宋豎旗，張亞強(qiáng)，薄 海

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053)

前列腺癌是老年男性常見(jiàn)的惡性腫瘤，在歐美其發(fā)病率高達(dá)4.4%～14.2%，已成為第一位危害男性健康的腫瘤[1]。在我國(guó)，該病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。

前列消癥湯是中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院劉猷枋教授臨床用于治療激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer，AIPC)的經(jīng)驗(yàn)有效方。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[2，3]，該方能明顯提高晚期前列腺癌患者生活質(zhì)量，抑制PSA的過(guò)快增長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者生存期，但其具體分子機(jī)制不明。本研究圍繞PI3K/Akt信號(hào)通路，采用血清藥理學(xué)方法探討含藥血清對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路中的重要分子PTEN、Akt、mTOR、NF-κB表達(dá)的影響，揭示中藥復(fù)方治療前列腺癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株 人激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞株(簡(jiǎn)稱PC-3細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫(kù)，在我院中心實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期凍存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 F12/DMEM 1：培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶，吉諾生物制品公司； RNA柱式抽提試劑盒，上海生工生物工程公司；RT-PCR試劑盒，上海東洋紡生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)Shell Lab公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；F039300A型Sunrise酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司；高壓蒸汽滅菌器，日本HIRAYAMA 公司；臺(tái)式干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RT-PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；凝膠成像系統(tǒng)，德國(guó)Leica公司；JY99-IIIB型超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；5415R型高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Lambdal P40紫外可見(jiàn)光分光光度儀，美國(guó)pe公司；Mini-ROTEAN3電泳系統(tǒng)與Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 前列消癥湯水煎劑制備 前列消癥湯組方：黃芪15 g，生薏苡仁30 g，莪術(shù)9 g，土貝母9 g，豬苓15 g，白花蛇舌草20 g，黃精10 g。成年雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量250～300 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組5只。人和大鼠間按體表面積折算的等效劑量比率為人(70. 0 kg)∶大鼠(200 g)=1∶0. 018換算大鼠的等效劑量，分為低劑量組(大鼠與人等效劑量)、中劑量組(10倍于低劑量組)、高劑量組(20倍于低劑量2組)，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組每只大鼠每天劑量，再計(jì)算5只大鼠7 d的劑量。將各組5只大鼠7 d劑量的中藥復(fù)方制備成水煎劑220 ml， 用于每組5只，每只大鼠每次3 ml，每天2 次灌胃共7 d。水煎劑制備過(guò)程：將上述劑量的3組藥方的中藥分別置煎煮容器內(nèi)，加入相當(dāng)藥材5倍量的冷水浸泡1 h，煮沸30 min過(guò)濾。藥渣再加3倍量的水，繼續(xù)煎煮20 min過(guò)濾。合并2次濾液，于水浴上濃縮成220 ml。水煎劑于開(kāi)始灌胃的前1 d制備完成，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 含藥血清制備 將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組5只。分別用3組中藥的水煎劑、生理鹽水灌胃，每次3 ml，每天2 次共7 d，末次給藥2次，間隔1 h。最后1次灌胃后于60～90 min 時(shí)間段內(nèi)，10%水合氯醛注射液按3.5 ml/kg 劑量腹腔注射，大鼠麻醉后下腔靜脈取血，置于無(wú)抗凝管內(nèi)。室溫下靜置30 min，待凝血堅(jiān)固、血清析出。3000 r/min，離心20 min后，吸出上清即為含藥血清或空白血清。同組血清混合，用0.22 μm 的微孔膜過(guò)濾除菌、分裝，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3培養(yǎng)于含10%胎牛血清F12/DMEM1∶1培養(yǎng)基中，置于溫度為37 ℃氣體環(huán)境為5% CO2、濕度為飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，5～6 d消化(0.25%胰蛋白酶液)、傳代。

1.3.4 細(xì)胞凍存 ①生長(zhǎng)于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶約90%以上時(shí)，加入消化液制成單細(xì)胞懸液；②細(xì)胞懸液離心后去除上清，加入預(yù)先配制好的凍存液重懸細(xì)胞；③將懸浮于凍存液的細(xì)胞按照每管約1.5 ml分裝于凍存管中，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)可1瓶?jī)?管；④先將凍存管置于4 ℃約40 min，接著置于-20 ℃約30～60 min、置于-80 ℃超低溫冰箱中放置過(guò)夜，最后置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。

1.3.5 細(xì)胞復(fù)蘇 ①將水浴鍋預(yù)熱至37 ℃；②從液氮罐中取出細(xì)胞，迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地?fù)u動(dòng)，使管中的液體迅速融化；③酒精消毒凍存管的外壁，吸出細(xì)胞懸液注入離心管并加入10倍的培養(yǎng)液，混勻后離心去上清；④加入培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞懸液后，接種于培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，第2天換液1次。

1.3.6 Western blot 免疫印跡測(cè)定蛋白表達(dá) 采用Western blot 免疫印跡法，以mTOR、p-AKT等蛋白表達(dá)為參照，與β-actin蛋白表達(dá)量的比值作為組織內(nèi)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。具體步驟如下：①灌膠與上樣：配制15%分離膠加水封膠。分離膠凝固后配制4%的濃縮膠插入樣品梳，待到濃縮膠凝固后取出樣品梳。加入50 μg蛋白的上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×。上樣前將樣品于沸水中煮5 min，使蛋白變性冷卻至室溫，加足量的電泳液后上樣；②電泳：先用80 V電壓電泳30 min，待樣品走出加樣孔后，將電壓調(diào)至100 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，停止電泳并拆開(kāi)膠板；③轉(zhuǎn)膜操作：按膠大小切6張Whatman 3 mm 濾紙及1張PVDF膜，在預(yù)冷的1×轉(zhuǎn)膜Buffer中，浸泡凝膠30 min，浸泡PVDF膜、濾紙、海綿20 min，以1×轉(zhuǎn)膜Buffer注滿電轉(zhuǎn)膜槽，接通電泳儀，以60 V電壓轉(zhuǎn)移2 h。轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min，水沖洗后可見(jiàn)膜上的蛋白條帶；④免疫反應(yīng)：將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h。將c-fos等蛋白抗體以1×TBST稀釋至適當(dāng)濃度(1∶1000稀釋)，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。然后用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min。同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸(約1∶1000)，室溫下孵育1 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗2次，每次10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；⑤化學(xué)發(fā)光、顯影、定影：將膜發(fā)光底物工作液A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸1 min，將膜移至X光片夾中曝光X片。曝光結(jié)束后放入顯影液中顯影并定影，自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干；⑥凝膠圖像分析：將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.3.7 RT-PCR法測(cè)定基因表達(dá) ①細(xì)胞制備：用含10%胎牛血清的F12/DMEM1∶1培養(yǎng)液培養(yǎng)的PC-3細(xì)胞， 長(zhǎng)至瓶底的80%～90%時(shí)棄去培養(yǎng)液，0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，1500 rpm離心5 min，棄上清液收集細(xì)胞。用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至2×105ml，接種至六孔板中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)胞貼壁，生長(zhǎng)率達(dá)80%～90%，將培養(yǎng)液分別更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)液、大鼠空白血清及低、中、高劑量大鼠含藥血清培養(yǎng)液3 ml，培養(yǎng)24 h；②按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)A260、A280，定量并檢測(cè)其純度，提取總RNA進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。提取的總RNA用Quick Master RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR反應(yīng)體系：2×RT-PCR Quick Master Mix 25ul，引物各10 pmol，RNA樣品0.1～2 μg，Mg2+2.5 μl，上游引物 10 pmol，下游引物 10 pmol，加DEPC水至50 μl。各β-actin(內(nèi)參基因)、PTEN、RELA、mTOR等引物均由Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，上海生工公司合成(引物序列見(jiàn)表1)。反應(yīng)條件：90 ℃預(yù)變性30 min，90 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1min，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸7 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中同步進(jìn)行內(nèi)對(duì)照β-actin的定量檢測(cè)，分別制備目的基因和內(nèi)參基因β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果分析使用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行相對(duì)定量，以mTOR、PTEN、RELA(NF-κB)基因分別與β-actin拷貝數(shù)之比為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 含藥血清對(duì)PTEN、p-Akt、mTOR及NF-κB p65蛋白表達(dá)影響

表1 各基因引物序列

表2、圖1顯示，前列消癥湯大鼠含藥血清各劑量組培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞株24 h后，各細(xì)胞組的p-Akt蛋白水平、mTOR蛋白水平及NF-κB p65蛋白水平呈明顯下降趨勢(shì)，而PTEN蛋白水平呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。前列消癥湯含藥血清中、高劑量組PTEN蛋白表達(dá)量明顯高于胎牛血清組(對(duì)照組)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；前列消癥湯含藥血清中、高劑量組p-Akt和NF-κB p65蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)含藥血清處理后，mTOR蛋白表達(dá)水平隨藥物劑量的升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 含藥血清對(duì)PC-3細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)影響

注：與對(duì)照組比較：*P< 0.05

圖1 含藥血清對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路主要分子蛋白表達(dá)影響

2.2 含藥血清培養(yǎng)對(duì)mTOR、PTEN、RelA(NF-κB)基因表達(dá)的影響

表3、圖2顯示，用含10%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞24 h后，前列消癥湯含藥血清高劑量組mTOR、RelA(NF-κB)基因表達(dá)被抑制，與胎牛血清組、空白血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胎牛血清組與空白血清組比較，mTOR基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。前列消癥湯含藥血清高劑量組PTEN基因的表達(dá)增強(qiáng)，與胎牛血清組、空白血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胎牛血清組與空白血清組比較，PTEN基因表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 含藥血清對(duì)mTOR、PTEN和NF-κB/RelA基因表達(dá)影響

注：與胎牛血清組比較：*P< 0.05

圖2 含藥血清對(duì)PC-3細(xì)胞PI3K/AKT通路中mTOR、PTEN和NF-κB/RelA基因表達(dá)影響注：1.大鼠含藥血清高劑量組；2.胎牛血清組；3. 大鼠空白血清組

3 討論

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidy-linositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)激素非依賴性前列腺癌(androgen independent prostate cancer，AIPC)的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起重要作用。AIPC細(xì)胞表達(dá)大量活化的PI3K和Akt，活化的Akt能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝、細(xì)胞周期以及腫瘤血管生成，促進(jìn)AIPC的發(fā)生、發(fā)展[4～6]。PTEN (Phosphatase and tensin homologue deleted on chromo-some ten) 是1個(gè)抑癌基因，能特異地使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸3’位脫磷酸，實(shí)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)[7]。PTEN丟失或功能失常是前列腺癌發(fā)生最常見(jiàn)的病因之一，而PTEN的失活必然導(dǎo)致PI3K/AKT通路活化。Wang等采用Cre-Loxp系統(tǒng)以去除PTEN的表達(dá)，構(gòu)建的小鼠前列腺癌模型表明，由PTEN丟失引發(fā)的小鼠前列腺癌與人體前列腺癌發(fā)生有著相似的過(guò)程，并且還會(huì)引起該腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與不依賴于雄激素的增殖[8]。Akt處于PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的核心部位，在細(xì)胞的增殖、生存及凋亡和細(xì)胞惡變的產(chǎn)生中扮演重要角色。Akt的活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，活化的Akt在介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲、細(xì)胞凋亡和抵抗化療、放療方面有重要作用。多種生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子、PTEN的失活等均可刺激Akt的活化。激活后的磷酸化Akt(p-Akt)蛋白再轉(zhuǎn)位到胞漿中或胞核內(nèi)，通過(guò)對(duì)一系列底物的磷酸化，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是Akt最重要的底物之一。mTOR在哺乳動(dòng)物中最重要的生物學(xué)功能是參與蛋白翻譯的調(diào)節(jié)，mTOR可整合細(xì)胞外生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)、能量等各種信號(hào)，通過(guò)RNA的轉(zhuǎn)錄尤其是蛋白質(zhì)翻譯合成調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)是1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，包括5個(gè)亞單位，即Rel (cRel)、p65 (RelA， NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)，最常見(jiàn)的NF-κB二聚體是p65與 p50組成的異二聚體。在靜息的細(xì)胞中，NF-κB 和NF-κB 的抑制單位IκB形成復(fù)合體，以無(wú)活性形式存在于胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受細(xì)胞外信號(hào)刺激后，IκB激酶復(fù)合體(IκB kinase，IKK)活化將IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位點(diǎn)。NF-κB與PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)系密切，它是Akt的作用靶基因之一。PKB/Akt可直接磷酸化IKKa，使IκB激酶(IKK)激活，調(diào)節(jié)NF-κB活性。PKB/Akt對(duì)于IKK介導(dǎo)的IκB降解和NF-κB激活是必需的。PKB/Akt是NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因素，對(duì)刺激前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有重要作用[9]。由此可見(jiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)AIPC的發(fā)生發(fā)展起重要作用，PTEN功能失常激活PI3K/AKt信號(hào)通路，Akt與它的底物或靶基因促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡。

前列消癥湯(莪術(shù)、土貝母、豬苓、白花蛇舌草、生薏苡仁、炙黃芪、黃精組成)是由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院著名中西醫(yī)結(jié)合泌尿外科專家劉猷枋教授治療激素非依賴性前列腺癌(AIPC)的經(jīng)驗(yàn)方。劉猷枋教授在臨床診治過(guò)程中，觀察到晚期前列腺癌病機(jī)，多屬本虛標(biāo)實(shí)，本虛指正氣不足、氣血虧虛，標(biāo)實(shí)指濕熱、瘀毒[10]。正氣不足，邪氣蔓延，癌瘤破壞人體陰陽(yáng)平衡，耗損氣血津液；多數(shù)患者經(jīng)過(guò)藥物或手術(shù)去勢(shì)后腎精虧虛、氣血失和而出現(xiàn)潮熱、汗出等一系列癥狀。前列消癥湯就是在這個(gè)理論基礎(chǔ)上以利濕解毒、益氣養(yǎng)陰為治法組方而成，治療上應(yīng)以扶正祛邪并用。方中生薏苡仁健脾滲濕為君藥；黃精、黃芪補(bǔ)氣養(yǎng)陰，配白花蛇舌草清熱解毒為臣藥；伍以莪術(shù)、土貝母、豬苓解毒散結(jié)、祛瘀止痛，共為佐使，諸藥合用共達(dá)利濕解毒、益氣養(yǎng)陰之功，體現(xiàn)了中醫(yī)扶正祛邪的原則。臨床累積治療AIPC患者100多例，發(fā)現(xiàn)該方能改善患者排尿困難、疼痛、食欲減低等癥狀，提高患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存期[2，3]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，前列消癥湯能抑制人前列腺癌雄激素不敏感細(xì)胞株P(guān)C-3的增殖，誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞的凋亡[11]。既然，PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)AIPC的發(fā)生發(fā)展起重要作用，前列消癥湯治療AIPC有效，且能抑制PC-3細(xì)胞的增殖。那么前列消癥湯能否調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路而發(fā)揮治療作用？

為驗(yàn)證上述推論，本研究采用血清藥理學(xué)方法，選取人PC-3細(xì)胞作為研究對(duì)象，制備前列消癥湯大鼠含藥血清、胎牛血清及含藥血清培養(yǎng)PC-3細(xì)胞，用Western Blot和RT-PCR法檢測(cè)含藥血清對(duì)PI3K/Akt通路中關(guān)鍵分子PTEN、Akt、mTOR、NF-κB表達(dá)的影響。Western Blot結(jié)果，前列消癥湯含藥血清各劑量組培養(yǎng)前列腺癌PC-3細(xì)胞株24 h后，各細(xì)胞組的p-Akt蛋白水平、mTOR蛋白水平及NF-κB p65蛋白水平呈明顯下降趨勢(shì)，而PTEN蛋白水平呈升高趨勢(shì)。與胎牛血清組(對(duì)照組)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈劑量依賴性，含藥血清高劑量組效果更明顯。RT-PCR結(jié)果，前列消癥湯含藥血清高劑量組mTOR、RelA(NF-κB)基因表達(dá)被抑制，與胎牛血清組、空白血清組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；胎牛血清組與空白血清組比較，mTOR基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。前列消癥湯含藥血清高劑量組PTEN基因的表達(dá)增強(qiáng)，與胎牛血清組、空白血清組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可推論，前列消癥湯含藥血清能下調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路中Akt、mTOR和NF-κB表達(dá)，上調(diào)PTEN表達(dá)，這可能是中藥復(fù)方治療前列腺癌的分子機(jī)制之一。

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