許靜

（河北省唐山市工人醫(yī)院內(nèi)分泌二科，河北唐山063000）

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趨化因子CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)水平及其臨床意義

許靜

（河北省唐山市工人醫(yī)院內(nèi)分泌二科，河北唐山063000）

摘要：目的探討趨化因子CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)方法、蛋白印跡法（Western blot）檢測120例甲狀腺乳頭狀癌、40例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及40例正常甲狀腺組織中CXCL14的表達(dá)水平，并分析其與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCL14蛋白陽性率（20.83%）較結(jié)節(jié)性甲狀腺腫（85.00%）、正常甲狀腺組織（75.00%）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western blot結(jié)果表明，CXCL14蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)量為（0.823±0.143），明顯低于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織（1.211±0.012）和正常甲狀腺組織（1.219± 0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CXCL14蛋白的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的包膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期及腫瘤分化有關(guān)（P<0.05）。CXCL14高表達(dá)組的甲狀腺乳頭狀癌患者的生存率明顯高于CXCL14低表達(dá)組（P<0.05）。結(jié)論CXCL14蛋白的表達(dá)可能成為判斷甲狀腺乳頭狀癌惡化程度及預(yù)后的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：甲狀腺乳頭狀癌；趨化因子CXCL14；免疫組織化學(xué)法；蛋白印跡法

甲狀腺癌是內(nèi)分泌腫瘤中最常見的，而甲狀腺乳頭狀癌又占甲狀腺癌的80%以上[1]，因此盡早對(duì)甲狀腺乳頭狀癌患者進(jìn)行診治具有重要意義。腫瘤細(xì)胞的生長受到許多因素的影響，趨化因子與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。[chemokine （C-X-C motif）ligand 14，CXCL14]是CXC趨化因子家族成員之一，在多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)。近期研究顯示，CXCL14在腎癌[2]、結(jié)直腸癌[3]、肺癌[4]、宮頸癌[5]、乳腺癌[6]中都呈低表達(dá)，而在部分骨肉瘤[7]、前列腺癌[8]、胰腺癌[9]中卻高表達(dá)，在甲狀腺乳頭狀癌中的作用報(bào)道較少。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法和蛋白印跡法（Western blot）檢測CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，為甲狀腺乳頭狀癌的臨床診斷及治療提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料

選取2003年2月-2004年10月于唐山市工人醫(yī)院行甲狀腺切除的甲狀腺乳頭狀癌組織120例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40例，正常甲狀腺組織40例。甲狀腺乳頭狀癌患者中，女性68例，男性52例；<45歲56例，≥45歲64例；有包膜浸潤的65例，無包膜浸潤的55例；有轉(zhuǎn)移者70例，無轉(zhuǎn)移者50例；分化程度：低分化64例，高、中分化36例；按照2002年UICC（國際抗癌聯(lián)盟）的TNM進(jìn)行分期：Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期55例。所有標(biāo)本的收集均征得患者及家屬的同意，部分組織置于液氮中保存，用于Western blot檢測，部分組織置于10%甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學(xué)法檢測。全部標(biāo)本均行常規(guī)HE染色，明確病理診斷，病歷資料具有可比性。所有患者術(shù)前均無放療或者化療史。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑

免疫組織化學(xué)及Western blot試劑，兔抗人CXCL14多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.3.1免疫組織化學(xué)組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水處理后，進(jìn)行0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液及微波抗原修復(fù)。室溫下濕盒中封閉20 min，滴加CXCL14兔抗人多克隆抗體（1∶100），置濕盒中4℃冰箱中過夜。第2天滴加二抗，然后置濕盒內(nèi)孵育10 min，孵育完畢后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，再進(jìn)行蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，最后進(jìn)行封片。結(jié)果判定：以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率相乘得出的飽和指數(shù)（saturation index，SI）進(jìn)行評(píng)估。染色強(qiáng)度：無陽性染色（0分），弱染（1分），中染（2分）,強(qiáng)染（3分）。染色區(qū)域如下：腫瘤細(xì)胞<25%（1分），25%～50%（2分），51%～75%（3分），>75%（4分）。該因子的表達(dá)水平由SI指數(shù)決定，SI指數(shù)≥4為腫瘤因子陽性表達(dá)，SI指數(shù)≤3為腫瘤因子陰性表達(dá)。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照組。

1.3.2Western blot方法取新鮮標(biāo)本約100 mg，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒定量。取50μg蛋白上樣到配置好的SDS-PAGE凝膠，電泳，將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），用5%脫脂奶粉封閉1 h，加一抗CXCL14兔抗人多克隆抗體（1∶100），室溫孵育2 h后4℃過夜，0.1% TBST液洗PVDF膜3×5 min，加入對(duì)應(yīng)二抗,室溫孵育1 h洗膜3×5 min，洗膜后加入ECL發(fā)光液，曝光，顯影，定影，對(duì)X光底片拍照保存。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料3組間的比較先用χ2檢驗(yàn)，在χ2檢驗(yàn)有意義的基礎(chǔ)上再行χ2分割法進(jìn)行兩兩比較；多組計(jì)量資料的比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)的方法；生存分析用Kaplan-Meier法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CXCL14陽性表達(dá)的甲狀腺組織呈淺黃色、棕黃色或黃褐色（見圖1）。甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中CXCL14的陽性表達(dá)率分別為20.83%（25/120）、85.00%（34/40）和75.00%（30/40），3組CXCL14陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=56.803，P <0.05）。（見表1）。甲狀腺乳頭狀癌組CXCL14的陽性率明顯低于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組和正常甲狀腺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=53.065和39.019，P<0.01）；結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組與正常甲狀腺組CXCL14的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.250，P >0.01）（見表1）。Western blot結(jié)果顯示（見圖2），CXCL14蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)量為（0.823±0.143），明顯低于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織（1.211±0.012）和正常甲狀腺組織（1.219±0.004），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），而其在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組與正常甲狀腺組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1　免疫組織化學(xué)檢測CXCL14在甲狀腺組織中的表達(dá)（×200）

2.2CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

包膜浸潤中兩組CXCL14陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.709，P<0.01），無包膜浸潤組CXCL14的陽性率明顯高于有包膜浸潤組；淋巴轉(zhuǎn)移中兩組CXCL14陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.315，P<0.01），無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的CXCL14陽性率明顯高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；臨床分期中兩組CXCL14陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.064，P<0.05），Ⅰ、Ⅱ期臨床分期組CXCL14的陽性率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期臨床分期組；分化程度中兩組CXCL14陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.774，P<0.05），高、中分化組CXCL14的陽性率明顯高于低分化組。CXCL14的陽性率與患者的性別、年齡和發(fā)生部位無關(guān)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表1　CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及正常甲狀腺組織中的表達(dá)情況

圖2　Western blot檢測CXCL14蛋白的表達(dá)

2.3CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)分析

對(duì)120例隨訪資料齊全的病例進(jìn)行生存分析，所有病例隨訪截止于2014年5月，隨訪時(shí)間120個(gè)月，繪制生存曲線（見圖3）。CXCL14低表達(dá)組共95例，其中36例存活、59例死亡，其生存率為37.89%；CXCL14高表達(dá)組共25例，其中20例存活、5例死亡，其生存率為80%。CXCL14高表達(dá)組病例的生存率明顯高于CXCL14低表達(dá)組（P<0.05）。

表2　CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖3　不同CXCL14表達(dá)的甲狀腺乳頭狀癌患者的生存曲線

3　討論

近年來，甲狀腺癌患病率呈逐漸上升的趨勢[10]，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。越來越多的趨化因子及其受體被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，隨著研究的不斷深入，有些趨化因子已經(jīng)成為抗癌的治療靶點(diǎn)。而CXCL14作為CXC趨化因子家族成員之一，其在甲狀腺乳頭狀癌中的作用目前仍未明確。CXCL14最初是由Hromas等[11]于1999年從人類乳腺和腎臟組織中分離出來的，屬于腫瘤抑制基因。已有研究證實(shí)，它可以趨化單核細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞[12]。CXCL14參與調(diào)控體內(nèi)許多生物學(xué)功能，如腫瘤相關(guān)血管的形成、炎癥免疫反應(yīng)、宿主對(duì)腫瘤特異性免疫的激活以及腫瘤的自分泌調(diào)節(jié)等[13]。作為一個(gè)多功能趨化因子的CXCL14與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān)。研究顯示，CXCL14在腎癌、結(jié)直腸癌、肺癌、宮頸癌組織中的表達(dá)減少或者缺失[2-5]。Gu等[6]還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中CXCL14蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有負(fù)相關(guān)性。因此，CXCL14在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移等方面起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究CXCL14在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況，有助于進(jìn)一步全面明確甲狀腺乳頭狀癌的惡性生物學(xué)行為及機(jī)制，為甲狀腺乳頭狀癌患者的早期診斷、合理治療以及預(yù)后判斷找到新的靶點(diǎn)。

本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)及Western blot技術(shù)檢測CXCL14蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織、正常甲狀腺組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，該蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)水平低于正常甲狀腺組織和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫。這表明CXCL14蛋白可能在防止甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生中起到作用。已有研究證實(shí)，CXCL14可以通過抑制微血管系統(tǒng)和血管平滑肌細(xì)胞的趨化來抑制腫瘤血管的形成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的成瘤和轉(zhuǎn)移[14]。

筆者還進(jìn)一步對(duì)CXCL14蛋白的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌各臨床病理指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CXCL14蛋白的陽性表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的包膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期及腫瘤分化有關(guān)。在無包膜浸潤、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期早和分化程度高的甲狀腺乳頭狀癌組織中CXCL14表達(dá)相對(duì)增加。結(jié)果顯示，CXCL14與甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展密切相關(guān)，與甲狀腺乳頭狀癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，可以抑制腫瘤的增殖、浸潤以及轉(zhuǎn)移。已有研究發(fā)現(xiàn)，在CXCL14陰性表達(dá)的人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌系PCI-16中導(dǎo)入CXCL14基因會(huì)導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞向腫瘤內(nèi)部浸潤的能力增強(qiáng)，抗腫瘤的免疫反應(yīng)也隨之增強(qiáng)[15]。因此，可以認(rèn)為，CXCL14可能是通過啟動(dòng)腫瘤免疫反應(yīng)來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤。生存分析結(jié)果顯示，CXCL14低表達(dá)組的甲狀腺乳頭狀癌患者的生存率明顯低于CXCL14高表達(dá)組，表明CXCL14低表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者的預(yù)后差有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，CXCL14可能是預(yù)測甲狀腺乳頭狀癌惡性生物學(xué)行為的新標(biāo)志，同時(shí)其基因也是抗腫瘤靶向治療的一個(gè)新的突破點(diǎn)。檢測腫瘤組織中CXCL14的表達(dá)水平對(duì)患者的早期診斷、合理治療以及預(yù)后判斷有一定的幫助。

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（張蕾編輯）

論著

Expression and significance of CXCL14 protein in papillary thyroid carcinoma

Jing Xu
(Department of Endocrinology, the Workers Hospital of Tangshan, Tangshan, Hebei 063000, China)

Abstract:Objective To analyze the expression of chemokine CXCL14 in papillary thyroid carcinoma and its correlation with clinicopathologic parameters. Methods Immunohistochemistry and Western blot were used to assess the expression of CXCL14 protein in 120 cases of papillary thyroid carcinoma, 40 cases of nodular goiter and 40 cases of normal tissues, and its association with clinicopathologic parameters was analyzed. Results Immunohistochemistry showed that the expression of CXCL14 was positive in 20.83% of papillary thyroid carcinoma tissue, which was significantly higher than that in nodular goiter (85.00%) and nomal tissue (75.00%) (P < 0.05 ). Western blot showed that the relative amount of CXCL14 protein in papillary thyroid carcinoma tissue was (0.823±0.143) significantly higher than in nodular goiter (1.211±0.012) and normal tissues (1.219±0.004) (P < 0.05). The expression of CXCL14 was correlated with envelope invasion, lymph node metastasis, clinical stage and differentiation (P< 0.05). The survival rate of patients with thyroid papillary carcinoma in high expression of CXCL14 was significantly higher than the low expression of CXCL14 (P < 0.05 ). Conclusions The expression of CXCL14 may be a marker for adjudging the malignancy and prognosis of papillary thyroid carcinoma.

Keywords:papillary thyroid carcinoma; CXCL14; immunohistochemistry; Western blot

收稿日期：2015-11-25

文章編號(hào)：1005-8982（2016）08-0060-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.013

中圖分類號(hào)：R736.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A