.com.cn/），采用完全鏈接法以平方歐氏距離進(jìn)行CA[10]。結(jié)果（圖4）顯示，15批三子散樣品被分為兩大類，S1、S5、S7、S9、S14聚為一類，S2～S4、S6、S8、S10～S13、S15聚為一類，提示不同批次樣品存在一定的質(zhì)量差異。

2.2.2 PCA

以15批三子散樣品的21個(gè)共有峰峰面積為變量，運(yùn)用SIMCA14.1軟件對(duì)其進(jìn)行自動(dòng)規(guī)格化處理后進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的PCA，并獲得PCA得分圖。結(jié)果（圖5）顯示，S1、S5、S7、S9、S14與其他批次樣品明顯分離，其他批次中的S3、S13表現(xiàn)出一定的分離趨勢(shì)。

2.2.3 OPLS-DA和潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物篩選

OPLS-DA結(jié)果顯示，所得模型的累計(jì)解釋能力參數(shù)R2X為0.928、R2Y為0.994，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2cum為0.981，各參數(shù)指標(biāo)均大于0.5，表明OPLS-DA模型構(gòu)建成功[11]；同時(shí)，采用SIMCA14.1軟件進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，所有Q2均在R2之下，且Q2的回歸直線與y軸相交于負(fù)半軸，進(jìn)一步確證了該模型的有效性[9]?；谏鲜瞿Ｐ蜆?gòu)建OPLS-DA得分圖，結(jié)果（圖6）顯示，15批樣品中，S1、S5、S7、S9、S14與S2～S4、S6、S8、S10～S13、S15的離散趨勢(shì)明顯，與CA、PCA結(jié)果基本一致。

本研究進(jìn)一步以變量重要性投影（variableimportanceinprojection，VIP）大于1為標(biāo)準(zhǔn)[12]，篩選潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物。結(jié)果（圖7）顯示，VIP＞1的成分有11個(gè)，對(duì)應(yīng)色譜峰分別為峰11（柯里拉京）、峰14、峰12、峰17、峰21、峰18（鞣花酸）、峰13、峰15、峰8、峰16（訶子酸）、峰2，VIP值分別為1.276、1.266、1.245、1.243、1.239、1.162、1.145、1.046、1.041、1.026、1.004。

2.3 三子散中潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物的定量分析

采用HPLC法對(duì)“2.2.3”項(xiàng)下所得潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物（柯里拉京、鞣花酸、訶子酸）進(jìn)行定量分析。

2.3.1 色譜條件

色譜條件同“2.1.1”項(xiàng)。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密移取“2.1.2”項(xiàng)下鞣花酸單一對(duì)照品貯備液2mL，置于10mL容量瓶中，以甲醇定容，制得質(zhì)量濃度為193.20μg/mL的對(duì)照品溶液；另取“2.1.2”項(xiàng)下訶子酸、柯里拉京單一對(duì)照品貯備液，作為對(duì)照品溶液；取上述各單一對(duì)照品溶液1mL，置于5mL容量瓶中，以甲醇定容，制得專屬性考察用混合對(duì)照品溶液。上述溶液均于4℃下保存，備用。

2.3.3 供試品溶液的制備

取三子散樣品各飲片，先按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，取所得溶液200μL，以甲醇定容至1mL，渦旋10s后精密移取250μL，再以甲醇定容至1mL，渦旋混勻，經(jīng)0.22μm濾膜濾過(guò)，即得定量分析用三子散供試品溶液。

2.3.4 專屬性考察

取空白溶液（甲醇）、“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果（圖8）顯示，在相應(yīng)保留時(shí)間處，其他成分對(duì)待測(cè)成分的檢測(cè)無(wú)干擾，方法的專屬性良好。

2.3.5 線性關(guān)系考察

分別精密移取“2.3.2”項(xiàng)下柯里拉京、訶子酸對(duì)照品溶液100、200、400、600、800、1000μL和鞣花酸對(duì)照品溶液50、200、400、600、800、1000μL，分別以甲醇定容至1mL，制得各單一對(duì)照品系列溶液；取上述各溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果（表3）顯示，各待測(cè)成分在其線性范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系（r＞0.999）。

2.3.6 精密度考察

取“2.3.5”項(xiàng)下柯里拉京、訶子酸、鞣花酸質(zhì)量濃度分別為62.60、95.60、38.64μg/mL的單一對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，柯里拉京、訶子酸、鞣花酸峰面積的RSD分別為2.17%、2.69%、1.97%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察

取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)S1），分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24h時(shí)按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，柯里拉京、訶子酸、鞣花酸峰面積的RSD分別為2.54%、2.77%、2.23%（n＝6），表明上述溶液在室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性考察

取三子散樣品（編號(hào)S1）各飲片，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并代入“2.3.5”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算各成分含量。結(jié)果顯示，柯里拉京、訶子酸、鞣花酸的平均含量分別為4.196、9.996、1.376mg/g，RSD分別為2.37%、2.96%、2.01%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率考察

取已知含量的三子散樣品（編號(hào)S1）約1.00g，加入與已知量相當(dāng)?shù)母鞔郎y(cè)成分對(duì)照品溶液1mL（分別精密稱取柯里拉京對(duì)照品40.31mg、訶子酸對(duì)照品97.45mg、鞣花酸對(duì)照品12.94mg，置于10mL容量瓶中，以甲醇定容，混勻，即得），按“2.3.3”項(xiàng)下方法處理，平行6份，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，柯里拉京、訶子酸、鞣花酸的平均加樣回收率分別為100.31%、99.50%、99.47%，RSD分別為2.39%、2.35%、2.79%（n＝6），表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.10 樣品含量測(cè)定

取15批三子散樣品（編號(hào)S1～S15）各飲片，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并代入“2.3.5”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算各成分含量。每樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果（表4）顯示，相較于其他批次，S1、S5、S7、S9、S14批三子散樣品中柯里拉京、鞣花酸含量較高，而訶子酸含量較低；S3、S13批三子散樣品中各成分含量均較低，這可能是“2.2.2”項(xiàng)下化學(xué)模式識(shí)別分析中S3、S13批樣品具有離散性的原因。

3 討論

3.1 樣品前處理與色譜條件優(yōu)化

本課題組以2020年版《中國(guó)藥典》（一部）中三子散樣品處理方法為基礎(chǔ)[2]，以色譜峰分離效果、色譜峰數(shù)量及響應(yīng)強(qiáng)度等參數(shù)為指標(biāo)，對(duì)供試品提取方法（加熱回流和超聲處理）、提取時(shí)間（20、30、40、50min）及提取溶劑（水、35%甲醇、55%甲醇、75%甲醇、甲醇、35%乙醇、55%乙醇、75%乙醇、乙醇）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，在以甲醇為提取溶劑、超聲處理40min條件下的提取效果最優(yōu)。由于傳統(tǒng)復(fù)方所含成分復(fù)雜多樣，各成分在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下的響應(yīng)強(qiáng)度有所不同，故為獲取較為全面的色譜信息，本課題組采用二極管陣列檢測(cè)技術(shù)對(duì)三子散供試品溶液進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，通過(guò)匯總各波長(zhǎng)條件下的色譜峰數(shù)量、響應(yīng)強(qiáng)度等色譜信息發(fā)現(xiàn)，254nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜信息較為豐富。本課題組進(jìn)一步對(duì)不同流動(dòng)相體系（甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，以甲醇-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜峰數(shù)量、響應(yīng)強(qiáng)度、峰形及分離度等均較優(yōu)。基于此，本課題組最終確定了“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件。

3.2 指紋圖譜、化學(xué)模式識(shí)別及含量測(cè)定聯(lián)合分析

相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，15批三子散樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.994～0.999，表明這15批樣品所含化學(xué)組成一致性較好；但需注意的是，15批樣品21個(gè)共有峰峰面積的RSD相差較大，提示各批樣品成分的含量存在一定差異。為闡明差異來(lái)源，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了化學(xué)模式識(shí)別分析，CA、PCA、OPLS-DA結(jié)果顯示，15批三子散樣品中的S1、S5、S7、S9、S14被聚為一類，S2～S4、S6、S8、S10～S13、S15被聚為一類。此外，筆者通過(guò)對(duì)15批三子散樣品隨機(jī)組合信息（表2）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，廣西產(chǎn)訶子可能是導(dǎo)致不同批次樣品被聚為兩類的主要因素，且訶子酸等3個(gè)潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物均來(lái)源于訶子飲片。結(jié)合15批三子散含量測(cè)定結(jié)果可知，S1、S5、S7、S9、S14批樣品中柯里拉京、鞣花酸含量較其余批次高；同時(shí)，已有研究表明，不同產(chǎn)地訶子藥材所含特征成分含量存在一定差異性[13―14]。因此，關(guān)注訶子藥材質(zhì)量對(duì)保證三子散制劑質(zhì)量的一致性、穩(wěn)定性尤為重要。

3.3 不足與展望

盡管本研究基于指紋圖譜與化學(xué)模式識(shí)別分析從三子散中篩選獲得了11個(gè)潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物，并對(duì)其中柯里拉京、鞣花酸、訶子酸3個(gè)成分進(jìn)行了定量分析，但尚有8個(gè)差異標(biāo)志物未被辨識(shí)、指認(rèn)，故本研究結(jié)果存在一定的局限性、片面性。針對(duì)上述不足，本課題組后續(xù)將完善相關(guān)定性鑒別、定量分析研究。

本研究建立了三子散的HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別分析篩選獲得了柯里拉京、鞣花酸、訶子酸等11個(gè)潛在質(zhì)量差異標(biāo)志物，并建立了柯里拉京、鞣花酸、訶子酸3個(gè)質(zhì)量差異標(biāo)志物的含量測(cè)定方法。所建指紋圖譜與含量測(cè)定方法可用于三子散的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制。