林飛太等

【摘 要】目的：觀察獨活寄生湯含藥血清對兔退變軟骨細胞“caveolin-p38MAPK”信號通路的調(diào)控作用，探討獨活寄生湯治療骨關節(jié)炎的作用機制。方法：將20只3月齡新西蘭兔隨機分為生理鹽水組（空白血清組）和獨活寄生湯組（含藥血清組），每組10只。分別在24 h、36 h、48 h不同采血時間點采集獨活寄生湯含藥血清和空白血清，將5%、10%、15%、20%不同濃度兩種血清作用于體外培養(yǎng)第2代軟骨細胞，確定含藥血清最佳干預條件；建立體外退變軟骨細胞模型，分別給予獨活寄生湯含藥血清（含藥血清組）和空白血清（空白血清組）干預36 h，收集軟骨細胞，運用Western Blot法檢測血清干預后退變軟骨細胞caveolin-1、p38、p-p38蛋白表達，RT-PCR法檢測血清干預后退變軟骨細胞白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、caveolin-1 mRNA表達。結果：濃度為15%的36 h采血時間點含藥血清的促增殖作用最明顯；退變軟骨細胞中存在“caveolin-p38MAPK”信號通路的激活，獨活寄生湯含藥血清可抑制caveolin-1、p-p38蛋白表達及IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13、caveolin-1 mRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。結論：獨活寄生湯能通過抑制

“caveolin-p38MAPK”信號通路的激活及其下游效應分子，從而有效抑制軟骨細胞凋亡。

【關鍵詞】 骨關節(jié)炎；獨活寄生湯；軟骨細胞；細胞凋亡；信號通路

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.04.001

Effects of Serum Medicated with Duhuo Jisheng Decoction on the Induced Degeneration of Articular Chondrocytes in Vitro Culture Based upon “caveolin-p38MAPK” Signal Pathway

LIN Fei-tai，LIN Yu，ZHANG Yi-yuan，XIA Chun，ZHANG Bing，XIAO Li-li，F(xiàn)ENG Er-you，WANG Wu-lian

【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of serum medicated with Duhuo Jisheng Decoction on the induced degeneration of articular chondrocytes in vitro culture based upon “caveolin-p38MAPK” signal pathway and probe the mechanism of Duhuo Jisheng Decoction in the treatment of osteoarthritis.Methods：20 March

old New Zealand rabbits were randomly divided into normal saline group（blank serum group）and Duhuo Jisheng Decoction group （drug containing serum group），10 rats in each group.The second generation of cartilage cells was cultured in vitro using different time points of sample collection such as 24 h，36 h and 48 h，serums medicated with 5%，10%，15% and 20% concentrations of Duhuo Jisheng Decoction and blank serums.The best intervention time of medicated serum was determined，which was then used to deal with the degenerating chondrocytes.The degenerated cartilage cell models in vitro were established，which were intervened by the serum medicated with Duhuo Jisheng Decoction（drug containing serum group）and the blank serum（blank serum group）after 36 h，collecting chondrocytes. The Western Blot method was used to detect the expression of degenerated cartilage cells caveolin-1 and p-p38 protein after serum intervention.The RT-PCR method was used to detect the expression of degenerated cartilage cells IL-1β，TNF-α，MMP-3，MMP-13 and caveolin-1 mRNA after serum intervention.Results：The concentration of 15% and 36 h sampling time point serum on the proliferation；the activation of "caveolin-p38MAPK" signaling pathway in the degeneration of cartilage cell，Duhuo Jisheng decoction containing serum can inhibit the expression of caveolin-1，p-p38 protein expression and IL-1β，TNF-α， MMP-3，MMP-13，caveolin-1，mRNA，the difference was statistically significant（P < 0.05）.Conclusion：Duhuo Jisheng decoction can inhibit the "caveolin-p38MAPK" signal pathway and its downstream effector molecules， which can effectively inhibit the apoptosis of cartilage cells.

【Keywords】 osteoarthritis；Duhuo Jisheng Decoction；chondrocyte；apoptosis；signal pathway

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種進展性的累及全身多關節(jié)的高發(fā)性疾病，是機械性和生物性因素的共同作用，使關節(jié)軟骨細胞、細胞外基質(zhì)和軟骨下骨合成與降解失去平衡的結果，細胞凋亡是軟骨退變的關鍵因素之一[1]。獨活寄生湯能有效改善OA的臨床癥狀，但其確切作用機制尚未完全明了。本實驗通過獨活寄生湯含藥血清對兔退變軟骨細胞“caveolin-p38MAPK”信號通路的調(diào)控研究，探討獨活寄生湯干預軟骨細胞凋亡的作用途徑，為揭示其治療OA的作用機制及藥效物質(zhì)基礎提供新的研究思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 普通級3月齡新西蘭兔（體質(zhì)量約1.7～2.2 kg）20只，雌雄各半，用于制備血清；4周齡普通級新西蘭兔6只，用于建立體外培養(yǎng)軟骨細胞的取材（上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場）。福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供清潔級醫(yī)學實驗動物環(huán)境設施，動物許可證號：SYXK（閩）2009-0001。

1.2 藥 物 獨活寄生湯由獨活、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防風、肉桂、細辛、川芎、當歸、芍藥、干地黃、人參、茯苓、甘草組成，由本院藥劑科提供。

1.3 試 劑 DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（Gibico公司）；雙抗混合液（100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素），胰酶、I型膠原酶（Sigma公司）；TRIZOL試劑（Invit-rogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）；引物合成（上海生工生物工程公司）；Anti-p-p38α

（Thr180/Tyr182）一抗（Millipore公司）；p38一抗（Millipore公司）；caveolin 1一抗（BD bioscience公司）。

2 方 法

2.1 獨活寄生湯含藥血清的制備 將20只普通級3月齡新西蘭兔隨機分為獨活寄生湯組（含藥血清組）和生理鹽水對照組（空白血清組），每組10只。根據(jù)人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表換算[2]，含藥血清組給予獨活寄生湯

3.3 g·kg-1·d-1，空白血清組給予質(zhì)量分數(shù)0.9%生理鹽水灌胃；兩組均連續(xù)灌胃5 d，上午、下午各給藥1次，于末次灌胃后3 h腹主動脈采血，靜置于

4 ℃冰箱4 h后2500 r·min-1 離心25 min，分離血清，同組血清混合，于56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾器過濾，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 退變軟骨細胞模型的建立及含藥血清干預軟骨細胞最佳量效、時效關系的確定 采用酶消化法從4周齡普通級新西蘭兔的膝關節(jié)軟骨中分離得到軟骨細胞，進行細胞培養(yǎng)至第2代軟骨細胞；再予10 ng·mL-1白細胞介素（IL）-1β誘導獲得退變軟骨細胞[3]；誘導退變干預24 h后棄培養(yǎng)液，換用如下6種培養(yǎng)體系進行干預。

細胞分為6組，正常組用20%空白血清加入正常軟骨細胞共培養(yǎng)。模型組用20%空白血清加入退變軟骨細胞共培養(yǎng)。含藥血清組用5%、10%、15%、20%（體積百分比）含藥血清干預退變軟骨細胞。每組每個時間段設6個復孔，做好標記及記錄，分別于培養(yǎng)24 h、36 h、48 h后取1板運用MTT法檢測干預后軟骨細胞的活性，確定干預軟骨細胞的最佳量效與時效關系。

2.3 Western Blot法檢測軟骨細胞caveolin-1、p-p38蛋白表達 將第2代軟骨細胞按抽簽法隨機分為正常組、模型組、含藥血清組，見表1。

血清干預結束后，退變軟骨細胞中總蛋白的提取，BCA法測定蛋白含量，Western Blot法檢測蛋白表達，按每個樣品總蛋白40 μg加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶室溫封閉1 h，加入一抗：caveolin-1 1∶1000；Anti-p-p38α（Thr180/Tyr182）1∶6000；p38 11000。4 ℃過夜，TBST洗膜4次，結合二抗anti-rabbit（1∶10 000），anti-rat（1∶10 000），室溫孵育1 h后，洗膜6次后ECL化學發(fā)光檢測。

2.4 RT-PCR法檢測軟骨細胞IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3、MMP-13、caveolin-1 mRNA表達 實驗分組及干預方法同2.3，血清干預軟骨細胞結束后，棄掉培養(yǎng)液，用PBS輕輕漂洗后，加1 mL Trizol進行裂解，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，進行目的基因的擴增。PCR擴增反應液共20 μL，含Dream Taq Green PCR Master Mix（2×）10 μL、模板DNA、上下游引物各1 μL，滅菌蒸餾水7 μL，

在PCR擴增儀上擴增。擴增參數(shù)94 ℃預變性3 min，

94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物一起進行瓊脂糖凝膠電泳、拍照、結果分析。目的基因引物序列見表2。

2.5 統(tǒng)計學方法 研究中軟骨細胞的培養(yǎng)、干預及指標的檢測均經(jīng)獨立重復實驗3次，采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 軟骨細胞的形態(tài)及鑒定 分離培養(yǎng)的軟骨細胞外觀呈多角形，胞質(zhì)豐富，胞核清楚，核為圓形或橢圓形，位于胞體中心，核仁為1～2個，細胞折光性好，且呈集落生長，甲苯胺藍染色使正常軟骨細胞胞漿呈藍色，可見1～2個核仁，呈藍紫色，見圖1（1）；OA軟骨細胞相對于正常軟骨細胞，細胞變狹長，胞漿染色稍淺，胞漿內(nèi)可見空泡，一部分細胞形態(tài)不規(guī)則，見圖1（2）；正常軟骨細胞II型膠原免疫組化染色呈陽性反應，細胞胞漿內(nèi)有黃色顆粒，胞核基本無著色，見圖1（3）；OA軟骨細胞相對于正常軟骨細胞，胞漿顆粒顏色變淺，見圖1（4）。

圖1 新西蘭兔正常和OA軟骨細胞分離培養(yǎng)

組織細胞學光鏡切片

3.2 含藥血清的最佳干預時間及最佳濃度 經(jīng)MTT法檢測，結果顯示，在不同時間點，模型組關節(jié)軟骨細胞的OD值均降低，與正常組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），提示IL-1β誘導退變的軟骨細胞出現(xiàn)增殖減緩。其中，10%、15%、20%濃度的含藥血清，均能促進軟骨細胞增殖，隨著干預時間的延長，促增殖作用越明顯，具有時間依賴性，其中以15%濃度的含藥血清，干預36 h，促增殖作用最明顯，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義

（P < 0.01），故選擇以15%含藥血清，36 h作為后續(xù)實驗的最佳含藥血清干預濃度和干預時間。

3.3 軟骨細胞中caveolin-1、p-p38蛋白的檢測口

Western Blot檢測細胞中caveolin-1、p-p38蛋白的表達情況，各組均可見caveolin-1、p-p38蛋白的表達，其中p-p38在正常軟骨細胞中僅為微弱表達，模型組軟骨細胞caveolin-1、p-p38蛋白的表達可見明顯增強（P < 0.05），而含藥血清能降低caveolin-1、p-p38的表達，但仍高于正常組（P < 0.05），見圖2。

注 1.正常組；2.模型組；3.含藥血清組

圖2 各組細胞caveolin-1、p-p38蛋白的表達

3.4 獨活寄生湯含藥血清對IL-1β、TNF-α、MMP-3、

MMP-13、caveolin-1 mRNA表達的影響 RT-PCR檢

測各組軟骨細胞IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13、

caveolin-1 mRNA的表達，各組均可見相關基因的特異性條帶。各目的基因的表達，在模型組均見明顯的增強（P < 0.05），而含藥血清能明顯降低這一趨勢（P < 0.05）。見圖3。

注 1.正常組；2.模型組；3.含藥血清組

圖3 各組細胞IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13 、caveolin-1 mRNA的表達

4 討 論

OA屬中醫(yī)學“痹證”范疇，主要由于患者機體正氣不足，氣血虧虛，風寒濕侵襲關節(jié)，血運不暢，氣血津液運行障礙造成。獨活寄生湯有祛風濕、止痹痛、益肝腎、補氣血之功，能夠延緩OA軟骨的退變。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，獨活寄生湯可以抑制軟骨細胞的線粒體凋亡通路[4-5]，而caveolin-p38MAPK信號通路與細胞的生長凋亡密切相關[6]，通過揭示獨活寄生湯多靶點、多層面、多環(huán)節(jié)的整體調(diào)節(jié)方式，會更好地針對OA的復雜病理。

Caveolae首先由日本學者Yamada在1955年使用電子顯微鏡觀察小鼠膽囊上皮細胞質(zhì)膜時發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，人們逐漸認識到Caveolae不僅與細胞的物質(zhì)分子和離子轉(zhuǎn)運有關，還在細胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7-8]，caveolin-1對軟骨細胞內(nèi)p38MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑的激活具有重要作用，是p38MAPK上游的關鍵信號分子[9]，其高表達能誘導p38MAPK信號通路的激活并且引起軟骨細胞合成II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的能力減弱，從而促進軟骨細胞的凋亡。p38MAPK最早在研究細胞外高滲環(huán)境對酵母菌的影響時發(fā)現(xiàn)的，是細胞外信號引起細胞核內(nèi)反應的重要通道，能被細胞外環(huán)境的改變、促炎因子等多種細胞外刺激所激活，參與細胞的生長、分化、退變、衰老及凋亡等多種生理病理過程。p38MAPK通路未被激活時，p38主要分布于胞漿，其激活需要蘇氨酸（Threonin，Thr180）和酪氨酸（Tyrosin，Tyr182）雙位點的磷酸化，激活后的p-p38能轉(zhuǎn)移入胞核中，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控特定基因的表達。

在關節(jié)軟骨中有很多因素可以激活p38，如各種細胞因子、滑液中的炎性因子、機械應力，甚至是X線，而在關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中，力學因素和關節(jié)內(nèi)環(huán)境均會發(fā)生改變，所以p38MAPK信號通路在關節(jié)炎中容易被激活。研究表明，p38MAPK信號通路是關節(jié)軟骨細胞凋亡的上游信號通路之一，一氧化氮、IL-b[10]均可以通過激活p38誘導軟骨細胞的凋亡，阻斷p38MAPK信號通路可以明顯阻斷OA軟骨細胞的凋亡。因而p38MAPK信號通路在關節(jié)軟骨的破壞中可能處于一個樞紐地位，它與軟骨細胞表型的保持和分化、軟骨細胞調(diào)亡、軟骨基質(zhì)金屬蛋白酶的合成及軟骨促炎性細胞因子的產(chǎn)生等有密切關系。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，獨活寄生湯能下調(diào)caveolin-1、p-p38表達，從而抑制p38MAPK凋亡通路的激活，并進一步抑制下游效應指標

IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13的表達。IL-1β、

TNF-α是重要的分解型細胞因子，其過表達將導致細胞因子合成與分解途徑的失衡，造成OA關節(jié)軟骨毀損，而MMPs是一系列以降解細胞外基質(zhì)成分為主要功能的蛋白酶，可引起軟骨基質(zhì)的破壞進而導致關節(jié)結構與功能的紊亂，IL-1β、TNF-α、MMPs均是p38MAPK凋亡通路下游的重要效應分子[11-12]，因而獨活寄生湯能有效抑制軟骨細胞凋亡，本結果為利用獨活寄生湯治療OA提供了較好的理論依據(jù)。

5 參考文獻

[1] Roland W，Moskowitz RD，Altman MC，et al.骨關節(jié)炎診斷與治療[M].4版.謝利民，譯.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：3-9.

[2] 吳秉純.醫(yī)學動物實驗基礎及基本技術方法[M].哈爾濱：黑龍江人民出版社，2008：184.

[3] 任志偉，俞永林，楊豐建，等.IL-1β對兔關節(jié)軟骨細胞MMP-1/-13mRNA表達和NO的影響[J].復旦學報：醫(yī)學版，2008，35（2）：167-170.

[4] 吳廣文，王武煉，潘彩彬，等.獨活寄生湯含藥血清對大鼠退變軟骨細胞線粒體凋亡通路的影響[J].風濕病與關節(jié)炎，2014，3（10）：5-9.

[5] 潘彩彬，王武煉，吳廣文，等.獨活寄生湯含藥血清對大鼠退變軟骨細胞Bcl-2、Bax表達的影響[J].風濕病與關節(jié)炎，2014，3（12）：30-33.

[6] Fernández-Hernando C，Yu J，Dávalos A，et al.Endothelial-specific overexpression of caveolin-1 accelerates atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J].Am J Pathol，2010，177（2）：998-1003.

[7] Lü XJ，Li YY，Zhang YJ，et al.Over-expression of caveolin-1 aggravate LPS-induced inflammatory response in AT-1 cells via up-regulation of cPLA2/p38 MAPK[J].Inflamm Res，2010，59（7）：531-541.

[8] Head BP，Peart JN，Panneerselvam M，et al.Loss of caveolin-1 accelerates neurodegeneration and aging[J].PLoS One，2010，5（12）：e15697.

[9] Dai SM，Shan ZZ，Nakamura H，et al.Catabolic stress induces features of chondrocyte senescence through overexpression of caveolin 1：possible involvement of caveolin 1-induced down-regulation of articular chondrocytes in the pathogenesis of osteoarthritis[J].Arthritis Rheum，2006，54（3）：818-831.

[10] Kühn K，Shikhman AR，Lotz M.Role of nitric oxide，

eactive oxygen species，and p38 MAP Kinase in the regulation of human chondrocyte apoptosis[J].J Cell Physiol，2003，197（3）：379-387.

[11] Kunisch E，Gandesiri M，F(xiàn)uhrmann R，et al.Predominant activation of MAP kinases and pro-destructive/pro-inflammatory features by TNF alpha in early-passage synovial fibroblasts via TNF receptor-1：failure of p38 inhibition to suppress matrix metalloproteinase-1 in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis，2007，66（8）：1043-1051.

[12] Chowdhury TT，Arghandawi S，Brand J，et al.Dynamic compression counteracts IL-1beta induced inducible nitric oxide synthase and cyclo-oxygenase-2 expression in chondrocyte/agarose constructs[J].Arthritis Res Ther，2008，10（2）：R35.

收稿日期：2015-02-05；修回日期：2015-03-27