徐靜，劉濟寧，汪貞，石利利，張圣新，王蕾,*

1. 南京信息工程大學環(huán)境科學與工程學院，南京 210044 2. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042

隨著國內(nèi)外對雙酚A(BPA)在嬰兒奶瓶以及與食品有關的包裝、容器中的禁用，雙酚AP([4,4'-(1-phenylethylidene)bisphenol]，BPAP)作為塑化劑的替代物被越來越多地使用在食品包裝材料、醫(yī)療設備等塑料制品中[1-2]。研究證實，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物能夠干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)，對生物個體及其后代造成危害[3]。作為內(nèi)分泌干擾物雙酚A的類似物BPAP在內(nèi)分泌干擾性方面的潛在風險卻未能受到重視。Coleman等[4]已經(jīng)利用離體測試技術(shù)證明BPAP可以與雌激素受體結(jié)合，產(chǎn)生類雌激素效應。然而BPAP對環(huán)境生物的內(nèi)分泌干擾毒性至今仍未得到確認。

搖蚊(Chironomus)屬于具有完全變態(tài)發(fā)育過程的水生昆蟲，其生活史以卵、幼蟲、蛹和成蟲不同形態(tài)生活在水-沉積物系統(tǒng)的不同部分[5]，由于其易于實驗室馴養(yǎng)，生命周期短，對環(huán)境因子敏感，使得它們成為生態(tài)毒理學研究中進行生物監(jiān)測和進行風險評估的理想受試生物[6]。搖蚊慢性毒性測試方法是OECD內(nèi)分泌干擾性測試框架中第五層級的方法之一，可用于內(nèi)分泌干擾物的危害確認[7]。OECD針對搖蚊這一生物特性分別建立了水體添加和沉積物添加的慢性毒性試驗方法[8]。我國目前也將這2種測試方法同化為化學品危害評估方法[9]，但并未就2種方法的區(qū)別和適用性做深入研究和說明。

由于搖蚊生活史的大部分時間是以幼蟲的形態(tài)生活在沉積物中[10]，這可能導致長時間存留在沉積物中的外源性化學物質(zhì)更易對搖蚊產(chǎn)生毒性影響。因此水體添加法和沉積物添加法可能引起搖蚊全生命周期繁殖發(fā)育毒性測試結(jié)果的差異，特別是對于高吸附性和高脂溶性的外源性化學物質(zhì)。所以有必要針對搖蚊慢性毒性測試的水體添加法和沉積物添加法開展對比研究，探討不同添加法測試結(jié)果在化學品危害評估中的適用性。

本文選擇吸附性較強(logKoc=5.93[11])、具有內(nèi)分泌干擾性潛力的BPAP為研究對象，采用水體加標法和沉積物加標法，分別研究了BPAP對搖蚊羽化率、發(fā)育率、繁殖率、雌雄比等內(nèi)分泌干擾性指標的影響，對比不同添加法對搖蚊毒性效應的差異并分析其原因，為水體加標和沉積物加標的搖蚊慢性毒性測試技術(shù)在我國的準確應用提供參考，為BPAP的生態(tài)風險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試生物

伸展搖蚊(Chironomustentans)取自上?；ぱ芯吭?，經(jīng)本實驗室馴養(yǎng)半年后用于試驗。馴養(yǎng)條件：溫度(23±1) ℃；晝夜比L:D=16 h : 8 h；光照強度為500～1 000 lux；溫和曝氣；濕度80%；每日喂食粉碎的魚食懸液。

1.2 受試品

雙酚AP，常用縮寫 BPAP，CAS No: 2167-51-3，分析純，有效成分為BPAP，含量>98.0%，購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 水體加標全生命周期實驗

以人工配制的水-沉積物系統(tǒng)為試驗介質(zhì)。根據(jù)急性毒性實驗結(jié)果，水體加標法設置空白對照組和60、120、230、450和900 μg·L-1處理組，曝氣Elendt M7培養(yǎng)液稀釋貯備液并揮干有機溶劑得到受試溶液。每個濃度4個平行，每個平行中加入20只一齡期幼蟲。參考OECD化學品測試導則[12]的要求進行試驗，實驗條件與飼養(yǎng)條件一致。實驗進行兩代，每代25 d。每日喂食磨碎的魚食。10 d后用紗網(wǎng)罩住試驗燒杯，每日觀察其羽化數(shù)，發(fā)現(xiàn)有成蟲羽化立即將其收集至孵育缸(內(nèi)含300 mL Elendt M7培養(yǎng)液)內(nèi)。記錄成蟲產(chǎn)卵數(shù)并將其取出置于六孔板內(nèi)，待蟲卵孵化為子代一齡幼蟲后將其放入新的已經(jīng)平衡的水-沉積物系統(tǒng)，開始子代毒性暴露試驗。

1.4 沉積物加標全生命周期試驗

沉積物加標法設置空白組、400、800、1 600、3 200和6 400 μg·kg-1處理組。試驗參考OECD化學品測試導則[13]進行，取適量貯備液分別與10 g精細石英砂混勻，常溫下在通風櫥放置30 min，使有機溶劑完全揮發(fā)，然后與390 g沉積物混勻，再平均分裝于4個500 mL燒杯中，最后輕輕加入350 mL曝氣Elendt M7培養(yǎng)液。48 h后加入親代一齡期幼蟲，待幼蟲鉆入沉積物后，開始曝氣。試驗過程與水體加標法一致。待子代幼蟲孵化，將其加入新的已經(jīng)平衡的沉積物加標的水-沉積物系統(tǒng)。

從第10天起每天記錄水體加標法和沉積物加標法中親代和子代的羽化數(shù)、羽化時間、雌雄性數(shù)量，親代雌性產(chǎn)卵數(shù)，計算親代和子代羽化率、發(fā)育率、性別比、親代繁殖力。

1.5 水-沉積物體系中BPAP濃度分析

在水體加標法和沉積物加標法試驗過程中額外各設置3組不加搖蚊幼蟲的空白和處理組，分別在親代搖蚊試驗的第0、5、10、15、20、25 天各取水樣5.0 mL、沉積物2.0 g分析BPAP的濃度。

水樣的前處理方法： 6 000 r·min-1離心10 min，取上清液用甲醇與上清液(V:V=1:1)萃取后過0.45 μm濾膜進樣分析。沉積物樣的處理方法：常溫揮發(fā)干水分后稱取1.0 g干沉積物加20.0 mL乙酸乙酯并萃取，上清液過濾膜后旋蒸干，用甲醇洗滌、定量后進樣分析。液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜分析條件：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-Agilent Technologies 1290 Infinity, MS-AB SCIEX QTRAP 4500, 美國AB公司)；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm)；流動相為甲醇:水=55:45(V:V)，柱溫40 ℃，流速0.5 mL·min-1，進樣體積5 μL，保留時間為8.9 min。質(zhì)譜條件為電噴霧(ESI)離子源、負電離模式、多反應離子監(jiān)測(MRM)掃描定量分析BPAP。氣簾氣(CUR)壓力30 psi，噴霧氣(GS1)壓力35 psi，輔助加熱氣(GS2)壓力40 psi，源溫度(TEM)400 ℃，離子化電壓(IS) 5 500 V，碰撞能量(CE)-32.73 eV，去簇電壓(DP)-87.69 V，入口電壓(EP)-10 V，出口電壓(CXP)-10.92 V，母離子質(zhì)荷比m/z(Q1)288.7，子離子質(zhì)荷比m/z(Q3)210.7。

本方法水樣檢出限為2.4×10-4μg·L-1，沉積物檢出限為1.2×10-2μg·kg-1，水樣定量限為8×10-5μg·L-1，沉積物定量限為4×10-3μg·kg-1。

1.6 數(shù)據(jù)分析

水體加標和沉積物加標全生命周期試驗中羽化率、發(fā)育率、性別比和繁殖力統(tǒng)計方法參考OECD 化學品測試導則No. 233[8]采用Dunnett’s tests(ANOVA，SPSS 19.0)多元對比處理組與空白組的慢性毒性終點，進而確定最低效應濃度(*P<0.05)和無觀察效應濃度(NOEC)。鑒于BPAP實測濃度在試驗周期內(nèi)變化較大，水-沉積物系統(tǒng)中BPAP實測濃度以不同時間點實測濃度的加權(quán)平均值表示，計算方法參考OECD 化學品測試導則No. 211[14]。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 羽化率

BPAP在水體加標法試驗中對搖蚊親代、子代羽化率影響見圖1。其中，搖蚊對照組(CK)親代和子代的總羽化率均超過80%，BPAP處理組親代和子代的羽化率與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。親代60～900 μg·L-1處理組的總羽化率達58.8%～81.25%，其中雄性羽化率為32.5%～43.75%，雌性羽化率為26.3%～41.5%；子代60～900 μg·L-1處理組的總羽化率達55.8%～81.25%，其中雄性羽化率為25.0%～43.75%，雌性羽化率為27.5%～40.0%。

圖1 BPAP對搖蚊兩代羽化率的影響(水體加標法)注：CK，空白組；平均值±標準差(n=4)。Fig. 1 Emergence ratio of Chironomus tentans after exposure to BPAP over two generations (water-spiked method)Note: P generation, Parent generation; F1 generation, The first filial generation; CK, control group; Mean±standard deviation (n=4).

圖2 BPAP對搖蚊兩代羽化率的影響(沉積物加標法)注：*表示處理組與對照組存在顯著差異 P<0.05。Fig. 2 Emergence ratio of Chironomus tentans after exposure to BPAP over two generations (Sediment-spiked method)Note: Significant differences from the corresponding control group, * P<0.05.

圖3 BPAP對搖蚊兩代發(fā)育速率的影響(水體加標法)Fig. 3 Developmental rate of Chironomus tentans after exposure to BPAP over two generations (Water-spiked method)

沉積物加標法試驗中BPAP對搖蚊親代、子代羽化率的影響見圖2。3 200、6 400 μg·kg-1處理組的親代、子代的總羽化率和雌雄羽化率與空白對照組有顯著差異(P<0.05)。親代搖蚊中，3 200 μg·kg-1及更高濃度處理組總羽化率為30%～35.0%；試驗進行到子代時，總羽化率為27.5%～31.0%。由此可見，水體加標法和沉積物加標法中搖蚊子代羽化率對BPAP的敏感程度與親代相近。

2.2 發(fā)育率

發(fā)育率(單位為d-1)是發(fā)育時間的倒數(shù)，表示平均每天的幼蟲發(fā)育發(fā)生率，發(fā)育時間是指一齡期幼蟲被放入水-沉積物系統(tǒng)之日(實驗第0 天)與實驗群體羽化之日之間的平均時間跨度[8]。水體加標法和沉積物加標法試驗中BPAP對搖蚊親代、子代發(fā)育率的影響見圖3和4。水體加標法試驗中，親代和子代處理組發(fā)育率與對照組均無顯著差異(P>0.05)；沉積物加標法試驗中，3 200 μg·kg-1及更高濃度處理組子代總發(fā)育率和雌性發(fā)育率均顯著低于對照組。因此，沉積物加標法中搖蚊子代發(fā)育率對BPAP的敏感程度高于親代。

2.3 性別比

水體加標法和沉積物加標法的性別比見圖5。2種方法的空白組與處理組兩代雌雄比都保持在1左右，水體加標法中親代60～900 μg·L-1處理組的雌雄比為1.0～1.3，子代為0.8～2.2，子代雌雄比波動相對親代較大；沉積物加標法中400～6 400 μg·kg-1處理組親代雌雄比為0.7～1.3，子代為0.9～1.3。但方差分析結(jié)果表明，水體加標法和沉積物加標法中親代、子代雌雄比均與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 繁殖力

圖6為水體加標法和沉積物加標法試驗的親代產(chǎn)卵率。2種加標法試驗中，對照組產(chǎn)卵率均達到80%以上，處理組的親代產(chǎn)卵率均與對照組無顯著差異。因而本試驗條件下BPAP處理組對搖蚊繁殖力無顯著影響。

2.5 水-沉積物系統(tǒng)中BPAP濃度測定

水體加標法親代搖蚊毒性試驗中，水體濃度和沉積物濃度的變化趨勢見圖7。試驗開展10 d內(nèi)水體濃度快速降低，沉積物中濃度10 d后顯著升高。通過加權(quán)平均計算后，60、120、230、450和900 μg·L-1處理組水中BPAP實測濃度為0.26、2.80、5.63、20.59和110.78 μg·L-1。

沉積物加標法親代搖蚊毒性試驗中，水體濃度和沉積物濃度的變化趨勢見圖8。BPAP加入沉積物后，隨時間推移水體濃度逐漸升高，沉積物中濃度逐漸降低。根據(jù)加權(quán)平均濃度計算結(jié)果，400、800、1 600、3 200和6 400 μg·kg-1處理組沉積物中BPAP的實測濃度為11.43、18.61、38.64、69.13和161.28 μg·kg-1。

圖4 BPAP對搖蚊兩代發(fā)育速率的影響(沉積物加標法)注：表示處理組與對照組存在顯著差異，*P<0.05。Fig. 4 Developmental rate of Chironomus tentans after exposure to BPAP over two generations (Sediment-spiked method)Note: Significant differences from the control group, *P<0.05.

圖5 BPAP 對搖蚊兩代的性別比的影響注：A，水體加標法；B，沉積物加標法。Fig. 5 Sex ratio of Chironomus tentans after exposure to BPAP over two generationsNote: A, water-spiked method; B, sediment-spiked method.

圖6 BPAP對搖蚊親代繁殖力的影響注：A，水體加標法；B，沉積物加標法。Fig. 6 Fecundity of the P generationNote: A, water-spiked method; B, sediment-spiked method.

圖7 水-沉積物系統(tǒng)中BPAP濃度變化趨勢(水體加標法)Fig. 7 The measured concentrations of BPAP in water-sediment system (water-spiked method)

圖8 水-沉積物系統(tǒng)中BPAP濃度變化趨勢(沉積物加標法)Fig. 8 The measured concentration of BPAP in water-sediment system (sediment-spiked method)

對比不同添加方法得到的沉積物中BPAP實測濃度可知，沉積物添加法中BPAP加入系統(tǒng)后的11 d內(nèi)在沉積物中的濃度仍維持初始濃度的50%以上，而水體添加法中BPAP的沉積物濃度在10 d內(nèi)維持較低水平，之后才有所增加。以水體添加法的450 μg·L-1處理組和沉積物添加法的1 600 μg·kg-1處理組的測試結(jié)果為例，試驗0～11 d沉積物中BPAP實測濃度差距較大，分別為98.4～280 μg·kg-1和1 000～1 530 μg·kg-1；而這2個處理組中BPAP的初始添加量非常接近，為157.5 μg 和160 μg。因此，沉積物添加法試驗前半期，BPAP均主要存在于沉積物當中；而水體添加法試驗前半期，沉積物中BPAP含量很低。推測這一方面是由于有機化合物從沉積物相到水相的分配再平衡需要一定時間，另一方面是由于BPAP本身logKoc較高，吸附性較強，較難從沉積物相進入水相。

3 討論(Discussion)

在水體添加法搖蚊全生命周期毒性試驗中，60～900 μg·L-1BPAP處理組對兩代搖蚊的羽化率、發(fā)育率、性別比和繁殖力均無顯著影響；而在沉積物添加法搖蚊全生命周期毒性試驗中，3 200 μg·kg-1及更高濃度處理組顯著降低親代羽化率和子代羽化率、發(fā)育率。綜合各項慢性毒性指標，水體和沉積物添加試驗得到的BPAP對搖蚊兩代發(fā)育、繁殖均無顯著影響的NOEC值分別為≥900 μg·L-1和1 600 μg·kg-1。若以BPAP的初始添加質(zhì)量在水-沉積物整體質(zhì)量的占比計，則水體和沉積物添加法得到的無顯著效應濃度分別為≥0.00070‰和0.00035‰。由此可見，沉積物添加法對搖蚊的毒性效應高于水體添加法。與此同時，本研究對水-沉積物體系中BPAP的濃度分析結(jié)果也印證了BPAP從沉積物中加入系統(tǒng)后的試驗前半期主要存在于沉積物當中。因此，本結(jié)果驗證了本研究的最初假設，即沉積物添加法易使強吸附性的外源性化學物質(zhì)較長時間存留在沉積物中，而這段時間搖蚊恰好以敏感的幼蟲形態(tài)存在于沉積物當中，因此沉積物添加法搖蚊全生命周期試驗易得到比水體添加法更高的毒性。由此證實了實際環(huán)境中的BPAP水體直接暴露和沉積物直接暴露對搖蚊的危害性不盡相等，其風險評估應采用相應的水體或沉積物添加法得到的搖蚊毒性數(shù)據(jù)。在危害評估中，對于類似BPAP具有高吸附性或高脂溶性的化學品而言，搖蚊慢性毒性的水體添加法和沉積物添加法試驗結(jié)果不能做簡單的數(shù)據(jù)單位轉(zhuǎn)換就相互混用。

此外，本研究得到的BPAP影響搖蚊親代發(fā)育的無顯著效應濃度(NOEC≥900 μg·L-1)遠高于BPA對搖蚊的繁殖發(fā)育無顯著效應濃度NOEC=100 μg·L-1[15]，因此BPAP對底棲生物搖蚊的慢性毒性低于BPA，但其對水生態(tài)系統(tǒng)的危害性須綜合其他水生生物的慢性毒性數(shù)據(jù)進行評估。

綜上所述：

1)水體和沉積物添加試驗得到BPAP對搖蚊兩代發(fā)育、繁殖無顯著影響濃度(NOEC)分別為≥900 μg·L-1和1 600 μg·kg-1。這一結(jié)果可以為BPAP的生態(tài)風險評估提供數(shù)據(jù)支持。

2)BPAP沉積物添加法對搖蚊的繁殖發(fā)育毒性效應大于水體添加法。在化學品危害評估中，搖蚊慢性毒性測試方法或數(shù)據(jù)的選擇應考慮實際環(huán)境中該化學品進入水-沉積物系統(tǒng)的方式。

3)BPAP對底棲生物搖蚊的繁殖發(fā)育毒性低于BPA，其對水生態(tài)系統(tǒng)的危害性須綜合其他水生生物的慢性毒性數(shù)據(jù)進一步評估。

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