張威林，王海強，陳宇飛，劉志恒，張泳照，萬中元，孫 振，羅卓荊

腰痛為骨科的常見病、多發(fā)病，脊柱領(lǐng)域的權(quán)威雜志《Spine》在1996 將腰痛列為關(guān)系人類健康的世紀難題——80%的人一生中至少經(jīng)歷1 次腰痛［1］。據(jù)保守估計，美國每年用于腰痛的醫(yī)療支出約900億美元。腰痛因其巨額的醫(yī)療支出引發(fā)經(jīng)濟壓力而成為重要的科學(xué)問題、臨床問題，乃至社會問題。腰痛的主要原因為椎間盤退變，這是一系列脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)。椎間盤退變?yōu)轶w內(nèi)外多種因素綜合作用的結(jié)果，但是其確切的機制尚未明確。本文將對椎間盤退變的分子機制研究進展作一綜述。

1 正常椎間盤

1.1 正常椎間盤的結(jié)構(gòu)

椎間盤由位于中心的髓核、外周的纖維環(huán)以及上下的軟骨終板構(gòu)成，髓核呈膠凍樣，位于中心，纖維環(huán)主要由15～25 層定向排列的膠原纖維片層按同心圓的方式排列組成。同一層的膠原纖維互相平行，每層膠原纖維與椎體縱軸成60°角，且任意相鄰片層的膠原纖維排列方向都是相反的。軟骨終板位于椎間盤與椎體的銜接處，厚度通常＜1 mm，在維持椎體正常形態(tài)及椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。椎間盤的核心結(jié)構(gòu)為髓核，對于其整體結(jié)構(gòu)和力學(xué)傳導(dǎo)功能至關(guān)重要，因而，椎間盤退變的研究大多集中于對髓核的研究。髓核內(nèi)細胞數(shù)約為4 000 /mm3，纖維環(huán)內(nèi)約為9 000 /mm3，整個椎間盤的細胞數(shù)僅占總體積的1%［2］。纖維環(huán)與髓核的主要分成如下：髓核主要由髓核細胞及細胞外基質(zhì)構(gòu)成，髓核細胞主要由小而圓的類軟骨細胞及大而不規(guī)則的脊索細胞構(gòu)成。細胞外基質(zhì)主要包括水、Ⅱ型膠原、蛋白多糖，以及少量的細胞外基質(zhì)成分，包括纖粘連蛋白、纖調(diào)蛋白和基膜聚糖等［2］; 由髓核到纖維環(huán)，從內(nèi)向外逐漸由Ⅱ型膠原向Ⅰ型膠原轉(zhuǎn)變，其細胞也由類軟骨細胞向類成纖維細胞轉(zhuǎn)化。正因為髓核細胞數(shù)量少，而且需要維持大量的細胞外基質(zhì)，所以椎間盤容易發(fā)生退變。

1.2 椎間盤的營養(yǎng)供應(yīng)

椎間盤的退變與其營養(yǎng)供應(yīng)的缺乏是密不可分的。椎間盤是人體最大的無血管組織，成人椎間盤髓核幾乎無血管，僅在邊緣1～2 mm 有小毛細血管。研究發(fā)現(xiàn)椎間盤也需要消耗能量，主要是通過糖酵解來供能，椎間盤細胞消耗固定量的氧氣、產(chǎn)生少量的CO2，無氧條件下椎間盤細胞也可以存活至少14 d，表明椎間盤組織處于缺血缺氧的狀態(tài)［3］。椎間盤內(nèi)pH 值一般為6.9～7.2，在退變的情況下，可以達到6.1［3］。Grunhagen 等［4］發(fā)現(xiàn)椎間盤的血液供應(yīng)主要來自終板的擴散，極少量來自周圍的小血管。所以大部分脊柱側(cè)凸的患者由于終板的鈣化引起的椎間盤血供受阻，進而導(dǎo)致退化，更加有力的證明了這一觀點［5］。

1.3 脊索細胞

成人髓核中以小而圓的類軟骨細胞為主(一般所講的髓核細胞即指這類細胞)，而在幼兒及某些其他物種中以大而不規(guī)則的脊索細胞為主［6］。脊索細胞在胎兒出生之后有維護和保持胎兒脊柱功能的作用［7］。脊索細胞在10 歲左右消失，并由軟骨樣細胞所取代［8］，這與椎間盤剛開始發(fā)生退變的時間比較接近。但是，目前有大量的證據(jù)可以表明脊索細胞的功能在成人狀態(tài)依然保存［9］。目前基本可以確定脊索細胞能減少炎癥介質(zhì)在纖維環(huán)中的表達［10］，抑制髓核細胞的凋亡［11］，促使細胞外基質(zhì)增加，起到維持椎間盤正常形態(tài)的作用。髓核細胞由于表達FasL 而具有一定的免疫功能［12］，這項發(fā)現(xiàn)對于椎間盤的退變和功能的恢復(fù)研究具有一定的意義。

2 椎間盤退變的病理變化

2.1 細胞簇的形成

在椎間盤退變過程中髓核細胞的病理改變是目前研究的重點，髓核細胞在退變中的主要特征為標志性的細胞簇形成［13］，其形成的確切機制及轉(zhuǎn)歸不明。但目前有很多關(guān)于細胞簇形成的假說。有學(xué)者通過瘦素在體外刺激大鼠的髓核細胞使髓核細胞大量增殖并形成細胞簇，而且還使用瘦素導(dǎo)致纖維軟骨的增生［14］，進而得出瘦素是產(chǎn)生細胞簇的主要原因;還有學(xué)者認為細胞簇的形成與一些病理學(xué)相關(guān)的細胞應(yīng)激蛋白表達有關(guān)，例如應(yīng)激蛋白HSF-1，Hsp27 和Hsp72［15］。他們認為細胞簇的形成是髓核細胞對于外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)表現(xiàn)。Jones 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，髓核是具有吞噬功能的細胞，而且Wang等［17］捕捉到了正在吞噬微粒的髓核細胞的圖像，證明髓核細胞具有吞噬作用，所以細胞簇的形成也可能是髓核細胞聚集成簇吞噬壞死凋亡細胞而形成。有研究發(fā)現(xiàn)細胞簇主要由衰老、增殖及凋亡的細胞組成［18］。細胞簇的形成是椎間盤退變的標志，所以有關(guān)于細胞簇的形成機制值得深入地研究和驗證。

對于髓核細胞進行單層培養(yǎng)是研究其生物功能的主要手段之一，而對于單層培養(yǎng)條件下髓核細胞細胞簇的轉(zhuǎn)歸問題，文獻［17］顯示，單層培養(yǎng)的人椎間盤退變的髓核細胞，其細胞簇在培養(yǎng)48 h 后逐漸趨于消失，對探討細胞簇的成因提供了積極的思路。

2.2 細胞外基質(zhì)的變化

2.2.1 膠原蛋白的變化

膠原蛋白是構(gòu)成椎間盤的主要成分，所以在椎間盤退化過程中膠原蛋白的變化不可忽視。構(gòu)成椎間盤的膠原蛋白主要是Ⅰ型和Ⅱ型膠原，如前所述，正常椎間盤中從內(nèi)向外逐漸由Ⅱ型膠原向Ⅰ型膠原轉(zhuǎn)變，但是在退變的椎間盤中原本在髓核占主要的Ⅱ型膠原變性，而原本在外層纖維環(huán)占主導(dǎo)的Ⅰ型膠原在髓核的表達增加［19］。由于椎間盤中膠原的這種變化會導(dǎo)致椎間盤變硬，傳導(dǎo)力的作用降低，使纖維環(huán)容易破裂，導(dǎo)致髓核突出壓迫神經(jīng)，出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。

2.2.2 蛋白多糖的改變

蛋白多糖是一種由多肽為主鏈、以氨基多糖為側(cè)鏈組成的大分子。蛋白多糖的改變要比膠原的變化明顯，其改變也是椎間盤退化的早期表現(xiàn)之一。在椎間盤退變的過程中，呈聚集狀的蛋白多糖含量明顯下降，而非聚集的蛋白多糖含量增加，聚集狀蛋白多糖的丟失直接導(dǎo)致髓核細胞外基質(zhì)滲透壓下降，從而導(dǎo)致髓核含水量下降，這是引起椎間盤退變并導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能改變的主要原因［20］。

2.2.3 纖粘連蛋白

纖粘連蛋白可影響細胞的伸展、移動、吞噬、分化及增殖和血液凝固。Anderson 等［21］運用PCR、蛋白印跡和光密度法對正常人和椎間盤退變患者之間纖粘連蛋白的表達進行比較，得出退變椎間盤中纖維連接蛋白基因明顯高表達。隨著椎間盤退變，纖粘連蛋白含量增加并主要以片段形式存在，可刺激椎間盤細胞產(chǎn)生金屬蛋白酶(matrix metal proteinase，MMPs) 和細胞因子，下調(diào)蛋白聚糖的含量，增加細胞基質(zhì)的降解［22］。

2.2.4 MMPs

MMPs 是參與降解全身各種組織的細胞外基質(zhì)的蛋白酶家族，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)24 種MMPs，在人類中存在23 種［23］。在胎兒的形成過程中這種酶也起到了十分重要的作用［24］。目前有很多關(guān)于MMPs與椎間盤退變之間關(guān)系的研究，這些研究主要集中在MMP-1、2、3、7、9、13。有學(xué)者在髓核細胞和纖維內(nèi)環(huán)上的觀察到MMPs 的表達，而在外環(huán)和正常的組織上不表達，在退變的椎間盤髓核細胞中MMPs的表達要高于正常的椎間盤組織［25］。MMPs 組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs) 通過與MMPs 形成穩(wěn)定復(fù)合體及直接抑制MMPs 活化這2 種方式抑制MMPs 以維持其表達穩(wěn)定［26-27］。一旦失去平衡MMPs 可以使椎間盤喪失原有功能，導(dǎo)致腰疼痛［28］。文獻［29］顯示，壓力負荷可以導(dǎo)致解整鏈蛋白MMPs 增加，并促進TIMPs-3介導(dǎo)的椎間盤退變的產(chǎn)生。

3 椎間盤退變的分子機制

3.1 FasL-Fas 凋亡途徑與椎間盤退變

Fas 是腫瘤壞死因子受體家族成員，F(xiàn)asL 是Fas在體內(nèi)的天然配體。FasL-Fas 為經(jīng)典的凋亡傳統(tǒng)通路，F(xiàn)asL 在細胞外與細胞膜表面的Fas 結(jié)合后，F(xiàn)as交聯(lián)成三聚體或多聚體。Fas 分子N-端死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域?qū)⑺劳鲂盘栂蛳聜鬟f，活化半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶，降解DNA，導(dǎo)致細胞凋亡［30］。目前有很多關(guān)于FasL-Fas 凋亡途徑與椎間盤退變的研究。研究表明椎間盤的退變與椎間盤自身的免疫赦免狀態(tài)的改變有關(guān)，組織器官的免疫赦免不僅僅是靠被動的血液生理屏障來維持的，還有FasL 所介導(dǎo)的主動免疫的參與［31］。椎間盤髓核表達FasL，從而可誘導(dǎo)入侵的細胞毒性T 淋巴細胞產(chǎn)生凋亡，而且FasL的表達可以維持T 淋巴細胞和B 淋巴細胞的平衡［32］。在椎間盤形成的早期也有FasL 的表達［33］，從而證明了其對椎間盤免疫穩(wěn)定性的重要性。所以FasL 的表達對于椎間盤的退變也具有極其重要的意義。研究椎間盤退變狀態(tài)下FasL 表達的改變，以及髓核細胞和免疫細胞通過FasL-Fas 相互作用機制，對于深入理解椎間盤退變的分子機制有著重要的意義。

3.2 microRNA(miRNA)

3.2.1 miRNA 概述

Lee 等［34］在1993 年第1 次發(fā)現(xiàn)了miRNA 為非編碼小RNA，長度19～25 nt，廣泛存在于真核生物中。它通過與mRNA 的3’非翻譯區(qū)靶向結(jié)合，沉默靶基因或抑制靶基因的表達。在不同物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性。miRNA 與細胞凋亡、細胞癌變、細胞分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、病毒感染、細胞增殖等息息相關(guān)，近年來關(guān)于miRNA 的研究比較熱門，2002 年miRbase 收錄的miRNA 只有218 條，在2010 年時已經(jīng)達到15 172 條，目前最新的miRbase18.0 更是增加到了21 643 條。這么眾多的miRNA 通過基因調(diào)控廣泛參與人體的各項生命活動，其在椎間盤退變中發(fā)揮什么樣的作用值得深入探討。研究顯示椎間盤退變髓核中miRNA 表達譜與相對正常的相比，有29 個miRNA 差異表達，其中上調(diào)的6 個，下調(diào)的23 個。

3.2.2 miRNA 與椎間盤退變

細胞凋亡主要通過內(nèi)外2 條通路來激活，內(nèi)源性通路主要是由線粒體中細胞色素C 等介導(dǎo)，而外源性通路是由死亡受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合介導(dǎo)的，其中FasL-Fas 就是這樣的外源性通路［35］。研究表明，椎間盤退變中2 種凋亡通路都存在，且與FasL-Fas 介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)。Fas 相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD) 及caspase-3 為FasL-Fas 凋亡途徑中的關(guān)鍵蛋白，對椎間盤退變時凋亡增多的確切分子機制進行的研究發(fā)現(xiàn)miR-155 在退變椎間盤髓核中下調(diào)明顯［36］，生物信息學(xué)分析和報告基因也證實了FADD及CASP3 為miR-155 的靶基因。在體外，上調(diào)miR-155 的表達引起FADD 和caspase-3 表達降低，而下調(diào)miR-155 的表達則引起FADD 和caspase-3 的增加，進而引起Fas 介導(dǎo)的凋亡增加。從而提出差異表達的miR-155 為椎間盤退變時凋亡增加及椎間盤退變的病因之一。這一發(fā)現(xiàn)對于椎間盤退變的分子機制研究具有重要意義。

3.3 炎性介質(zhì)

大量的研究表明退變的腰椎椎間盤組織中能產(chǎn)生炎性介質(zhì)，炎性成分已被認為是導(dǎo)致椎間盤退變的主要因素之一。白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1) 、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF) 等都已經(jīng)被證實在椎間盤退變過程中顯著增高。IL-1使椎間盤纖維環(huán)細胞產(chǎn)生的前列腺素E 和磷脂酶A增加，且分泌呈劑量依賴性，同時能誘導(dǎo)酪蛋白酶mRNA產(chǎn)生，減少纖維環(huán)中總的蛋白多糖含量，促進椎間盤退變［37］。TNF 使蛋白聚糖和Ⅱ型膠原基因表達明顯下降，誘導(dǎo)椎間盤退變的發(fā)生［38］。某些炎性介質(zhì)在椎間盤的退變過程中也是減少的，例如轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β) ，Pattison 等［39］發(fā)現(xiàn)TGF-β1 能夠促進髓核細胞分泌蛋白多糖，并可顯著降低MMP-2 的活性，TGF-β1 的減少可以引起椎間盤的退變。

4 展 望

綜上所述，椎間盤的退變機制錯綜復(fù)雜，對于其退變的機制應(yīng)該兼顧微觀與宏觀，而且對于椎間盤退變機制的研究任重而道遠，依然存在很多急需解決的問題。對椎間盤退變分子機制的研究，不僅為椎間盤退變的病因提供依據(jù)，更為重要的是能夠為椎間盤退變的分子治療提供潛在的新的靶點。例如miR-155 下調(diào)為凋亡增加的因素，那么通過病毒介導(dǎo)的pre-miR-155，有可能抑制凋亡而延緩椎間盤的退變，起到治療作用。椎間盤退變的分子機制尚存很多問題有待進一步研究，希望本綜述能給同道帶來一些啟發(fā)，為解決這一困擾人類許久的醫(yī)學(xué)難題指引新的方向。

［1］Waddell G.Low back pain：a twentieth century health care enigma［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，1996，21 (24) ：2820-2825.

［2］Raj PP.Intervertebral disc：anatomy-physiology-pathophysiologytreatment［J］.Pain Pract，2008，8(1)：18-44.

［3］Urban JP，Smith S，F(xiàn)airbank JC.Nutrition of the intervertebral disc［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2004，29(23) ：2700-2709.

［4］Grunhagen T，Wilde G，Soukane DM，et al.Nutrient supply and intervertebral disc metabolism［J］.J Bone Joint Surg Am，2006，88(Suppl 2)：30-35.

［5］Urban MR，F(xiàn)airbank JC，Etherington PJ，et al.Electrochemical measurement of transport into scoliotic intervertebral discs in vivo using nitrous oxide as a tracer［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2001，26(8) ：984-990.

［6］Roberts S，Evans H，Trivedi J，et al.Histology and pathology of the human intervertebral disc［J］.J Bone Joint Surg Am，2006，88 (Suppl 2) ：10-14.

［7］McCann MR，Tamplin OJ，Rossant J，et al.Tracing notochordderived cells using a Noto-cre mouse：implications for intervertebral disc development［J］.Dis Model Mech，2012，5(1) ：73-82.

［8］于鵬，邵增務(wù).脊索細胞研究進展［J］.國際骨科學(xué)雜志，2009，30(4) ：224-225.

［9］Risbud MV，Shapiro IM.Notochordal cells in the adult intervertebral disc：new perspective on an old question［J］.Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2011，21(1) ：29-41.

［10］Moon HJ，Joe H，Kwon TH，et al.Notochordal cells influence gene expression of inflammatory mediators of annulus fibrosus cells in proinflammatory cytokines stimulation［J］.J Korean Neurosurg Soc，2010，48(1) ：1-7.

［11］Erwin WM，Islam D，Inman RD，et al.Notochordal cells protect nucleus pulposus cells from degradation and apoptosis：implications for the mechanisms of intervertebral disc degeneration［J］.Arthritis Res Ther，2011，13(6) ：R215.

［12］Geiss A，Larsson K，Rydevik B，et al.Autoimmune properties of nucleus pulposus：an experimental study in pigs［J］.Spine(Phila Pa 1976) ，2007，32(2) ：168-173.

［13］Johnson WE，Eisenstein SM，Roberts S.Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation［J］.Connect Tissue Res，2001，42(3) ：197-207.

［14］Zhao CQ，Liu D，Li H，et al.Expression of leptin and its functional receptor on disc cells：contribution to cell proliferation［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2008，33(23) ：E858-864.

［15］Sharp CA，Roberts S，Evans H，et al.Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining［J］.Eur Spine J，2009，18(11) ：1587-1594.

［16］Jones P，Gardner L，Menage J，et al.Intervertebral disc cells as competent phagocytes in vitro：implications for cell death in disc degeneration［J］.Arthritis Res Ther，2008，10(4) ：R86.

［17］Wang HQ，Yu XD，Liu ZH，et al.Human nucleus pulposus cell cultures and disc degeneration grading systems：comment on the article by Le Maitre et al［J］.Arthritis Rheum，2010，62(1) ：301-302.

［18］Stephan S，Johnson WE，Roberts S.The influence of nutrient supply and cell density on the growth and survival of intervertebral disc cells in 3D culture［J］.Eur Cell Mater，2011，22：97-108.

［19］Schollmeier G，Lahr-Eigen R，Lewandrowski KU.Observations on fiber-forming collagens in the anulus fibrosus［J］.Spine(Phila Pa 1976) ，2000，25(21) ：2736-2741.

［20］胡明，張傳森.退變椎間盤細胞外基質(zhì)的改變［J］.局解手術(shù)學(xué)雜志，2004，13(1) ：55-57.

［21］Anderson DG，Izzo MW，Hall DJ，et al.Comparative gene expression profiling of normal and degenerative discs：analysis of a rabbit annular laceration model［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2002，27(12) ：1291-1296.

［22］Oegema TR Jr，Johnson SL，Aguiar DJ，et al.Fibronectin and its fragments increase with degeneration in the human intervertebral disc［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2000，25(21) ：2742-2747.

［23］沈昌煥，歐云生.基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs) 與椎間盤退變［J］.頸腰痛雜志，2009，30(6) ：543-546.

［24］Rutges JP，Nikkels PG，Oner FC，et al.The presence of extracellular matrix degrading metalloproteinases during fetal development of the intervertebral disc［J］.Eur Spine J，2010，19(8) ：1340-1346.

［25］Le Maitre CL，F(xiàn)reemont AJ，Hoyland JA.Human disc degeneration is associated with increased MMP 7 expression［J］.Biotech Histochem，2006，81(4-6) ：125-131.

［26］Singh RJ，Mason JC，Lidington EA，et al.Cytokine stimulated vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) ectodomain release is regulated by TIMP-3［J］.Cardiovasc Res，2005，67(1) ：39-49.

［27］Gardner J，Ghorpade A.Tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)-1：the TIMPed balance of matrix metalloproteinases in the central nervous system［J］.J Neurosci Res，2003，74(6) ：801-806.

［28］Weiler C，Nerlich AG，Zipperer J，et al.2002 SSE Award Competition in Basic Science：expression of major matrix metalloproteinases is associated with intervertebral disc degradation and resorption［J］.Eur Spine J，2002，11(4) ：308-320.

［29］Huang M，Wang HQ，Zhang Q，et al.Alterations of ADAMTSs and TIMP-3 in human nucleus pulposus cells subjected to compressive load：Implications in the pathogenesis of human intervertebral disc degeneration［J］.J Orthop Res，2012，30(2) ：267-273.

［30］Lee HO，F(xiàn)erguson TA.Biology of FasL［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2003，14(3-4) ：325-335.

［31］崔冠宇，趙丹慧，田偉.Fas 及其配體與椎間盤退變關(guān)系的研究進展［J］.中國脊柱脊髓雜志，2007，17(3) ：229-232.

［32］Hao Z，Duncan GS，Seagal J，et al.Fas receptor expression in germinal-center B cells is essential for T and B lymphocyte homeostasis［J］.Immunity，2008，29(4) ：615-627.

［33］Inui Y，Nishida K，Doita M，et al.Fas-ligand expression on nucleus pulposus begins in developing embryo［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2004，29(21) ：2365-2369.

［34］Lee RC，F(xiàn)einbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75(5)：843-854.

［35］Park SM，Peter ME.microRNAs and death receptors［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2008，19(3-4) ：303-311.

［36］Wang HQ，Yu XD，Liu ZH，et al.Deregulated miR-155 promotes Fas-mediated apoptosis in human intervertebral disc degeneration by targeting FADD and caspase-3［J］.J Pathol，2011，225(2) ：232-242.

［37］Rannou F，Corvol MT，Hudry C，et al.Sensitivity of anulus fibrosus cells to interleukin 1 beta.Comparison with articular chondrocytes［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2000，25 (1) ：17-23.

［38］Séguin CA，Pilliar RM，Roughley PJ，et al.Tumor necrosis factor-alpha modulates matrix production and catabolism in nucleus pulposus tissue［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2005，30(17) ：1940-1948.

［39］Pattison ST，Melrose J，Ghosh P，et al.Regulation of gelatinase-A (MMP-2) production by ovine intervertebral disc nucleus pulposus cells grown in alginate bead culture by Transforming Growth Factor-beta(1) and insulin like growth factor-I［J］.Cell Biol Int，2001，25(7) ：679-689.