郭坤元，張欣欣

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所，國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系恩施綜合試驗站，湖北 恩施 445000；2.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心中藥材分中心，湖北 恩施 445000；3.東北林業(yè)大學(xué)，鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040)

核酸酶存在于大多數(shù)生命體內(nèi)，是一種特異性作用于磷酸二酯鍵的酶，它能夠水解核酸鏈，生成低聚核苷酸或者是單核苷酸[1]，它在遺傳物質(zhì)的重組、堿基錯配識別和切割異源DNA等多個途徑中起著重要的作用[2-6]，同時有的核酸酶活性還依賴于鈣離子、鎂離子、錳離子等各種各樣的金屬離子[7]。

核酸酶在細(xì)菌和微生物里面研究的比較早，一些研究發(fā)現(xiàn)，核酸酶可以用于DNA探針進行簡單快速的細(xì)菌檢測，探針熒光信號與革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的數(shù)量相關(guān)，該方法對活菌具有特異性，較短時間即可得到樣本信號[8]；在綠膿桿菌若蟲中的研究發(fā)現(xiàn)，中腸M1區(qū)域的DNA和RNA降解率高于中腸M3區(qū)域，而中腸各區(qū)域成體核酸酶活性均較低，結(jié)果表明，不同的消化道區(qū)域都具有獨特的消化特性[9]；在鏈球菌中的研究發(fā)現(xiàn)，核酸酶Cas9的變異體xCas9具有較高的DNA保真度，這為進一步研究和開發(fā)高保真聚合酶提供了一定的研究基礎(chǔ)[10]；在古細(xì)菌中，一種納米核糖核酸酶Ape0124被發(fā)現(xiàn)和報道，這種核酸酶是一種3′外切酶，特異性降解小于5個核苷酸的納米核糖核酸，生化特征研究表明，在錳離子存在條件下，Ape0124可以從3′端開始降解ssDNA和ssRNA[11]。在昆蟲方面，一些核酸酶也被發(fā)現(xiàn)和報道，比如在非洲象甲蟲的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了一些假定的dsRNA酶，其中有2種dsRNA酶在昆蟲的腸道組織中可以特異表達(dá)，RNAi試驗證明這2 種dsRNA酶影響了dsRNA在象甲蟲腸道中的穩(wěn)定性[12]；在東亞飛蝗中，2種核酸酶LmdsRNase1和LmdsRNase4被發(fā)現(xiàn)，其活性試驗結(jié)果表明，不同生理的pH值可以影響LmdsRNase的酶活性從而改變dsRNA的穩(wěn)定性[13]；有的研究對斜紋夜蛾、東亞飛蝗、美洲大蠊和無斑飛蝗4種昆蟲的dsRNA酶活性進行了研究，結(jié)果表明，在適宜的鎂離子濃度和高溫下，所有昆蟲的dsRNA酶活性在堿性環(huán)境中均表現(xiàn)出較高的活性，同時所有被測昆蟲腸道的dsRNA酶活性都比其他組織高幾百倍，這些結(jié)果有助于更全面地了解dsRNA酶的特性，并有助于在昆蟲中開發(fā)RNAi技術(shù)[14]。一些植物中的核酸酶也被發(fā)現(xiàn)并報道，比如利用基因芯片技術(shù)在水稻中發(fā)現(xiàn)了一種OsNAC4編碼的參與核DNA降解的核酸酶[15-16]；在小麥里發(fā)現(xiàn)了一種可以凋亡細(xì)胞并降解和碎裂細(xì)胞核DNA的核酸酶[17]；在花椰菜中，利用DNA-SDS-PAGE的試驗技術(shù)，通過對花椰菜種子，幼苗和花頭不同部位研究，發(fā)現(xiàn)了5種核酸酶[18]。這些研究進一步表明核酸酶基因在植物應(yīng)對自身細(xì)胞凋亡、遺傳物質(zhì)降解及生長發(fā)育中起著非常重要的作用。

本研究以模式植物擬南芥為研究對象，通過PCR擴增和克隆測序方法克隆擬南芥核酸酶AtCaN2基因全序列，分析其序列特征，構(gòu)建其蛋白表達(dá)載體并進行蛋白誘導(dǎo)純化及活性分析，以期更全面了解AtCaN2基因，為更詳盡探索其參與調(diào)控的分子機制提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(哥倫比亞型)、大腸桿菌 JM109、M15菌株及原核表達(dá)載體pQE-30由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所資源與育種實驗室保存，T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶等購自TaKaRa公司，RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒等購自天根生化科技有限公司，Ni-NTA agarose和尼龍膜等購自生工生物工程股份有限公司，檢測His標(biāo)簽蛋白的一抗和二抗購自碧云天生物技術(shù)研究所，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因序列克隆 取培養(yǎng)14 d大小的擬南芥材料，在液氮下研磨均勻后，按照RNA提取試劑盒說明書的方法進行RNA提取，然后以提取的RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄試驗。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中AtCaN2基因序列(序列號：NC_003071.7)，以擬南芥cDNA為模版，利用上游引物F：5′-ATGGGTAACGCTCTTACGTT-3′，下游引物R：5′-CCCCTATTTCCTTAGTCTAA-3′進行PCR擴增，退火溫度為53 ℃，同時以水為模板作為空白對照。

1.2.2 序列生物信息學(xué)分析 將獲得的AtCaN2氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析，利用DNAMAN等軟件對其與水稻(NP_001042112.1)、玉米(NP_001147648.1)、谷子(XP_004968301.1)、高粱(XP_002457283.1)、二穗短柄草(XP_003569116.1)、絨毛煙草(XP_009587089.1)、亞麻薺(XP_010508866.1)、大豆(NP_001242780.1)、薺菜(XP_006291485.1)等進行同源性分析，并利用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。在線網(wǎng)站包括：預(yù)測相對分子質(zhì)量及等電點(http：//web.expasy.org/protparam/)，疏水性分析(http：//web.expasy.org/protscale/)，利用TMHMM進行跨膜結(jié)構(gòu)域分析(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，信號肽分析(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)，亞細(xì)胞定位分析(http：//psort.hgc.jp/form.html)，利用SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)進行結(jié)構(gòu)域的三維同源建模。

1.2.3 AtCaN2-GFP蛋白的亞細(xì)胞定位 將AtCaN2-GFP瞬時表達(dá)載體利用聚乙二醇誘導(dǎo)法[19]，轉(zhuǎn)化擬南芥葉片細(xì)胞原生質(zhì)體，原生質(zhì)體先在黑暗條件過夜培養(yǎng)，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光信號位置。

1.2.4 pQE-30-AtCaN2融合表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)目的序列利用引物進行擴增，上游引物F：5′-GGTACCATGGGTAACGCTCT-3′，下游引物R：5′-GTCGACCTTTCCTTAGTCTA-3′，退火溫度為55 ℃。將PCR產(chǎn)物用SalⅠ和KpnⅠ與載體pQE-30連接，構(gòu)建pQE-30-AtCaN2表達(dá)載體，然后將構(gòu)建好的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化M15菌株。

1.2.5 pQE-30-AtCaN2點突變載體的構(gòu)建 利用重疊PCR的方法對AtCaN2氨基酸序列保守區(qū)域中的天冬氨酸位點進行點突變擴增。第1對引物的上游引物 F：5′-ATGGGTAACGCTCTTACGTT-3′，下游引物R：5′-ATGGTGTGTCCATGTGCCAC-3′，第2對引物的上游引物F：5′-GTGGCACATGGACACACCAT-3′，下游引物R：5′-CCCCTATTTCCTTAGTCTAA-3′，然后以擴增結(jié)果為模板，利用上一步驟1.2.4的引物進行擴增，后續(xù)載體構(gòu)建同1.2.4步驟。

1.2.6 融合蛋白的誘導(dǎo)、純化及Western Blot分析 小量誘導(dǎo)：挑取含有pQE-30-AtCaN2質(zhì)粒的單克隆于LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，待菌液的OD600達(dá)到對數(shù)中期時開始進行融合蛋白的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間分別為0，15，30，60，120，210 min，誘導(dǎo)結(jié)束后收集每個時間點的大腸桿菌進行SDS-PAGE電泳；大量誘導(dǎo)及純化：根據(jù)小量誘導(dǎo)結(jié)果，利用三角瓶進行大量誘導(dǎo)，然后利用溶菌酶裂解菌液，菌液上清過Ni-NTA 樹脂進行His-AtCaN2融合蛋白的純化，最后進行SDS-PAGE電泳及 Western Blot分析。點突變?nèi)诤系鞍椎恼T導(dǎo)及純化參照大量誘導(dǎo)進行，純化的融合蛋白用His-AtCaN2(M)表示。

1.2.7 融合蛋白酶活性分析 以λDNA為底物，向反應(yīng)緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl pH值 7.0，10 mmol/L CaCl2)中加入1.0 μg His-AtCaN2或者His-AtCaN2(M)融合蛋白和0.5 μg λDNA，37 ℃孵育30 min，同時準(zhǔn)備對照試驗，反應(yīng)緩沖液里面只加入0.5 μg λDNA，37 ℃孵育30 min。孵育結(jié)束后，向反應(yīng)緩沖液里加入金屬螯合劑EDTA使反應(yīng)終止，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外，將λDNA用HindⅢ酶切反應(yīng)后，進行上面相同的試驗，然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列克隆

利用設(shè)計的引物對AtCaN2目的條帶進行擴增，擴增結(jié)果如圖1所示，AtCaN2基因片段的大小約為685 bp，證明擴增結(jié)果正確。

M.DNA Marker；1.空白對照；2，3.目的基因PCR擴增。

2.2 序列生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站(http：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測AtCaN2蛋白的等電點為8.45，化學(xué)式為C1116H1788N310O335S3，共含有3 552個原子數(shù)。蛋白親/疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，約在第40個氨基酸位置，疏水性較大，峰值為1.725，在第180個氨基酸位置，親水性較大，峰值為-2.735，整個分布區(qū)域親水性氨基酸區(qū)域多于疏水性氨基酸區(qū)域，可認(rèn)為AtCaN2為親水性蛋白(圖2-A)。SignalP 4.1 Server分析結(jié)果顯示，C值為0.143，Y值為0.124，S值為0.146，得分較低，表明AtCaN2蛋白酶沒有信號肽(圖2-B)。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，AtCaN2不含跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2-C)。亞細(xì)胞定位分析表明，AtCaN2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的概率為0.45，微體的概率為0.3，線粒體基質(zhì)和溶酶體中的概率為0.1，其他細(xì)胞器的概率較低。在其整個氨基酸序列中，丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)的含量最高，均超過了9%，半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、色氨酸(Trp)的含量較少，不到1%，其中甲硫氨酸(Met)的含量最少，不到0.5%。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示它由2個連在一起的α-螺旋中心組成(圖2-D)。

2.3 氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

本研究將AtCaN2與其他物種中的核酸酶氨基酸序列進行了比對，結(jié)果如圖3所示，AtCaN2與亞麻薺(Camelinasativa)的同源性較高，為87.89%，與谷子(Setariaitalic)、高粱(Sorghumbicolor)和玉米(Zeamays)的同源性較低，分別是56.42%，57.35%和56.47%，且序列中間區(qū)域含有一個高度保守的天冬氨酸D-X-D功能位點序列。

本研究通過BioEdit、Clustal W和Mega 5等生物軟件對AtCaN2和其他物種的核酸酶進行了系統(tǒng)進化樹分析，如圖4所示：可以發(fā)現(xiàn)AtCaN2與亞麻薺的親緣性最近，與谷子、玉米等禾本科植物的親緣性比較遠(yuǎn)，這些結(jié)果也同氨基酸序列比對的結(jié)果表現(xiàn)出一致性。

2.4 AtCaN2-GFP蛋白的亞細(xì)胞定位

將AtCaN2-GFP融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥葉片原生質(zhì)體，在視野下觀察GFP熒光信號情況，如圖5所示，AtCaN2-GFP在整個細(xì)胞質(zhì)均有表達(dá)，亞細(xì)胞定位情況與預(yù)測結(jié)果比較符合。

2.5 融合蛋白的誘導(dǎo)、純化及Western Blot分析

為了檢測融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)情況，本研究首先進行了小量誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)過不同時間誘導(dǎo)之后，用SDS-PAGE凝膠電泳進行檢測，檢測結(jié)果如圖6所示：在IPTG誘導(dǎo)下，融合蛋白開始表達(dá)，并且隨著誘導(dǎo)時間的延長，融合蛋白的表達(dá)量也逐漸增加，同時結(jié)果還發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)120，210 min融合蛋白的表達(dá)量差別不大，這表明pQE-30-AtCaN2載體構(gòu)建成功，可以成功地進行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

圖5 AtCaN2-GFP亞細(xì)胞定位

M.蛋白質(zhì)Marker；1-6.誘導(dǎo)0，15，30，60，120，210 min。

根據(jù)小量誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，本研究對融合蛋白進行大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化，結(jié)果如圖7-A所示：得到了大小約為35 ku的純化的His-AtCaN2融合蛋白(泳道2)，本研究進一步對His-AtCaN2融合蛋白進行了Western Blot分析，如圖7-B所示：檢測到信號(泳道4)，這些結(jié)果說明His-AtCaN2融合蛋白正確翻譯表達(dá)，另外純化出來的蛋白也沒有出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的斷裂或者降解的情況。

A：M.蛋白質(zhì)Marker；1.未誘導(dǎo)的His-AtCaN2蛋白；2.純化的His-AtCaN2蛋白；B：3，4.Western Blot分析。

2.6 點突變?nèi)诤系鞍椎恼T導(dǎo)和純化

本研究對保守區(qū)域天冬氨酸位點突變后的His-AtCaN2融合蛋白進行誘導(dǎo)和純化，結(jié)果如圖8所示：小量誘導(dǎo)和大量誘導(dǎo)均有點突變后的His-AtCaN2(M)融合蛋白表達(dá)，且純化后得到了點突變His-AtCaN2(M)較單一的條帶(箭頭所指位置)。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.未誘導(dǎo)的蛋白；2.His-AtCaN2(M)融合蛋白小量誘導(dǎo)；3.His-AtCaN2(M)融合蛋白大量誘導(dǎo)；4.His-AtCaN2(M)融合蛋白純化。

M.Protein Marker；1.Uninduced protein；2.His-AtCaN2(M)fusion protein small quantity induction； 3.His-AtCaN2(M)fusion protein large quantity induction； 4.His-AtCaN2(M)fusion protein purification.

圖8 點突變?nèi)诤系鞍椎恼T導(dǎo)和純化

Fig.8 Induction and purification of pointmutation fusion protein

2.7 融合蛋白酶活性分析

本研究以λDNA為底物，對核酸酶His-AtCaN2的活性進行檢測，由圖9可以看出，在孵育30 min后，添加His-AtCaN2融合蛋白的泳道，底物λDNA大部分降解，核酸酶表現(xiàn)出較高的活性，而添加His-AtCaN2(M)融合蛋白的泳道，底物λDNA基本上未降解，核酸酶表現(xiàn)出沒有活性(圖9-A)；同樣以HindⅢ酶切后的λDNA為底物時，添加His-AtCaN2融合蛋白的泳道，底物大部分降解，核酸酶同樣表現(xiàn)出較高的活性，而添加His-AtCaN2(M)融合蛋白的泳道，底物λDNA基本上未降解(圖9-B)。

A.底物λDNA；B.HindⅢ酶切反應(yīng)后的λDNA為底物。

3 討論

核酸酶存在于大多數(shù)生命體內(nèi)，它在遺傳物質(zhì)修飾、堿基識別和異源DNA降解等生命過程中起著非常重要的作用[1-6]，同時一些核酸酶還依靠外源二價金屬離子來表現(xiàn)它們的酶活性[7，11，14]。本研究從擬南芥中克隆了一種核酸酶AtCaN2，序列比對結(jié)果表明，它與亞麻薺的同源性較高，為87.89%，與谷子、高粱和玉米的同源性較低，分別是56.42%，57.35%和56.47%，且序列中間區(qū)域含有一個高度保守的天冬氨酸D-X-D功能位點序列；預(yù)測AtCaN2的等電點為8.45，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，不含信號肽，是一個親水性蛋白；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)顯示它是由2個連在一起的α-螺旋中心組成；進化樹分析表明，AtCaN2與亞麻薺的親緣性最近，與谷子、玉米等禾本科植物的親緣性比較遠(yuǎn)；亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，其定位于細(xì)胞質(zhì)，與預(yù)測結(jié)果相符合；蛋白誘導(dǎo)和純化得到大小約為35 ku的His-AtCaN2融合蛋白，Western Blot分析表明融合蛋白正確翻譯表達(dá)，且沒有出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的斷裂或者降解的情況；酶活性分析表明，AtCaN2同一些報道一樣，對核酸底物具有降解作用[11，15，17，20]，且保守的天冬氨酸D-X-D序列是重要的功能位點?？傊?，AtCaN2在植物中具有重要的功能和調(diào)控作用，本研究結(jié)果為下一步在植物體內(nèi)研究該基因的相關(guān)機理作用提供了基礎(chǔ)。