張蓉　鄧煒焯　郭增良　高瞻

[摘要] 目的：探索骨髓間充質(zhì)干細胞膜片的體外構(gòu)建簡便方法，并評估其成骨分化潛能。方法：將兔骨髓間充質(zhì)干細胞高密度接種，在成骨誘導(dǎo)條件下連續(xù)培養(yǎng)形成細胞膜片。通過組織學(xué)、堿性磷酸酶活性定量檢測、透射電鏡和掃描電鏡等方法，檢測細胞膜片的特性。結(jié)果：高密度連續(xù)培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)后形成骨髓間充質(zhì)干細胞膜片。HE染色證實膜片是一種由多層細胞和細胞外基質(zhì)組成的聚集體；茜素紅染色呈陽性；堿性磷酸酶定量分析含量較高；掃描電鏡及透射電鏡檢查均見基質(zhì)中大量的礦化結(jié)節(jié)聚集。結(jié)論：通過體外簡單的連續(xù)培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)后，可形成具有良好成骨能力的骨髓間充質(zhì)干細胞膜片。

[關(guān)鍵詞]間充質(zhì)干細胞；細胞膜片；成骨分化

[中圖分類號]Q813.1[文獻標(biāo)識碼]A[文章編號]1008-6455（2012）10-0-0

組織工程技術(shù)的出現(xiàn)和興起標(biāo)志著再造時代的來臨，傳統(tǒng)的基于細胞的骨組織工程，是利用大量的種子細胞種植在支架材料上，通過活性因子等誘導(dǎo)細胞分化成骨[1]。但研究發(fā)現(xiàn)該方法存在一些缺點，如細胞利用率低、附著效率差； 細胞在支架材料上分布不均；常用的蛋白酶消化收集細胞的方法，會改變細胞的表型和生化成分。并且，培養(yǎng)過程中細胞分泌的細胞外基質(zhì)及形成的細胞間連接蛋白也常被破壞[2]。目前這些問題一直未能圓滿解決，已成為限制骨組織工程技術(shù)應(yīng)用于臨床的瓶頸。

1993年日本學(xué)者Okano等[3]首先報道將聚N-異丙基丙烯酰胺應(yīng)用到細胞培養(yǎng)上，創(chuàng)新性地發(fā)明了細胞膜片技術(shù)。應(yīng)用特殊的外源性溫敏聚合物材料提取完整的細胞聚集體，用于組織工程構(gòu)建。該技術(shù)借助細胞間的連接以片狀形式脫附，保留了基質(zhì)中細胞與細胞間連接、細胞表面蛋白等，細胞生物學(xué)行為和功能得以維持[4]。在本實驗中，筆者探討體外構(gòu)建骨髓間充質(zhì)細胞膜片的培養(yǎng)方法并予以改進，試圖進一步縮短膜片培養(yǎng)時間，同時增加膜片厚度，以利于構(gòu)建組織工程骨。

1材料

1.1 實驗動物：3月齡成年新西蘭大白兔，體重2.5～3.0kg，由烏魯木齊總醫(yī)院實驗動物中心提供。

1.2 實驗儀器設(shè)備：倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympas，日本）；酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-RAD680， 美國）；JEM-2000EX透射電鏡 （JEOM Ltd，日本）；S-3400N 掃描電鏡 （Hitachi，日本）；X-射線能譜分析儀（Oxford，Link ISIS，英國）。

2方法

2.1 兔骨髓間充質(zhì)干細胞膜片體外構(gòu)建：按以往所報道的實驗方法分離培養(yǎng)MSCs[5]。將第2代MSCs，按密度1×106/cm2接種到直徑10cm的培養(yǎng)皿，使用含成骨誘導(dǎo)劑的DMEM/F12培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、地塞米松10nM、β-甘油磷酸鈉10mM、抗壞血酸 50mg/L）， 置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，隔日換培養(yǎng)液1次。連續(xù)培養(yǎng)直至皿底形成半透明乳白色薄膜樣物。

2.2 組織學(xué)檢查：4%多聚甲醛固定膜片，分別行HE和茜素紅組織學(xué)染色。光鏡下觀察膜片顯微結(jié)構(gòu)。

2.3 超微結(jié)構(gòu)觀察：同時選取部分膜片，以3% 戊二醛固定，分別行透射電鏡觀察及掃描電鏡觀察標(biāo)本表面的微細形貌。并選擇礦化結(jié)節(jié)中心點檢測，通過X-射線能譜分析儀了解礦化結(jié)節(jié)表面的元素組成。

2.4 堿性磷酸酶活性定量測定：細胞膜片加入裂解液（0.2% TritonX-100），充分裂解后離心，取上清與磷酸硝基苯基磷酸鹽37℃反應(yīng)30 min，酶聯(lián)檢測儀（405 nm波長）測光吸收值，行ALP活性定量檢測。

3結(jié)果

3.1 膜片大體觀察：MSCs高密度接種后體外培養(yǎng)5天左右，形成薄膜樣物質(zhì)，并逐漸增厚，12～14天，所獲膜片具備一定的彈性和較好的機械性能，呈現(xiàn)半透明乳白色（如圖1）。小心用細胞刮刀沿培養(yǎng)皿底刮擦，將膜狀物與皿底分離，可用眼科鑷將其完整夾持起來，進行卷曲或折疊等操作。

3.2顯微結(jié)構(gòu)觀察：MSCs增殖旺盛，3天后呈復(fù)層生長，逐漸由梭形變?yōu)榘w較小的立方形，并出現(xiàn)多角形成骨樣細胞，胞質(zhì)顏色變深。繼續(xù)誘導(dǎo)后，胞外基質(zhì)分泌逐漸增多，鈣鹽不斷沉積，14天左右形成不透光礦化結(jié)節(jié)，見圖2。

3.3 組織學(xué)觀察：HE染色顯示，膜片是由12～15層細胞及細胞外基質(zhì)組成的聚集體（圖3A）。茜素紅染色見細胞外基質(zhì)中沉積有多個大小不等的鈣化結(jié)節(jié)（圖3B），表明膜片具有成骨能力。

3.4 超微結(jié)構(gòu)觀察：TEM觀察膜片兩面均有細胞，排列成多層結(jié)構(gòu)。高倍鏡下可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及膠原纖維豐富（圖4），說明合成和分泌蛋白質(zhì)功能旺盛。細胞外基質(zhì)內(nèi)大量針狀鈣鹽結(jié)晶沉積，部分為局灶性的。SEM見成骨誘導(dǎo)分化的膜片中細胞被自己所分泌的細胞外基質(zhì)包埋，基質(zhì)中見大量礦化結(jié)節(jié)聚集（圖5）。礦化結(jié)節(jié)X射線能譜分析結(jié)果顯示有鈣、磷、碳、氧、鈉、鎂六種元素構(gòu)成，鈣、磷兩種元素的重量構(gòu)成分別為（10.09 ± 0.01）% 和（4.53 ± 0.01）%，比值為2.23（圖6A）。

3.5 堿性磷酸酶活性定量檢測：結(jié)果表明，膜片成骨誘導(dǎo)分化后ALP活性隨著時間延長而穩(wěn)步增加，至第14天ALP值達到峰值， 見圖6B。

4討論

目前利用細胞膜片技術(shù)，已成功構(gòu)建出角膜、皮膚、肝臟、心肌、血管等多種軟組織[6]。細胞膜片技術(shù)的優(yōu)點在于：①種子細胞利用效率高，體外擴增的細胞幾乎可全部被用于組織構(gòu)建；②細胞與細胞外基質(zhì)復(fù)合體可直接用于組織構(gòu)建，通過疊層實現(xiàn)三維構(gòu)建，可避免使用外源性支架材料伴隨的一些反應(yīng)，更具有良好的生物相容性；③保留了細胞-細胞間、細胞-基質(zhì)間連接和細胞表面蛋白等。

近期國內(nèi)也有將骨髓間充質(zhì)干細胞細胞膜片應(yīng)用于骨組織工程的研究報道[7-8]，但該技術(shù)需要特殊的溫度敏感性培養(yǎng)皿和提取設(shè)備，通過溫度變化，20min左右細胞與細胞外基質(zhì)一起脫落形成完整的細胞片層。馬東洋[9]等實驗所構(gòu)建的骨髓間充質(zhì)干細胞膜片，采用DMEM培養(yǎng)基，膜片厚度僅100 μm 左右。Sonja[10]研究發(fā)現(xiàn)，選擇恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基對于細胞生長和增殖非常重要，并證實了選用DMEM/F12培養(yǎng)基，MSCs增殖率最高。本實驗，改進了以往細胞膜片的體外構(gòu)建方法，選擇DMEM/F12培養(yǎng)基促進MSCs增殖，同時利用抗壞血酸促進MSCs擴增和分泌大量胞外基質(zhì)，縮短了以往的培養(yǎng)時間， 4～5天即可形成薄層膜片，經(jīng)過12～14天左右的連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，HE染色顯示膜片的多層結(jié)構(gòu)厚度增加到200μm以上，膜片相應(yīng)的彈性和機械性能也隨之增加，更便于操作。用兩把鑷子就可將細胞膜片完整提起來，僅僅需要幾秒鐘，不必借助特殊的材料或設(shè)備，簡捷的可操作性，更利于膜片的進一步塑形和三維構(gòu)建。

實驗證實，經(jīng)上述條件培養(yǎng)液孵育的細胞膜片具有成骨分化的潛能。經(jīng)定量分析膜片中的細胞具有較高的ALP活性。此外，茜素紅染色表明膜片基質(zhì)中有大量大小不等的鈣化結(jié)節(jié)形成，證實了MSCs向成骨細胞分化后期的表型特征。同時掃描電鏡、透射電鏡下都觀察到礦化的細胞外基質(zhì)。尤其是，對膜片中的礦化結(jié)節(jié)進行X射線能譜分析結(jié)果顯示有鈣、磷、碳、氧、鈉、鎂六種元素構(gòu)成，鈣、磷兩種元素的重量構(gòu)成分別為（10.09±0.01）% 和（4.53±0.01）%，比值為2.23，接近于天然骨。細胞膜片工程研究將為骨組織再生重建開辟廣闊的前景。

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[收稿日期]2012-06-11 [修回日期]2012-08-17

編輯/張惠娟