歐陽清，康海仙，姚運(yùn)紅，何平，陳新，曾尚明，梁艷芳

1.廣東東莞市東城醫(yī)院病理科,廣東 東莞 523000；2.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院生物技術(shù)系,廣東 東莞 523808；3.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 東莞 523808；4.廣東東莞市東城醫(yī)院普外科,廣東 東莞 523000；5.廣東東莞市濱海灣中心醫(yī)院病理科，廣東 東莞 523905

結(jié)直腸癌是人類常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤死因順位排名中居于第三位[1]，結(jié)直腸癌的高危因素包括：吸煙、酒精、紅肉及加工肉的攝入、家族史等[2]，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前普遍認(rèn)為結(jié)直腸癌發(fā)生過程是一個(gè)多基因變異、多階段、多步驟的過程，是癌基因突變激活或抑癌基因失活，逐漸改變基因的結(jié)果[3]，因此研究癌基因的激活及抑癌基因的失活具有重要意義。分化相關(guān)基因NDRG1在多種惡性腫瘤中具有促進(jìn)或抑制的重要作用，目前有關(guān)NDRG1 mRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生及臨床病理特征的關(guān)系的研究報(bào)道不多，且存在分歧[4-5]，該研究選取東莞市東城醫(yī)院及東莞市濱海灣中心醫(yī)院進(jìn)行結(jié)直腸腺癌根治術(shù)的72例患者為研究對象，探討NDRG1 mRNA在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東莞市東城醫(yī)院及東莞市濱海灣中心醫(yī)院進(jìn)行結(jié)直腸腺癌根治術(shù)72例患者，對結(jié)直腸癌組織及其配對的癌旁組織進(jìn)行取樣?；颊吣挲g32～76歲，中位年齡60歲；男45例，女27例。所有患者分期按照WHO《消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》進(jìn)行組織學(xué)分型、TNM分期及計(jì)算腫瘤浸潤深度。組織學(xué)分型：高分化16例，中分化41例，低分化15例；TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期21例,Ⅲ期24例，Ⅳ期11例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，無轉(zhuǎn)移為42例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放、化療。術(shù)后所有的標(biāo)本離體后即取樣，剪成適量大小置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

Trizol試劑、RT-PCR試劑盒、DNA marker均為TaKaRa大連公司產(chǎn)品；人NDRG1和β-actin引物由上海生工公司合成；PCR儀和ChemiDoxXRS凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-RAD公司。

1.3 方法

RNA提取及cDNA合成按照說明書進(jìn)行。NDRG1基因上游引物：5＇-CCGGCGCGACCTGGAG ATTGAG-3＇下游引物：5＇-TGTTCCCAGCAGCACCCGAGTTG-3＇、β-actin內(nèi)參基因上游引物：5-CTTTCAGA ATCAGGGAACAAT-3＇下游引物：5＇-CGTAGAGATGAGAGTTTCAC ACA-3＇,以cDNA為模板，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1.5 min；94℃變性10 s，56℃退火40 s，72℃延伸15 s，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，采用Image J軟件分析NDRG1基因電泳條帶吸光度值，計(jì)算NDRG1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，采用t和F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NDRG1 mRNA在結(jié)直腸癌、癌旁結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)情況

NDRG1 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的相對表達(dá)量顯著低于癌旁結(jié)直腸黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 NDRG1 mRNA在不同結(jié)直腸組織中的相對表達(dá)量（±s)Table 1 Relative expression of NDRG1 mRNA in different colorectaltissues（±s)

表1 NDRG1 mRNA在不同結(jié)直腸組織中的相對表達(dá)量（±s)Table 1 Relative expression of NDRG1 mRNA in different colorectaltissues（±s)

組織類型NDRG1 mRNA相對表達(dá)量癌旁結(jié)直腸黏膜組織（n=72）結(jié)直腸腺癌（n=72）t值P值19.922±15.820 8.683±12.467 24.500<0.001

2.2 NDRG1 mRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織NDRG1 mRNA相對表達(dá)量顯著低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的癌組織；與TNM分期相關(guān)（P＜0.05），進(jìn)一步應(yīng)用LSD法進(jìn)行兩兩比較，Ⅰ期的NDRG1 mRNA相對表達(dá)量高于Ⅲ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅱ期的NDRG1 mRNA相對表達(dá)量高于Ⅲ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其余兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)直腸癌組織中NDRG1 mRNA與患者的年齡、性別、組織學(xué)分型、浸潤深度及腫瘤大小無相關(guān)性（P>0.05），見表2。

表2 NDRG1 mRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[（±s)，×10-2]Table 2 Relationship between NDRG1 mRNAexpression in colorectalcancer and clinicopathologicalcharacteristics[（±s)，×10-2]

表2 NDRG1 mRNA在結(jié)直腸癌中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[（±s)，×10-2]Table 2 Relationship between NDRG1 mRNAexpression in colorectalcancer and clinicopathologicalcharacteristics[（±s)，×10-2]

注：△進(jìn)一步應(yīng)用LSD法進(jìn)行兩兩比較，Ⅰ期和Ⅲ期比較，P＜0.05；Ⅱ期Ⅲ期比較，P＜0.05;其余兩兩比較均，P＞0.05

指標(biāo) NDRG1mRNA相對表達(dá)量 t/F值 P值年齡（歲）≤60（n=37）>60（n=35）性別男（n=45）女（n=27）腫瘤大小（cm）≤4.5（n=41）>4.5（n=31）組織學(xué)分型高分化（n=16）中分化（n=41）低分化（n=15）TNM分期Ⅰ期△（n=16）Ⅱ期△（n=21）Ⅲ期△（n=24）Ⅳ期△（n=11）浸潤深度（pT）T1、T2（n=23）T3、T4（n=49）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無（n=42）有（n=30）7.878±11.619 9.534±13.424 0.314 0.577 8.578±12.733 8.747±12.450 0.003 0.956 9.422±12.961 7.706±11.923 0.331 0.567 8.931±12.731 7.946±12.053 10.433±13.951 0.218 0.805 12.644±13.931 12.681±14.863 3.158±3.490 7.345±14.45 3.130 0.031 10.248±12.317 7.949±12.596 0.529 0.470 11.648±13.755 4.533±9.083 6.108 0.016

3 討論

分化相關(guān)基因NDRG1是NDRG家族的第一個(gè)成員，1992年在N-myc全身性敲除的小鼠胚胎組織中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)高表達(dá)的基因，因而得其名為NDRG1[6]，NDRG1蛋白主要在人的上皮細(xì)胞中表達(dá)，參與細(xì)胞生長、分化、胚胎發(fā)生、發(fā)育、應(yīng)激、免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[7]。NDRG1在惡性腫瘤中起抑癌或促癌作用，NDRG1抑制多種惡性腫瘤如前列腺癌、鼻咽癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[8-12]，NDRG1的表達(dá)與胃癌細(xì)胞分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈負(fù)相關(guān)[13]。相反的研究結(jié)果是NDRG1促進(jìn)膀胱癌增殖、侵襲，促進(jìn)膀胱癌、食管鱗狀細(xì)胞癌的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14-15]。NDRG1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌中腫瘤干細(xì)胞樣特性[16]。

有的研究者通過免疫組化方法對非腫瘤結(jié)腸組織、結(jié)直腸癌根治標(biāo)本的癌組織、結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移組織（包括淋巴結(jié)、肝和膀胱轉(zhuǎn)移）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NDRG1在結(jié)直腸癌樣本中表達(dá)較低，相對表達(dá)量為（8.984±10.873），NDRG1表達(dá)降低與淋巴結(jié)、肝、膀胱等轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[4,17]。NDRG1的過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞細(xì)胞活力，遷移，侵襲和誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[6]，抑制結(jié)直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其機(jī)制為激活Wnt/βcatenin信號通路、促進(jìn)caveolin-1泛素化、減弱NF-κB信號[17-18]。由該文研究結(jié)果可知，NDRG1 mRNA在結(jié)直腸癌組織中的相對表達(dá)量（8.683±12.467）顯著低于癌旁直腸黏膜組織（19.922±15.820）(P＜0.05)。與以上研究結(jié)果相近。表明NDRG1mRNA在結(jié)直腸癌中起抑癌的作用。

該研究采取RT-PCR技術(shù)檢測患者癌組織和癌旁組織NDRG1 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中NDRG1 mRNA相對表達(dá)量與TNM分期、和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織NDRG1 mRNA相對表達(dá)量顯著低于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的癌組織，Ⅰ期的NDRG1 mRNA相對表達(dá)量高于Ⅲ期，Ⅱ期的NDRG1 mRNA相對表達(dá)量高于Ⅲ期。結(jié)直腸癌組織NDRG1 mRNA表達(dá)與患者的年齡、性別、癌組織分化程度、浸潤深度及腫瘤大小無關(guān)。

綜上所述，對于NDRG1在結(jié)直腸癌中的作用目前存在兩種截然相反的觀點(diǎn)，究其原因可能與研究過程中臨床標(biāo)本選擇、患者因素及檢測手段等密切相關(guān)。尚需要更多的研究去論證。