陳東輝，丘余良

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腎病科，福建 福州 350004）

臨床論著

同位素標(biāo)記定量技術(shù)評估腎病綜合征尿液蛋白質(zhì)譜變化的初步探討*

陳東輝，丘余良

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腎病科，福建 福州 350004）

目的旨在通過同位素標(biāo)記相對和絕對定量（iTRAQ）技術(shù)分析原發(fā)性腎病綜合征（PNS）患者尿液差異表達(dá)蛋白,尋找高特異性、無創(chuàng)性評估PNS的病理損害標(biāo)記蛋白，并結(jié)合相應(yīng)蛋白功能探討其在PNS發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展中的作用。方法9例PNS患者腎穿刺當(dāng)日和3例健康人的晨尿標(biāo)本經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜儀分離后，Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，Maxquant 1.4.1.2和persus 1.4.1.3軟件進(jìn)行查庫鑒定、定量和數(shù)據(jù)分析。結(jié)果成功得到PNS尿液蛋白SDS-PAGE電泳圖譜，并得到724個(gè)蛋白質(zhì)組，其中≥2的唯一肽段308個(gè)，定量、查庫鑒定和數(shù)據(jù)分析最終得到差異蛋白表達(dá)明顯的19個(gè)。其中與3例健康對照患者差異表達(dá)的蛋白3個(gè)，包括抗胰蛋白酶（AAT）、抗胰凝乳蛋白酶（AACT）和微管蛋白酪氨酸連接酶類似物7。結(jié)論iTRAQ技術(shù)評估PNS尿液蛋白質(zhì)組變化具有現(xiàn)實(shí)可行性，可以用于更深入的研究。

原發(fā)性腎病綜合征；同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)；尿液蛋白質(zhì)組學(xué)

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）是腎內(nèi)科常見的臨床綜合征，占原發(fā)性腎小球疾病18%～21%。目前，評估PNS的病理損害程度主要依靠腎穿刺病理組織活檢，但它僅僅是反映腎臟當(dāng)時(shí)的病理損害程度，其有創(chuàng)性使得重復(fù)性檢查受到很大的限制，也無法動態(tài)觀測腎組織病理損害。近10余年來，隨著尿液蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其逐漸成為臨床上找尋疾病相關(guān)標(biāo)志物的有效方法[1-2]。本研究旨在通過同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)分析9例PNS患者腎穿當(dāng)日和3例健康人的晨尿標(biāo)本尋找尿液中差異表達(dá)蛋白，同時(shí)結(jié)合相應(yīng)蛋白功能探討其可能在PNS發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象全部尿液標(biāo)本來自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院腎內(nèi)科住院患者。其中9例均行腎臟穿刺病理組織活檢確診為PNS（腎小管間質(zhì)纖維化輕型者3例、中型3例、重型3例）。健康人及腎小管間質(zhì)纖維化輕型、中型、重型尿4組樣本分別命名為A、B、C、D，體積（ml）均為100×3。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑質(zhì)譜儀1、2（Thermo，USA），色譜1（Thermo Scientific EASY Column，USA），色譜2（GE Healthcare AKTA，USA），超聲波系統(tǒng)（Biosafer 150-96，賽飛中國有限公司），真空離心濃縮儀（Eppendorf Concentrater Plus，德國），離心機(jī)（Eppendorf Centrisfuge 5424R，中國），恒溫混勻儀（Eppendorf Thermomixer C，中國），紫外/可見光分光光度計(jì)（Eppendorf Bio Spectrometer，德國），小膠電泳系統(tǒng)（Biorad Mini-PROTEAN Tetr，USA），SDS、Tris、DTT、IAA和Urea（BioRad，USA），0.22μm超濾管（Corning Spin-X，USA），10kDa超濾管（Sartorius VIVACON 500，USA），iTRAQ標(biāo)記試劑-8 PCex（ABsciex，USA）。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本采集腎穿刺前當(dāng)日患者的清晨中段尿樣本100 ml置于100 ml試管中，放置于-80℃冰箱冷凍保存，立刻送檢。另外，取3例健康人清晨中段尿按上述方法送檢。所有樣本都在無菌操作下完成，均為非污染樣本。

1.2.2 樣本制備及蛋白質(zhì)譜鑒定①樣本制備。從-80℃冰箱中拿出24份樣本，室溫下凍融后，取每組樣本的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本各5 ml，將其合并成1個(gè)15 ml的總樣本。待全部樣本合并完成后，剩余樣本保存。合并好的4組樣本在4℃離心機(jī)中離心10 min（1 200 r/min），吸取上清液置于新50 ml預(yù)冷離心管中，迅速加入20 ml（-20℃預(yù)冷）10%TCA/丙酮，混勻后在-20℃冰箱中放置2 h，4℃離心30 min（10300r/min），棄上清液。在樣本沉淀中加入20 ml（-20℃預(yù)冷）丙酮，混勻后在-20℃冰箱中放置1 h，4℃再次離心30 min（10 300 r/min），棄上清液，再重復(fù)該步驟1次。取最終4組樣本凍干。向各組樣本中加入1 ml SDT（4%SDS，pH 8.0 100 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，100 mmol/L DTT）裂解液，充分混勻，100℃加熱5min，冰浴超聲處理后再加熱5min，20℃、11000r/min離心40min，將上清液過0.22μmol/L濾膜，取濾膜下清液為樣本蛋白質(zhì)裂解液。BCA法對蛋白質(zhì)定量，樣本先分裝20μg各1份，剩下的分裝成300μg，均置于-80℃冰箱冷凍保存。②酶解。取出所有樣品的300μg組分。每份加入200μl UA緩沖液（8 mol/L Urea，150 mmol/L三羥甲基氨基甲烷pH 8.5）混勻，14 000 g常溫離心30 min，棄濾液，重復(fù)操作3次。加入100μl吲哚乙酸（50 mmol吲哚乙酸加入U(xiǎn)A緩沖液），600 r/min振蕩混勻1 min，室溫避光300 r/min孵育30 min，再離心30 min。加入U(xiǎn)A緩沖液100μl，室溫離心30 min，重復(fù)3次。加入100μl 1/10溶解緩沖液，室溫離心30 min，重復(fù)3次。棄濾出液并加入40μl胰蛋白酶緩沖液（2μg胰蛋白酶加入40μl 1/10溶解緩沖液），置于恒溫混勻儀上（300 r/min，18 h，37℃）。室溫離心30 min換管收集濾出液，加入25 mmol/L 1/10溶解緩沖液40μl，室溫離心30 min，取濾液，采用OD280肽段定量。③肽段標(biāo)記。從各組樣品中分別取約100μg，按AB公司iTRAQ Reagent-8plex多重試劑盒（AB SCIEX）相關(guān)說明書進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法見表1。

1.2.3 SCX分級將所有標(biāo)記后肽段分別混合，進(jìn)行SCX預(yù)分級。層析柱：聚砜膜4.6×100 mm層析柱（5μmol/L，200/A）。緩沖液：緩沖液A為10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，25%CAN；緩沖液B為10 mmol/L 25%CAN pH 3.0，500 mmol/L KCl，25%CAN。SCX分級見表2。每次SCX分級完成后，收集穿流及洗脫片段約30份，按照SCX色譜圖合并成6份，凍干后C18柱樣（Sigma）脫鹽。

表1 AB公司iTRAQ Reagent-8plex肽段標(biāo)記

表2 SCX分級

1.2.4質(zhì)譜①毛細(xì)管高效液相色譜儀（HPLC）。每份分級后的樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。色譜柱以95%的A緩沖液（0.1%甲酸水溶液）平衡。樣品上樣到上樣柱（2 cm×100μmol/L 5μmol/L-C18），再經(jīng)分析柱（75μmol/L×100 mm 3μmol/L-C18）分離（流速為250 nl/min）。相關(guān)液相梯度為0～105 min，B緩沖液（0.1%甲酸乙腈水溶液）線性梯度從0%～50%；105～110 min，B液線性梯度從50%～100%；110～120 min，B液維持在100%。②質(zhì)譜鑒定。每份分級后的樣品經(jīng)HPLC分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長：120 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1 800 m/z，一級質(zhì)譜分辨率：70 000atm/z 200，AGC目標(biāo)：3 e6，一級最大IT值：10 ms，掃描范圍數(shù)：1，動態(tài)排異：40.0 s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比采用每次全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜（MS2 scan），MS2激活類型：HCD，電荷窗：2 m/z，二級質(zhì)譜分辨率：17 500 at m/z 200，Microscans：1，二級最大IT值：60 ms，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量：30 eV，缺損率：0.1%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Maxquant 1.4.1.2和persus 1.4.1.3軟件對質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)進(jìn)行查庫鑒定、定量和數(shù)據(jù)分析。

1.3.2 數(shù)據(jù)庫使用NCBI_Human_879034_201412 25數(shù)據(jù)庫（蛋白質(zhì)序列共141 033條）。

1.3.3 Maxquant搜索Maxquant軟件版本為1.4.1.2。相關(guān)參數(shù)見表3。

表3 Maxquant軟件相關(guān)參數(shù)

1.3.4 定量分析軟件提取肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值的信息，肽段定量為參考樣品所在標(biāo)簽的信號強(qiáng)度值。蛋白質(zhì)定量為鑒定肽段定量結(jié)果的中位數(shù)。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)總共分4組，分別對A、B、C、D 4組資料進(jìn)行t檢驗(yàn)和倍數(shù)分析，并對其做兩兩比較，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，倍數(shù)取1.5倍或1.2倍，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電泳圖譜

采用SDS-PAGE電泳技術(shù)成功獲得較為滿意的電泳圖譜，根據(jù)Marker值，樣品中最粗的條帶50～75 kD。見圖1。

圖1 SDS-PAGE電泳圖譜

2.2 SCX分級

成功獲得SCX分級，其中UV214吸收值最明顯的管號為6、7，約550 mAU，見圖2。

圖2 SCX分級

2.3蛋白質(zhì)定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

SCX分級脫鹽后的6個(gè)fraction經(jīng)質(zhì)譜分析及查庫，結(jié)果合并后按照Protein FDR≤0.01，PSM FDR≤0.01篩選過濾。最終鑒定肽段2631個(gè)，唯一肽段2021個(gè)，蛋白質(zhì)組724個(gè)，蛋白質(zhì)組（唯一肽段≥2） 308個(gè)。

2.4 蛋白質(zhì)顯著性分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共分4組，鑒定出19個(gè)相關(guān)差異蛋白。其中標(biāo)記的抗胰蛋白酶（alpha1-antitrypsin，AAT）、微管蛋白酪氨酸連接酶類似物7（Tubulin tyrosine ligase like 7，TTLL7）中健康人（N）與原發(fā)性腎病綜合征腎小管間質(zhì)纖維化輕型（L）、中型（M）、重型（H）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 健康人與原發(fā)性腎病綜合征腎小管間質(zhì)不同程度纖維化蛋白質(zhì)表達(dá)情況比較

3 討論

基于以上相關(guān)研究結(jié)果，筆者成功得到比較清晰的PNS尿液蛋白SDS-PAGE電泳圖譜，并得到PNS相關(guān)差異表達(dá)蛋白。其中與3例健康人差異表達(dá)的蛋白AAT、抗胰凝乳蛋白酶（Antichymotrypsin，ACT）、TTLL7已經(jīng)有相關(guān)的研究，其導(dǎo)致腎臟損害的機(jī)制可能與腎小管間質(zhì)病變、氧化應(yīng)激和免疫炎癥等有關(guān)。

AAT是一種急性時(shí)相炎癥反應(yīng)蛋白，研究表明該蛋白是血漿中最主要的蛋白酶抑制劑，主要由肝細(xì)胞分泌；此外，腎、脾等也能產(chǎn)生AAT。研究表明，AAT能夠抑制血清中的各種酶，此外還有抗炎、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡、調(diào)節(jié)免疫等功能。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，在腎小管損傷后，腎小管上皮細(xì)胞反應(yīng)性地表達(dá)AAT[3-5]。HIDVEGI等[6]研究表明，AAT能夠活化核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB），NF-κB在腎臟纖維化的形成過程中有重要作用，當(dāng)炎癥因子及腎臟損傷導(dǎo)致體內(nèi)外腎小管上皮細(xì)胞的NF-κB因子活化，調(diào)節(jié)多種促炎因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終促使腎組織細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積和降解失衡，從而導(dǎo)致腎臟纖維化的發(fā)生。本研究中健康人尿液中未見AAT的表達(dá)，且與其他幾組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，據(jù)此推測尿液中檢測出AAT提示存在腎小管上皮細(xì)胞損傷。

ACT是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員之一，也是一種急性期反應(yīng)蛋白，研究表明具有促進(jìn)淀粉樣蛋白聚合成蛋白絲，同時(shí)幫助蛋白絲抵抗水解消化，還具有調(diào)節(jié)炎癥過程以及可作為非特異性腫瘤標(biāo)志物[7]。目前研究還發(fā)現(xiàn)，ACT在免疫調(diào)控方面有一定作用，它能抑制體內(nèi)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，阻止血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化成血管緊張素Ⅱ。且有文獻(xiàn)報(bào)道其功能狀態(tài)與NF-κB存在關(guān)聯(lián)[8]。有學(xué)者提出IgA腎病發(fā)病機(jī)制可能與患者上呼吸道感染后，腎小球基底膜出現(xiàn)原位或者循環(huán)免疫復(fù)合物沉積，致使機(jī)體啟動免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腎小球免疫損傷，ACT大量合成和釋放有關(guān)[9]。此外，一項(xiàng)有關(guān)早期IgA腎病和薄基底膜腎病的尿液蛋白質(zhì)譜分析也有ACT表達(dá)[10]。因此，筆者推斷ACT在腎臟損害過程中有重要作用，但其在PNS的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本研究的TTLL7結(jié)果表明，硝基化酪氨酸可以通過微管蛋白酪氨酸連接酶整合成為微管蛋白，形成硝基化酪氨酸微管蛋白，能顯著地改變微管的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞的變形、黏附能力的下降和胞內(nèi)運(yùn)輸障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和器官功能喪失[11]。而TTLL可以抑制硝基化酪氨酸微管蛋白的生成過程。目前，罕見有關(guān)TTLL7在腎臟病發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究，其在PNS發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展中所起的作用尚需進(jìn)一步深入研究。

iTRAQ技術(shù)已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)的定量研究中得到較為廣泛的應(yīng)用，具有高度準(zhǔn)確性和敏感性。但iTRAQ試劑幾乎與樣本中的所有蛋白結(jié)合，容易受樣本中的雜質(zhì)蛋白和樣本處理過程中緩沖液的污染，需要對樣本進(jìn)行預(yù)處理并盡量減少操作過程中的污染。因此，本研究的實(shí)驗(yàn)樣本在無菌條件下進(jìn)行，同時(shí)，在樣品處理過程中使用Aurum Serum Protein Mini Kit去除白蛋白，一定程度上提高SDS-PAGE圖像分辨率，但是基于PNS白蛋白在尿液中相對含量高，且個(gè)體差異大，可能超過蛋白吸附柱的最大負(fù)荷，導(dǎo)致尿樣中少量白蛋白的殘余，可能導(dǎo)致無法呈現(xiàn)出所有的差異蛋白。

筆者通過iTRAQ等相關(guān)技術(shù)成功獲得PNS的尿液蛋白質(zhì)譜，同時(shí)標(biāo)記出相關(guān)差異表達(dá)蛋白，基于原發(fā)性腎病綜合征與正常人的尿液蛋白質(zhì)譜的對照而言，對以上3種差異表達(dá)蛋白的研究有望成為評估PNS的新的蛋白標(biāo)志物。然而，該蛋白在疾病進(jìn)展中的敏感性和特異性還需要在更大樣本量、更多其他腎臟疾病患者中驗(yàn)證，這將會是筆者下一步研究的重點(diǎn)。

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（申海菊 編輯）

Preliminary study on change of urine protein spectrum in nephrotic syndrome patients by isotope labeling quantitative technique*

Dong-hui Chen,Yu-liang Qiu
(Department of Nephrology,the People's Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian,350004,China)

Objective To use isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)analysis of different urinary protein expression in patients with primary nephrotic syndrome(PNS),look for noninvasive and highly-specific marker proteins that are able to evaluate the pathological damages in those patients,and to explore their possible roles in the pathogenesis and disease progression of PNS.Methods Nine patients with PNS and 3 healthy adults were selected in this study.Morning urine samples of the 3 healthy adults and urine samples of the 9 PNS patients obtained on the day of renal biopsy were analyzed with iTRAQ technique and capillary high performance liquid phase chromatography with Q-Exactive mass spectrometer(thermo Finnigan),then the data were identified,quantified and analyzed using the software Maxquant 1.4.1.2 and persus 1.4.1.3.Results The urine protein SDS-PAGE electrophoresis map of the PNS patients was successfully obtained.Among the 724 proteins(groups)obtained,308 were the unique peptides≥2.The obtained data were identified,quantified and analyzed by the software Maxquant 1.4.1.2 and persus 1.4.1.3.As a result,19 differentially-expressed proteins were obtained.Among which there were 3 proteins differently expressed from those of the 3 healthy controls,which were alpha 1-antitrypsin,antichymotrypsin and tubulin tyrosine ligase analogues 7.Conclusions iTRAQ technique is feasible for evaluation of urine proteome in patients with pri－mary nephrotic syndrome(PNS).Using this method,the variety of differential expression of urine protein can be found,thus the data could be used for further research.

primary nephrotic syndrome;isobaric tags for relative and absolute quantitation;urine proteomics

R692

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.013

1005-8982（2016）23-0063-05

2016-05-23

國家中醫(yī)臨床研究基地業(yè)務(wù)建設(shè)科研專項(xiàng)課題（No：JDZX2012017）；福建省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（No：wzsb201305）

丘余良，E-mail：748778837@qq.com；Tel：0591-86255607