程婷婷，王鳳梅，朱爭艷，劉輝，呂洪敏

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第三中心臨床學(xué)院消化（肝病）科，天津300170；2.天津市第三中心醫(yī)院消化（肝病）科，天津300170；3.天津市第三中心醫(yī)院，天津市肝膽疾病研究所，天津市人工細(xì)胞重點實驗室，天津300170）

論著

HBV慢性感染者肝臟組織中CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs細(xì)胞的表達(dá)水平

程婷婷1,2，王鳳梅2，朱爭艷3，劉輝3，呂洪敏2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第三中心臨床學(xué)院消化（肝?。┛疲旖?00170；2.天津市第三中心醫(yī)院消化（肝病）科，天津300170；3.天津市第三中心醫(yī)院，天津市肝膽疾病研究所，天津市人工細(xì)胞重點實驗室，天津300170）

目的：計數(shù)慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者肝臟組織中CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs細(xì)胞，觀察不同免疫狀態(tài)下的肝臟組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平之間的差異，探索其臨床意義。方法:選取慢性HBV感染者68例，健康對照組（非HBV感染組）30例，運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行檢測。結(jié)果：慢性HBV感染組的CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs細(xì)胞表達(dá)水平明顯升高，與非HBV感染組相比，P均＜0.001；在HBV感染組中，CD4+T和CD8+T細(xì)胞在免疫耐受期患者肝臟組織中的表達(dá)水平最低，CD4+T、CD8+T細(xì)胞在免疫清除期、再活動期中的表達(dá)水平與二者在免疫耐受期相比，均有增高趨勢，然而CD4+T、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平在免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期及再活動期任意兩期之間比較，P均＞0.05。結(jié)論：CD4+T和CD8+T細(xì)胞在免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期及再活動期患者肝臟組織中表達(dá)水平的變化趨勢在一定程度上反應(yīng)了各期肝臟的免疫狀態(tài)；FoxP3+Tregs細(xì)胞可能與HBV感染慢性化有關(guān)。

乙型肝炎病毒；CD4+T細(xì)胞；CD8+T細(xì)胞；FoxP3+Tregs細(xì)胞；肝臟

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是臨床常見的慢性肝病之一，其感染進(jìn)程受病毒、宿主及外界環(huán)境等因素的影響，被劃分為免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期以及再活動期4個時期[1]。機(jī)體的特異和非特異性免疫反應(yīng)在防御外界病原體、維持機(jī)體免疫平衡的過程中發(fā)揮重要作用，尤其是特異性免疫反應(yīng)，其作用的發(fā)揮亦貫穿了HBV感染的整個過程[2]，之前已有學(xué)者對HBV感染者外周血及肝臟組織中的CD4+T和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行了大量研究[3-5]，但關(guān)于二者在免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期以及再活動期患者肝臟組織中含量差異的研究尚少。CD4+Treg具有無反應(yīng)和免疫抑制性兩大功能，對多種T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)功能，與慢性HBV感染的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)oxP3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性的核轉(zhuǎn)錄因子，對其分化及功能的發(fā)揮具有重要作用。因此本研究主要觀察慢性HBV感染者肝臟組織中CD8+T和CD4+T細(xì)胞及FoxP3+Tregs的表達(dá)水平，并進(jìn)一步觀察HBV感染者各期肝臟組織中CD8+T和CD4+T細(xì)胞的含量差異，探索其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 組織樣本 98例共294個組織樣本均取自天津市第三中心醫(yī)院病理科，HBV感染組68例，男44例，女24例，平均年齡（44±12）歲，其中免疫耐受期13例，免疫清除期11例，低復(fù)制期37例，再活動期7例[分期依據(jù)：免疫耐受期：血清HBsAg和HBeAg陽性，HBV DNA＞107cs/mL，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）正常，肝組織無明顯異常；免疫清除期：ALT升高，HBV DNA＞104cs/mL，肝組織有壞死、炎癥或纖維化；低復(fù)制期：HBeAg陰性，抗-HBe陽性，HBV DNA＜104cs/mL，ALT正常，肝組織學(xué)無或有輕度炎癥；再活動期：患者表現(xiàn)為HBeAg陰性，抗-HBe陽性，ALT升高，且HBV DNA由陰性轉(zhuǎn)為陽性或者持續(xù)增高]。另選30例取自肝血管瘤周圍的正常肝組織作為健康對照組（非HBV感染組），男5例，女25例，平均年齡（48±9）歲，對照組成員外周血肝功能完全正常，病毒標(biāo)志全陰性。凡伴有其它病毒性肝炎或HIV感染、酒精性肝病、脂肪性肝病或自身免疫性肝病以及藥物性肝損傷的肝病患者均排除在外。慢性HBV感染自然史分期參照慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）。該研究經(jīng)天津市第三中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，每份樣本的取得均獲得患者的知情同意。

1.2 免疫組化步驟 福爾馬林固定、石蠟包埋的肝臟組織以4 μm的厚度切片。所有組織切片在70℃的烤箱中加熱50 min后均經(jīng)脫蠟水化，高溫高壓下于pH 6.0的磷酸鹽緩沖液或pH 8.0的EDTA中進(jìn)行抗原修復(fù)，單克隆抗體FoxP3（236A/E7,ab20034，1∶100）、鼠抗人CD8抗體（144B，ab17147，1∶50）、鼠抗人CD4抗體（ZM-0418,即用型）和二抗PV-9000（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）用于染色，DAB顯色后，蘇木素復(fù)染。樹脂干燥后在顯微鏡下觀察，照相。

1.3 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果判定由兩名資深病理醫(yī)師在不知道臨床診斷的前提下獨立閱片。圖像采集用日本奧林巴斯BX51顯微鏡高倍鏡像下（HPF,×400）隨機(jī)選取5個視野，固定拍攝條件下統(tǒng)一進(jìn)行拍攝圖片。再使用IPP5.1軟件編制宏，運(yùn)用宏程序?qū)ε臄z圖片中的CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs細(xì)胞進(jìn)行批量計數(shù)，然后用標(biāo)本中所取的5個視野的計數(shù)總和除以5，得到的平均數(shù)作為每個標(biāo)本的CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs細(xì)胞的最終數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有統(tǒng)計學(xué)分析均使用SPSS 20.0軟件處理。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距Median（IQR）表示。兩組間比較采用Kruskal-Wallis U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8+T、CD4+T、FoxP3+Tregs細(xì)胞在慢性HBV感染者肝臟組織中的表達(dá)情況 CD8+T、CD4+T、FoxP3+Tregs細(xì)胞在肝臟組織中的表達(dá)情況見圖1。與非HBV感染組相比，慢性HBV感染組肝臟組織中CD8+T、CD4+T和FoxP3+Tregs細(xì)胞表達(dá)水平明顯升高，且P均＜0.001，見表1。

圖1 CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs細(xì)胞在慢性HBV感染組和對照組中的表達(dá)情況(HPF，×400)Fig 1 Expressions of CD4+T,CD8+T and FoxP3+Tregs in the chronic HBV infection group and healthy control group（HPF，×400）

表1 兩組肝臟組織中CD4+T、CD8+T、FoxP3+Tregs細(xì)胞表達(dá)水平Tab 1 LevelsofCD4+T,CD8+TandFoxP3+TregsinthechronicHBV infection group and non-HBV infection

2.2 處于HBV感染自然史不同階段的肝臟組織中CD4+T和CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平 HBV感染者肝臟組織中的CD4+T細(xì)胞在4期之間的表達(dá)水平由高到低依次為免疫清除期、再活動期、低復(fù)制期、免疫耐受期；然而CD4+T細(xì)胞在免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期及再活動期任意兩期之間比較，其表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。CD8+T細(xì)胞在4期之間的表達(dá)水平由高到低依次為免疫清除期、低復(fù)制期、再活動期、免疫耐受期；其表達(dá)水平在免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期及再活動期任意兩期之間比較，P均＞0.05，見表2。

表2 不同HBV感染階段的肝臟組織中CD4+T、CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平比較Tab 2 LevelsofCD4+T，CD8+Tcellsinthelivertissueatthedifferent stages of chronic HBV infection

2.3 慢性HBV感染者肝臟組織中FoxP3+Tregs細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的關(guān)系 慢性HBV感染者肝臟組織中FoxP3+Tregs細(xì)胞表達(dá)水平隨CD8+T細(xì)胞的上升而有所上升（r=0.397，P＜0.01），見圖2。

圖2 FoxP3+Tregs細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞之間的關(guān)系Fig 2 Correlation between FoxP3+Tregs and CD8+T

3 討論

T淋巴細(xì)胞亞群及其相關(guān)細(xì)胞因子，尤其是CD4+T和CD8+T細(xì)胞在慢性HBV感染的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。CD4+T細(xì)胞是一類輔助性細(xì)胞，能夠協(xié)助CD8+T細(xì)胞識別感染的肝細(xì)胞，通過細(xì)胞溶解或非溶機(jī)制抑制HBV的復(fù)制[6]，慢性HBV感染過程中，抗原的長期刺激會導(dǎo)致患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的慢性消耗，影響病毒的清除。然而本研究結(jié)果示，與非HBV感染組相比，HBV感染組的CD4+T和CD8+T細(xì)胞均有明顯增加，但增加的CD8+T細(xì)胞并未有效地清除HBV病毒，原因可能是：HBV清除過程中真正起作用的是細(xì)胞毒性T細(xì)胞，即活化的CD8+T細(xì)胞[7]；慢性乙型肝炎患者體內(nèi)乙型肝炎e抗原（HBeAg）的高表達(dá)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受；同時CD4+T細(xì)胞分化的特異性T輔助細(xì)胞水平有所降低[5]。因此我們得知T淋巴細(xì)胞數(shù)量上的變化并不能完全反映其功能的改變。另外我們還發(fā)現(xiàn)HBV感染者肝臟組織中的FoxP3+Tregs細(xì)胞的表達(dá)水平會隨CD8+T細(xì)胞的上升而相應(yīng)上升，眾所周知，F(xiàn)oxP3+Tregs細(xì)胞作為一類具有免疫抑制作用的T淋巴細(xì)胞亞群，能夠抑制CD8+T等細(xì)胞的功能[8-9]，F(xiàn)uruichi等[10]的研究發(fā)現(xiàn)剔除外周血的CD25+Tregs細(xì)胞能夠增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，因此可以認(rèn)為是FoxP3+Tregs細(xì)胞在一定程度上抑制了CD8+T細(xì)胞的功能，從而造成機(jī)體真正參加免疫反應(yīng)的活性細(xì)胞不足，導(dǎo)致了感染的遷延，進(jìn)一步提示其與HBV感染慢性化有關(guān)[11]。

慢性HBV感染史一般分為4個時期，處于免疫耐受期的患者其機(jī)體免疫反應(yīng)不足以清除病毒；低復(fù)制期患者對病毒有一定的控制；免疫清除期和再活動期患者，其機(jī)體正處于識別、清除病毒的過程，是病毒與宿主免疫抗衡的結(jié)果，各期都有獨特的病毒學(xué)、生物化學(xué)特點，對患者進(jìn)行自然史分期，了解肝臟的免疫狀態(tài)，有助于制定治療方案及判斷預(yù)后，而目前關(guān)于慢性HBV感染史不同階段免疫狀況的研究尚缺乏，且已有的研究大都局限于外周血，對肝臟組織免疫微環(huán)境的研究不足。因此筆者對此進(jìn)行了相應(yīng)探索。結(jié)果顯示CD4+T和CD8+T細(xì)胞在免疫耐受期的表達(dá)水平最低，在機(jī)體清除病毒的免疫清除期和再活動期均有升高的趨勢，且在免疫清除期的表達(dá)水平最高，一定程度上能夠反應(yīng)出各期患者免疫反應(yīng)之間的差異，有助于臨床上指導(dǎo)治療，評判患者的免疫能力。然而與Sprengers等[12]的研究結(jié)果基本一致，CD4+T和CD8+T細(xì)胞在免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期和再活動期中的表達(dá)水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。邢漢前等[13]對HBV感染者免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期的研究則發(fā)現(xiàn)，免疫耐受期患者肝內(nèi)浸潤的CD4+T和CD8+T淋巴細(xì)胞明顯少于免疫活動期患者，造成該差異的原因可能是：試驗入組成員的病情嚴(yán)重程度不同，臨床生化學(xué)指標(biāo)和病毒學(xué)指標(biāo)之間存在差異；另一方面，當(dāng)特異性的CD8+T和CD4+T細(xì)胞不足以清除病毒時，會征召非特異性的T淋巴細(xì)胞入肝[3]，這也會影響CD8+T和CD4+T細(xì)胞的含量。因此為更加明確CD4+T和CD8+T細(xì)胞在各期之間表達(dá)水平的差異尚需進(jìn)行大樣本多中心的研究，并且對每個HBV感染者在不同時期的肝臟組織樣本，進(jìn)行縱向觀察分析，這對慢性HBV感染者的個體化治療及判斷臨床預(yù)后與轉(zhuǎn)歸是至關(guān)重要的。

綜上，CD4+T和CD8+T細(xì)胞在免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期及再活動期患者肝臟組織中表達(dá)水平的變化在一定程度上反映了各期肝臟的免疫狀態(tài)，同時我們的研究進(jìn)一步證實FoxP3+Tregs細(xì)胞可能與HBV感染慢性化有關(guān)。

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（2015-10-12收稿）

Level of CD4+T，CD8+T and FoxP3+Tregs in the liver tissues of patients with chronic HBV infection

CHENG Ting-ting1,2,WANG Feng-mei2,ZHU Zheng-yan3,LIU Hui3,Lü Hong-min2
（1.Department of Gastroenterology and Hepatology,The Third Central Clinical College，Tianjin Medical University,Tianjin 300170, China;2.Department of Gastroenterology and Hepatology,The Third Central Hospital of Tianjin,Tianjin 300170,China;3.The Third Central Hospital of Tianjin,Key Laboratory of Artificial Cell,Institute of Hepatobiliary Disease,Tianjin 300170,China）

Objective：To count the number of CD4+T,CD8+T and FoxP3+Tregs in the liver tissue of patients with chronic HBV infection and compare the expression levels of CD4+T and CD8+T cells in liver tissues in different immune status.Methods：The levels of CD4+T, CD8+T and FoxP3+Tregs were detected by the method of immunohistochemistry in 68 chronic HBV infection patients,and 30 individuals without HBV infection as healthy control.Results：Compared with the non-HBV infection group,the expression level of CD4+T,CD8+T and FoxP3+Tregsweresignificantlyhigherin the chronic HBV infection group(P＜0.001);In chronic HBV infection group,the numbers of CD4+T and CD8+T in immune clearance and active period were higher than the ones in the immune tolerance,and the liver tissue from immune tolerance patients had lowest CD4+T and CD8+T levels,but P＞0.05 respectively.Conclusion：To some extent,the expression levels of CD4+T and CD8+T cells in the immune tolerance,immune clearance phase,low copy phase and active period indicate the liver immune status;and maybe FoxP3+Tregs are associated with chronic HBV infection.

hepatitis B virus CD4+T cells;CD8+T cells;FoxP3+T cells;liver

R512.6+2

A

1006－8147（2016）02-0129-04

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目基金資助(13JCYBJC22500)，天津市衛(wèi)生局科技基金(2010KZ123)

程婷婷(1987-)，女，碩士在讀，研究方向：肝臟相關(guān)疾??；通信作者:呂洪敏，E-mail:lvhongmin58@163.com。