王飛 郭宗科 張紅葉 潘永正 董正邦 陳梅 單瑩 嚴(yán)翹 余衛(wèi)平

攜人乳頭瘤病毒6型全基因細(xì)胞的組織工程皮片培養(yǎng)的初步研究

王飛 郭宗科 張紅葉 潘永正 董正邦 陳梅 單瑩 嚴(yán)翹 余衛(wèi)平

目的 建立人乳頭瘤病毒6型（HPV6）全基因體外組織工程皮片培養(yǎng)模型，為進(jìn)一步研究HPV病毒周期奠定基礎(chǔ)。方法 用電轉(zhuǎn)的方法，將HPV6全長線性基因和質(zhì)粒pEGFP-▲EGFP共轉(zhuǎn)染hTERT細(xì)胞，G418抗性篩選，Southern印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)HPV病毒含量；3T3 J2滋養(yǎng)層細(xì)胞、I型鼠尾膠原與含HPV6基因的hTERT細(xì)胞（HPV6.hTERT細(xì)胞）混合后，在金屬網(wǎng)格上共同培養(yǎng)，逐漸形成皮片樣結(jié)構(gòu)。HE染色和免疫組化檢測皮片的組織結(jié)構(gòu)和HPV6 L1蛋白表達(dá)，電鏡檢查皮片病毒顆粒。結(jié)果 HPV6全長線性基因成功轉(zhuǎn)入hTERT細(xì)胞，Southern印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)含HPV6 DNA；與3T3 J2細(xì)胞、I型鼠尾膠原共同培養(yǎng)的HPV6.hTERT細(xì)胞隨時間而增殖分化，逐漸形成具有疣狀增生外觀的皮片。皮片HE染色顯示，培養(yǎng)7 d即出現(xiàn)典型的皮膚分層結(jié)構(gòu)；培養(yǎng)21 d皮片可見明顯乳頭瘤樣增生、空泡細(xì)胞、角化過度、角化不全等HPV感染組織病理表現(xiàn)。免疫組化顯示皮片上部有HPV6 L1蛋白表達(dá)。電鏡檢測發(fā)現(xiàn)皮片中存在HPV6病毒顆粒。結(jié)論 HPV6全基因組織工程皮片培養(yǎng)模型為HPV的生物學(xué)研究提供了一個平臺，但在應(yīng)用上有一定的局限性。

人乳頭狀瘤病毒6；培養(yǎng)技術(shù)；病理學(xué)；病毒包膜蛋白質(zhì)類；皮片培養(yǎng)

人乳頭瘤病毒（HPV）是小DNA病毒，有嚴(yán)格的 嗜人類上皮組織特性；在體內(nèi)HPV感染上皮細(xì)胞后，隨上皮細(xì)胞的分化而復(fù)制。HPV生活周期與人上皮細(xì)胞分化密切相關(guān)，故難以用常規(guī)、單層細(xì)胞培養(yǎng)來繁殖，只能用上皮組織進(jìn)行培養(yǎng)［1-2］。目前，低危型HPV在體外培養(yǎng)相對困難，給HPV致病機(jī)制的研究及治療藥物的研發(fā)帶來了困難。本研究建立攜帶HPV6型全基因的hTERT細(xì)胞，該細(xì)胞與3T3 J2滋養(yǎng)層細(xì)胞、鼠膠原共同培養(yǎng)，形成具有疣狀增生外觀的皮片。檢測皮片細(xì)胞層L1蛋白的表達(dá)和是否存在病毒顆粒，明確HPV6型全基因體外組織工程皮片培養(yǎng)模型是否成功建立。

作者單位：210009南京，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院皮膚科（王飛、張紅葉、潘永正、董正邦、陳梅、單瑩、嚴(yán)翹），整形科（郭宗科）；東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系（余衛(wèi)平）

材料與方法

一、材料

1.質(zhì)粒和細(xì)胞：hTERT細(xì)胞來自美國ATCC細(xì)胞庫（ATCC Number：CRL-4000）；3T3 J2 滋養(yǎng)層細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室傳代維持生長；攜帶HPV6全長基因的質(zhì)粒pSP65-HPV6，由美國Craig Meyers教授饋贈；質(zhì)粒pEGFP-1，為美國Clontech公司產(chǎn)品；大腸桿菌DH5a由本室保存。

2.抗體及細(xì)胞培養(yǎng)試劑：表皮生長因子、胎牛血清（FBS）（美國 Sigma公司）；鼠尾膠原 I型、表皮生長因子（EGF）（美國BD Bioscience公司）；內(nèi)切酶KpnI、BsrG I、BamH1、EcoRI、T4DNA 連接酶 （英國NEB公司）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國Invitrog公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（美國Qiagen公司）；硝酸纖維素膜（美國Bio-Rad公司）；抗HPV 6 L1單克隆抗體（美國Meridian life science公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢百翌博科技有限公司）；探針Read to Go DNA標(biāo)記試劑盒純化柱（Probe Quant G50 microcolumn）（美國 Amersham Pharmacia公司）。

3.主要設(shè)備：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Hera Cell公司），GelDoc1000凝膠成像系統(tǒng)和電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司）。

二、方法

（一）攜HPV6全基因細(xì)胞株的建立：

1.質(zhì)粒pEGFP-▲EGFP的構(gòu)建：用KpnI和BsrG I雙酶切質(zhì)粒pEGFP-1，切除EGFP片段，補(bǔ)平并用T4 DNA連接酶連接成環(huán)后，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5a，卡那霉素抗性篩選陽性克??；用質(zhì)粒試劑盒提取去掉EGFP段的質(zhì)粒pEGFP-▲EGFP，TE緩沖液保存。

2.攜HPV6全基因hTERT細(xì)胞的培養(yǎng)：①30 μg含HPV6型全基因的質(zhì)粒pSP65-HPV6，用EcoR I酶切得到線狀HPV6型全基因，酚/氯仿法回收與純化，25 μl TE緩沖液保存；②線狀HPV6基因和pEGFP-▲EGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入hTERT細(xì)胞：10 μl TE緩沖液（7.5 μg線狀HPV6）、10 μl（1 μg）pEGFP-▲EGFP質(zhì)粒、4.25 μl（42.5 μg）鮭魚精子DNA、275 μl hTERT細(xì)胞（5×106）輕輕混勻，電轉(zhuǎn)，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10 cm培養(yǎng)皿中，375 mg/L G418篩選，細(xì)胞超過80%融合時（13～15），傳代，鑒定。

3.hTERT細(xì)胞內(nèi)HPV6基因的檢測：①0.25%胰酶-EDTA消化上述轉(zhuǎn)染后80%融合的貼壁生長hTERT細(xì)胞，離心、沉淀，液氮中反復(fù)凍融；按組織DNA提取試劑盒操作步驟提取細(xì)胞內(nèi)HPV6 DNA；②Southern印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)HPV6基因，DNA探針的制備按Meyers等［3］制備HPV探針的方法。pSP65-HPV6，EcoR I酶切，0.8%凝膠電泳，純化得線狀HPV6型全基因。參照Read to Go DNA標(biāo)記試劑盒32P標(biāo)記探針，純化柱純化；按《分子克隆操作指南進(jìn)行》雜交［4］。

（二）攜HPV6型全基因組織工程皮片的培養(yǎng)：

1.攜HPV6型全基因皮片的培養(yǎng)：①胰酶消化低代3T3 J2細(xì)胞，與Ⅰ型鼠尾凝膠混勻，種于6孔培養(yǎng)板上，每孔6.25×105細(xì)胞和2 mlⅠ型鼠尾凝膠，37℃5%CO2培養(yǎng)2 h；②每孔加入1.0×106HPV6.hTERT細(xì)胞，培養(yǎng)過夜；③將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到帶網(wǎng)眼的金屬培養(yǎng)網(wǎng)格表面，培養(yǎng)基不超過金屬培養(yǎng)網(wǎng)孔，每48小時換培養(yǎng)基。

2.攜HPV6型全基因的hTERT細(xì)胞組織工程皮片病理、免疫組化和電鏡觀察：①普通病理：收集不同培養(yǎng)時間皮片，HE染色，觀察是否生長成皮膚基本結(jié)構(gòu)、空泡細(xì)胞是否存在；②免疫組化：不同培養(yǎng)時間皮片，冰凍組織切片，PBS洗3 min，10%FBS封閉15 min后與一抗反應(yīng)，抗體為HPV6 L1單抗，然后與生物素標(biāo)記的二抗室溫下反應(yīng)；③電鏡：培養(yǎng)21 d的皮片修切成3×3 mm2的組織塊，JEM-1200透射電鏡觀察。

結(jié) 果

1.轉(zhuǎn)染后的hTERT細(xì)胞內(nèi)HPV6 DNA的檢測：HPV6轉(zhuǎn)染hTERT細(xì)胞后提取其DNA，分別取2.5μg、5 μg、7.5 μg，BamH1 酶切，電泳、雜交、曝光。酶切前見3條DNA帶，分別為超螺旋、開環(huán)和線狀結(jié)構(gòu)，酶切后8 000 bp左右單一條帶，表明HPV6全基因成功轉(zhuǎn)染hTERT細(xì)胞，攜HPV6全基因的細(xì)胞HPV6.hTERT成功建立，見圖1。酶切部位在HPV6基因序列2602-2607。

圖1 Southern印跡法檢測轉(zhuǎn)染后hTERT細(xì)胞內(nèi)HPV6 DNA 1、3、5 酶切前分別為 7.5 μg、2.5 μg、5.0 μg DNA；2、4、6 酶切后，8 000 bp位置出現(xiàn)線狀條帶

2.HPV 6型全基因體外組織工程皮片培養(yǎng)不同時段大體形態(tài)觀察：觀察培養(yǎng)不同時間皮片形態(tài)、顏色的變化。發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時間延長，皮片由表面光滑的粉紅色（主要是培養(yǎng)基的顏色），顏色逐漸變淡，變成表面粗糙（培養(yǎng)第7天后）、疣狀增生的角化性物質(zhì)（培養(yǎng)21 d）。見圖2。

圖2 HPV6型全基因體外組織工程皮片培養(yǎng)不同時段大體形態(tài) 2A：第0天，表面光滑；2B：第7天，有細(xì)胞長出；2C：第14天，角質(zhì)樣物質(zhì)形成；2D：第21天，明顯疣狀增生

3.HPV 6全基因體外組織工程皮片培養(yǎng)不同時段組織結(jié)構(gòu)觀察：角化過度和空泡細(xì)胞是HPV感染特征性病理改變。在皮片培養(yǎng)7、14、21 d，HE染色和免疫組化檢查，觀察皮膚結(jié)構(gòu)、空泡細(xì)胞和HPV蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)隨皮片培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞增生，出現(xiàn)角化過度、分層結(jié)構(gòu)和空泡細(xì)胞，免疫組化發(fā)現(xiàn)HPV L1蛋白，提示皮片有HPV病毒感染。見圖 3，4。

4.培養(yǎng)組織工程皮片的病毒顆粒檢測：HPV病毒隨皮片細(xì)胞分化而復(fù)制，在培養(yǎng)21 d的皮片，細(xì)胞核內(nèi)見明顯病毒顆粒。見圖5。

討 論

在體內(nèi)HPV感染上皮細(xì)胞后，隨上皮細(xì)胞的分化而復(fù)制，感染了HPV的上皮細(xì)胞分化增殖形成具有疣狀增生外觀的組織，該組織具有棘細(xì)胞層、顆粒層、角質(zhì)層等上皮結(jié)構(gòu)，組織病理顯示假上皮瘤樣增生、角化過度和角化不全，顆粒層和棘細(xì)胞層見空泡細(xì)胞。含有大量具有感染性的HPV病毒顆粒，其中顆粒層和角質(zhì)層病毒含量最高［5］。

圖3 HPV6型全基因體外組織工程皮片培養(yǎng)不同時段組織病理（HE×100） 3A：第7天，3～4層上皮細(xì)胞；3B：第14天，6～8層上皮細(xì)胞；3C：第21天，10～11層上皮細(xì)胞，見明顯角化過度，部分空泡細(xì)胞

圖4 HPV6型全基因體外組織工程皮片培養(yǎng)不同時段免疫病理（HE×100） 4A：第7天，未見L1蛋白表達(dá)；4B：第14天，未見L1蛋白表達(dá)；4C：第21天，L1染色陽性，近角質(zhì)層較多棕色顆粒

圖5 病毒透視電鏡（5A：TEM×50 000） 箭頭所指為細(xì)胞內(nèi)HPV6病毒顆粒，5B、5C分別是局部放大

Asselineau與Prunieras在1984年首次提出三維上皮細(xì)胞培養(yǎng)模型［5-6］。2004年 Meyers等利用此模型，將HPV16全基因組分別通過電穿孔法轉(zhuǎn)入PHK，抗生素篩選后形成攜帶HPV全基因組的PHK，然后將其種植在真皮類似物表面。經(jīng)過12～21 d，HPV陽性PHKs分層分化，形成的復(fù)層上皮組織出現(xiàn)空泡細(xì)胞及角化不全，上皮的表層L1衣殼蛋白呈陽性表達(dá)，含有感染性的病毒顆粒［7］。近年來很多人在Meyer研究基礎(chǔ)上改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，嘗試體外培養(yǎng)不同型別的HPV天然病毒顆粒，多種HPV亞型，包括低危的HPV11，利用三維上皮培養(yǎng)模型，在體外復(fù)制成功［8-10］。低危型HPV在體外較高危型HPV難以培養(yǎng)，其原因是低危型HPV通常不能整合入宿主細(xì)胞的染色體，在宿主細(xì)胞里復(fù)制一代較高危型時間長，且復(fù)制較少［11］。

我們用改良的Meyers進(jìn)行HPV6的體外培養(yǎng)。為了培養(yǎng)HPV，必須將HPV病毒全基因轉(zhuǎn)入角質(zhì)形成細(xì)胞；病毒DNA隨細(xì)胞分化而復(fù)制，提高HPV轉(zhuǎn)染率和增加角質(zhì)形成細(xì)胞傳代是重要一步。我們曾用來自包皮的原代角質(zhì)形成細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，將HPV6全長線性基因轉(zhuǎn)入其中，因原代細(xì)胞生命周期較短，轉(zhuǎn)染效率很低，培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)難以檢測到病毒DNA。后比較多種細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞株hTERT細(xì)胞（含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT）是較好的 HPV6 宿主細(xì)胞［12］。采用電轉(zhuǎn)（而不是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）的方法將線性HPV全長線性基因轉(zhuǎn)入hTERT細(xì)胞，通過調(diào)整電轉(zhuǎn)參數(shù)來獲得最佳轉(zhuǎn)染率。研究發(fā)現(xiàn)低電流、長時間電轉(zhuǎn)可有效提高HPV基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)入率，電轉(zhuǎn)時間最長可到180 s；低代hTERT細(xì)胞電轉(zhuǎn)后有更低的死亡率且能較長時間傳代。

為了將成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞篩選出來，采用了G418抗性基因篩選的方法。在電轉(zhuǎn)HPV6全長線性基因的同時，將G418抗性基因pEGFP-▲EGFP，共同轉(zhuǎn)入hTERT細(xì)胞，使含HPV基因的hTERT細(xì)胞有抗G418的能力。質(zhì)粒pEGFP-1為4 200 bp的真核表達(dá)載體，內(nèi)含約800 bp表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP）的報告基因，因該報告基因在本研究中無意義，且小質(zhì)粒有利于轉(zhuǎn)染效率的提高，故用內(nèi)切酶切掉EGFP片段。G418梯度篩選，G418殺死未成功轉(zhuǎn)染HPV的hTERT細(xì)胞，含HPV的hTERT細(xì)胞分化繁殖、逐漸相互融合。檢測發(fā)現(xiàn)子代hTERT細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定富含HPV DNA，是永生化細(xì)胞，該細(xì)胞可用于HPV6體外培養(yǎng)模型的建立。本研究用Southern印跡分析，證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞HPV質(zhì)粒DNA的存在，用BamH1酶切，酶切前DNA3條帶，酶切后發(fā)現(xiàn)在8 000 bp處有明確條帶。

用改良的Meyers的方法，試圖建立HPV6體外組織工程皮片培養(yǎng)模型，但皮片病毒的生成很不穩(wěn)定，分析認(rèn)為轉(zhuǎn)染后皮片培養(yǎng)時間和培養(yǎng)基成分可能對病毒生成有影響?？s短轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)時間，電轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)7 d左右，細(xì)胞融合為50%左右（不等到80%～90%融合），不進(jìn)行傳代，就將含HPV6全基因的高活力hTERT細(xì)胞與3T3 J2滋養(yǎng)層細(xì)胞、Ⅰ型鼠膠原在特制金屬網(wǎng)格上混合培養(yǎng)；培養(yǎng)基換成角質(zhì)形成細(xì)胞專門培養(yǎng)基，且多次加入表皮生長因子和某些金屬離子，常規(guī)液體培養(yǎng)基不超過金屬網(wǎng)格。培養(yǎng)18 d時，偶能發(fā)現(xiàn)HPV病毒顆粒和病毒蛋白。皮片培養(yǎng)隨時間推移，細(xì)胞增生分化，從單層細(xì)胞逐漸分化為8～10層細(xì)胞，見典型的表皮結(jié)構(gòu)，大體形態(tài)出現(xiàn)不同的外觀，由表面光滑變成表面粗糙，培養(yǎng)21 d時，出現(xiàn)明顯角化外觀；培養(yǎng)5 d時，HE染色即見細(xì)胞分化為3層細(xì)胞，隨時間推移，細(xì)胞層數(shù)增多，角化明顯，出現(xiàn)基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層、角質(zhì)層，疣狀增生和特征性空泡細(xì)胞。21 d后，細(xì)胞角化更明顯，但細(xì)胞層數(shù)減少。

HPV6組織工程皮片培養(yǎng)模型為HPV的生物學(xué)研究提供了一個平臺，但制備周期長、操作復(fù)雜，條件要求高，病毒產(chǎn)生不穩(wěn)定等，使其在應(yīng)用上有一定的局限性。

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Preparation of tissue-engineered skin grafts with hTERT cells carrying human papillomavirus type 6 genomein vitro:a preliminary study

Wang Fei*,Guo Zongke,Zhang Hongye,Pan Yongzheng,Dong Zhengbang,Chen Mei,Shan Ying,Yan Qiao,Yu Weiping.*Department of Dermatology,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China

ObjectiveTo establish a model for preparation of tissue-engineered skin grafts with hTERT cells carrying human papillomavirus type 6 （HPV 6）genomein vitro,so as to lay a foundation for studying HPV life cycle.MethodsThe full-length linear HPV6 genome and plasmid pEGFP-▲EGFP were electrophoretically cotransferred into hTERT cells.After selection using G418 resistance,Southern blotting was performed to determine the viral load of HPV6 in transfected cells.3T3 J2 trophoblastic cells,type I rat-tail collagen and hTERT cells containing the full-length HPV6 genes （HPV6.hTERT cells）were mixed and cocultured on metal meshes to form skin graft-like structures.Hematoxylin and eosin（HE）staining was performed to observe the structure of formed skin grafts,an immunohistochemical assay to measure the expression of HPV6 L1 protein,and electron microscopy to observe virus particles in the skin grafts.ResultsThe linear HPV6 gene was successfully transferred into hTERT cells,and Southern blotting showed the presence of HPV6 DNA in the transferred hTERT cells.The HPV6.hTERT cells,which were cocultured with 3T3 J2 trophoblastic cells and type I rat-tail collagen,proliferated and differentiated over time,and gradually formed skin grafts giving the appearance of verrucous hyperplasia.HE staining showed that the cocultured HPV6.hTERT cells could form typical stratified structure of skin after 7 days of cultivation,and histopathologic features of HPV infection,including obvious papillomatous hyperplasia,presence of vesicular cells,hyperkeratosis and parakeratosis,could be observed after 21 days.The immunohistochemical assay showed the expression of HPV6 L1 protein in the upper portion of skin grafts,and electron microscopy revealed the presence of HPV6 virus particles in skin grafts.Conclusions The established model for preparation of tissue-engineered skin grafts using HPV 6 genome-carrying cells provides a basis for biological studies of HPV,but its application is limited to some degree.

Human papillomavirus 6;Culture techniques;Pathology;Viral envelope proteins;Raft culture

Wang Fei,Email:ffwangfei@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.05.006

江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012748）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金（20121707）；南京市科技發(fā)展項(xiàng)目（201104028）

王飛，Email：ffwangfei@163.com

2014-05-15）

（本文編輯：吳曉初）