白惠玲，朱曉燕，劉 勤,，張延英，康萬榮，張 書

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常見的眼部并發(fā)癥，是導致失明的重要原因。炎癥反應和氧化應激是貫穿DR整個病理過程的關鍵特征，DR患者的視力損害主要由該兩種途徑引起[1-2]。血清胱抑素C(Cystatin C, Cys C)是機體有核細胞合成的一種非糖基化堿性蛋白，主要由視網膜色素上皮細胞分泌[3-4]，近年來有研究表明，血清Cys C是DR的獨立危險因素之一[5]，因此血清Cys C的分泌情況可能與DR的發(fā)生和發(fā)展密切相關。二甲雙胍是目前治療2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的首選口服藥物。近期研究表明，二甲雙胍還可以通過減輕炎癥反應和氧化應激對視網膜色素上皮細胞的損傷，抑制視網膜新生血管生成來延緩DR進程[6-7]。本研究通過觀察二甲雙胍對T2DM大鼠視網膜血管、組織病理學改變及血清Cys C的影響，旨在探討二甲雙胍通過對血清Cys C調控，預防T2DM大鼠DR的發(fā)生，同時對已經發(fā)生DR的大鼠病情轉歸的干預作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動物模型的構建及分組給藥選取6周齡雄性SD大鼠120只，體質量約為130～170g，購自甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心[許可證號：SYXK(甘)2020-0009]。本實驗通過甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查(倫理審查編號：2020-298)。120只大鼠中隨機抽取30只分為空白對照組A(10只)，T2DM組(10只)和二甲雙胍干預組A(10只)；其余90只再次隨機分為三組，分別為空白對照組B(30只)，DR組(30只)和二甲雙胍干預組B(30只)。所有大鼠適應性飼養(yǎng)7d后給予空白對照組A、B普通飼料喂養(yǎng)，其余組均給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)4wk給空白對照組A、B左下腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液，將其余組大鼠按30mg/kg左下腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)，給藥后所有大鼠均改為普通飼料喂養(yǎng)，直到實驗結束。注藥72h后測量尾靜脈血糖濃度，記錄體質量、飲水量和尿量，當血糖>16.7mmol/L，尿糖>+++，且有多飲、多食、多尿時即認為T2DM模型成功。

造模成功后給予二甲雙胍干預組A大鼠二甲雙胍灌胃[第1wk劑量為150mg/(kg·d)，第2wk為300mg/(kg·d)，第3wk調整為400mg/(kg·d)，該劑量一直保持到3mo]，空白對照組A和T2DM組大鼠給予生理鹽水灌胃[2mL/(kg·d)，每日1次，連續(xù)3mo]，干預3mo后三組大鼠進行觀察：測量各組大鼠空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)和空腹血清胰島素(fasting serum insulin, FINS)指標，計算并分析胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，心臟采血測各組大鼠血清Cys C、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細胞介素-8(interleukin-8, IL-8)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平，并行眼底熒光造影(fundus fluorescein angiography, FFA)觀察各組大鼠眼底血管變化，HE染色觀察各組大鼠視網膜組織形態(tài)和厚度，透射電鏡觀察大鼠視網膜毛細血管超微形態(tài)。

在T2DM病程3mo后，二甲雙胍干預組B大鼠開始給予二甲雙胍灌胃[400mg/(kg·d)，每日1次，連續(xù)3mo]，空白對照組B和DR組大鼠均給予生理鹽水灌胃[2mL/(kg·d)，每日1次，連續(xù)3mo]。按干預時長不同，分別于第4、5、6mo各組取10只大鼠進行觀察：測各組大鼠血清Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS水平，并行FFA觀察各組大鼠眼底血管變化，HE染色觀察各組大鼠視網膜組織形態(tài)和厚度，透射電鏡觀察大鼠視網膜毛細血管超微形態(tài)(圖1)。

1.1.2試劑與儀器鹽酸二甲雙胍片：中美上海施貴寶制藥有限公司(批號：ABT8279)；鏈脲佐菌素：北京索萊寶科技有限公司(批號：616S0212)；熒光素鈉注射液：美國Alcon Research LLC(批號：314040F)；眼底血管熒光造影機：德國海德堡公司(型號：SpectralisHRA+Multicolor)；大鼠胰島素、Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF ELISA試劑盒：江蘇菲亞生物科技有限公司；大鼠ROS ELISA試劑盒：上海恒遠生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1模型的觀察指標測量空白對照組A、T2DM組和二甲雙胍干預組A大鼠的FBG和FINS指標，比較各組的FBG值、FINS變化并計算分析HOMA-IR(=FBG×FINS/22.5)。

1.2.2FFA檢查大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉50mg/kg進行麻醉，雙眼滴復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，將大鼠固定于眼底血管造影機前，腹腔注射10%熒光素鈉0.5mL/kg，觀察各組大鼠眼底有無病變及熒光素有無滲漏。

1.2.3ELISA實驗大鼠經2%的戊巴比妥鈉50mg/kg麻醉后行心臟采血5mL，靜置30min后4000r/min離心15min，取上清分別檢測各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量，并且根據標準曲線和吸光度值計算各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS的濃度。

1.2.4HE染色大鼠處死后迅速取出兩個眼球，左眼置于眼球固定液行HE染色。

1.2.5透射電鏡每組大鼠的右眼放入2.5%戊二醛溶液用于透射電鏡觀察。

2 結果

2.1T2DM大鼠成模及死亡率T2DM造模大鼠一次成模69只，二次累加成模11只，總成模率100%。T2DM大鼠共死亡4只，死亡率5%，分別于病程5mo(2只)、病程6mo(2只)時死亡?？瞻讓φ战M大鼠無死亡。

2.2各組大鼠FBG和FINS及HOMA-IR比較三組間FBG、FINS和HOMA-IR差異均具有統計學意義(F=205.708、171.955、321.631，均P<0.01),見表1。與空白對照組A比較，T2DM組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示T2DM大鼠造模成功；與T2DM組比較，二甲雙胍干預組A大鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖1 實驗分組及動物處理流程。

表1 各組大鼠FBG和FINS及HOMA-IR比較

2.3各組大鼠FFA檢查結果空白對照組A大鼠視網膜血管管徑均勻一致，走行規(guī)則，以視盤為中心呈放射狀分布，未見黃斑樣結構(圖2A1)；T2DM組大鼠眼底可見由稀疏的分支小動脈形成的淺層毛細血管網，毛細血管迂曲并可見熒光滲漏(圖2A2)；二甲雙胍干預組A大鼠眼底血管粗細均勻一致，走行規(guī)則，未見熒光滲漏(圖2A3)。提示T2DM病程3mo時大鼠眼底血管已出現DR的改變，而二甲雙胍干預可以預防T2DM大鼠眼底血管發(fā)生病變。

圖2 各組大鼠FFA檢查結果 A1～A3：病程3mo；A1：空白對照組A；A2：T2DM組；A3：二甲雙胍干預組A；B1～B3：病程4mo；B1：空白對照組B M4組；B2：DR組 M4組；B3：二甲雙胍干預組B M4組；C1～C3：病程5mo；C1：空白對照組B M5組；C2：DR組 M5組；C3：二甲雙胍干預組B M5組；D1～D3：病程6mo；D1：空白對照組B M6組；D2：DR組 M6組；D3：二甲雙胍干預組B M6組。

不同干預時間，空白對照組B大鼠眼底血管均清晰可見，管徑均勻一致，走行規(guī)則，無滲出和出血(圖2B1、C1、D1)。DR組(M4組)大鼠眼底血管走行迂曲，可見血管串狀樣改變和無灌注區(qū)形成(圖2B2)；DR組(M5組)大鼠眼底無灌注區(qū)面積增大，并可見出血遮蔽熒光(圖2C2)；DR組(M6組)大鼠眼底屈光間質混濁，可能存在玻璃體出血(圖2D2)。二甲雙胍干預組B(M4、M5、M6組)大鼠眼底屈光間質清晰，熒光滲漏及無灌注區(qū)隨著二甲雙胍干預時間的延長，至M6組時眼底病變已明顯好轉(圖2B3、C3、D3)。

2.4各組大鼠血清中CysC、TNF-α、IL-8、VEGF、ROS的濃度各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS濃度差異均具有統計學意義(F=182.128、167.362、166.013、249.265、76.803，均P<0.01)。與空白對照組A相比，T2DM組和二甲雙胍干預組A大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；二甲雙胍干預組A大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量較T2DM組均明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量的變化

各組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS在4、5、6mo差異均有統計學意義(P<0.01)。隨后用LSD-t法進行兩兩比較，結果顯示，在各時間點，與同期空白對照組B比較，DR組和二甲雙胍干預組B大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，但二甲雙胍干預組B大鼠增高不如DR組明顯；與DR組比較，二甲雙胍干預組B大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。且隨著病程的延長，DR組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量也顯著增高(均P<0.05)，而二甲雙胍干預組B大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量增高不如DR組明顯，見表3～5。

表3 各組大鼠血清中Cys C和TNF-α含量的變化

表4 各組大鼠血清中IL-8和VEGF含量的變化

表5 各組大鼠血清中ROS含量的變化

2.5各組大鼠HE染色結果空白對照組A大鼠視網膜各層結構清晰可見，內界膜完整，細胞排列整齊，細胞形態(tài)結構正常(圖3A1)；T2DM組大鼠視網膜各層細胞排列稀疏，細胞間隙明顯增寬，內核層和外核層細胞密度明顯減少，排列稀疏，厚度變薄(圖3A2)；二甲雙胍干預組A大鼠視網膜各層結構完整，細胞排列整齊，細胞形態(tài)正常(圖3A3)。與空白對照組A比較，T2DM組大鼠視網膜變薄(P<0.05)；與T2DM組比較，二甲雙胍干預組A大鼠視網膜增厚(P<0.05，圖4)，提示二甲雙胍干預可以預防T2DM視網膜組織發(fā)生病變。

圖3 各組大鼠HE染色結果 A1～A3：病程3mo；A1：空白對照組A；A2：T2DM組；A3：二甲雙胍干預組A；B1～B3：病程4mo；B1：空白對照組B M4組；B2：DR組 M4組；B3：二甲雙胍干預組B M4組；C1～C3：病程5mo；C1：空白對照組B M5組；C2：DR組 M5組；C3：二甲雙胍干預組B M5組；D1～D3：病程6mo；D1：空白對照組B M6組；D2：DR組 M6組；D3：二甲雙胍干預組B M6組。

圖4 二甲雙胍對T2DM大鼠視網膜厚度的影響 aP<0.05 vs T2DM組。

不同時間點空白對照組B(M4、M5、M6組)大鼠視網膜各層結構均完整且連接緊密，細胞排列整齊；DR組(M4組)大鼠視網膜各層結構排列紊亂，內界膜斷裂、水腫，外核層結構明顯紊亂、變薄，大量細胞結構被破壞并可見部分空泡，DR組(M5組)大鼠視網膜各層結構紊亂加劇，內界膜腫脹斷裂嚴重，可見內皮細胞突破內界膜，神經節(jié)細胞層細胞明顯減少，DR組(M6組)大鼠視網膜內界膜嚴重腫脹，神經節(jié)細胞層細胞進一步減少，內外核層界限消失，內叢狀層、內核層、外叢狀層、外核層細胞數量均減少，排列稀疏，各層的毛細血管明顯擴張，管腔增粗，腔內可見紅細胞，還可見部分紅細胞滲漏到血管外的組織中，毛細血管數量增加；二甲雙胍干預組B(M4、M5、M6組)大鼠視網膜各層結構排列稍紊亂，少量細胞結構被破壞，形態(tài)結構改變較DR組各亞組均較輕，見圖3B、C、D。與同期空白對照組比較，DR組大鼠視網膜變薄(P<0.05)；與DR組比較，二甲雙胍干預組B大鼠視網膜增厚(P<0.05)，且隨著病程的延長，DR組大鼠視網膜進一步變薄(P<0.05)，而二甲雙胍干預組B大鼠視網膜厚度變化不明顯(P>0.05)，見圖5。

圖5 二甲雙胍對DR大鼠視網膜厚度的影響 aP<0.05 vs DR組；cP<0.05 vs 病程4mo DR組；eP<0.05 vs 病程5mo DR組。

2.6各組大鼠視網膜毛細血管的透射電鏡結果空白對照組A大鼠視網膜毛細血管由基底膜、內皮細胞和周細胞組成，位于管腔內面的內皮細胞被連續(xù)的基底膜和周細胞環(huán)繞，內皮細胞和周細胞核形態(tài)正常，異染色質分布均勻，細胞器結構清晰，基底膜連續(xù)完整(圖6A1)；T2DM組大鼠內皮細胞和周細胞核的異染色質凝聚靠邊，核膜凹陷褶皺，線粒體嵴部分消失，個別呈空泡變,內皮細胞胞質內飲泡增多，胞質向管腔突出，基底膜增厚(圖6A2)；二甲雙胍干預組A大鼠透射電鏡下視網膜毛細血管內皮細胞核的周圍可見少量異染色質，管壁的厚度基本正常，線粒體基本正常，未見腫脹和嵴斷裂，基底膜無增厚(圖6A3)。提示二甲雙胍干預可以預防T2DM大鼠視網膜毛細血管發(fā)生病變。

空白對照組B(M4、M5、M6組)大鼠視網膜毛細血管周細胞和內皮細胞結構均清晰，線粒體結構正常，基底膜連續(xù)完整，無增厚(圖6B1、C1、D1)；DR組(M4組)大鼠視網膜周細胞和內皮細胞的線粒體出現空泡樣改變，線粒體膜中斷不連續(xù)，基底膜增厚，電子密度增加，毛細血管管腔變形(圖6B2)；二甲雙胍干預組B(M4組)大鼠視網膜毛細血管內皮細胞及周細胞核的異染色質凝聚并靠邊，內皮細胞胞質內飲泡增多且胞質向管腔突出以及線粒體腫脹(圖6B3)，但視網膜損害較DR組(M4組)輕；DR組(M5組)大鼠視網膜毛細血管周細胞及內皮細胞核固縮，異染色質邊聚，周細胞、內皮細胞細胞器結構模糊，內皮細胞向管腔突出，基底膜斷裂缺失，管腔變形(圖6C2)；二甲雙胍干預組B(M5組)大鼠視網膜毛細血管內皮細胞核的周圍可見少量異染色質并且核內也可見散在的異染色質，仍有管腔內突起物，線粒體基本正常，未見腫脹、嵴斷裂，基底膜稍厚(圖6C3)；DR組(M6組)大鼠視網膜毛細血管改變較前更加嚴重，管腔狹窄閉塞，管壁周細胞和內皮細胞均出現明顯固縮，內皮細胞向管腔突出嚴重，細胞器結構不清，管腔周圍水腫明顯，基底膜缺失(圖6D2)；二甲雙胍干預組B(M6組)大鼠在視網膜毛細血管內皮細胞中，細胞核周邊可見異染色質聚集，細胞核內亦可見異染色質，線粒體正常，管壁厚度基本正常，管腔內見少量突起物，周細胞核及線粒體內偶見空化現象，但基底膜無增厚(圖6D3)。

圖6 各組大鼠視網膜毛細血管的透射電鏡結果 A1～A3：病程3mo；A1：空白對照組A；A2：T2DM組；A3：二甲雙胍干預組A；B1～B3：T2DM病程4mo；B1：空白對照組B M4組；B2：DR組 M4組；B3：二甲雙胍干預組B M4組；C1～C3：T2DM病程5mo；C1：空白對照組B M5組；C2：DR組 M5組；C3：二甲雙胍干預組B M5組；D1～D3：T2DM病程6mo；D1：空白對照組B M6組；D2：DR組 M6組；D3：二甲雙胍干預組B M6組。

3 討論

T2DM是近年來患病率較高的一種慢性炎癥性疾病，長期的高血糖可以導致血管的結構和功能發(fā)生改變，引發(fā)一系列并發(fā)癥。DR是T2DM最常見的微血管病變之一，主要表現為免疫、炎性反應等多種機制共同作用引起的視網膜微血管瘤和眼底出血、滲出，進而導致視物模糊，嚴重時出現永久性視力喪失[8-9]。STZ糖尿病大鼠模型是研究DR的常用動物模型，可以用于研究該病的病理機制以及防治策略[10]。本研究采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)4wk聯合小劑量STZ 30mg/kg腹腔注射建立T2DM大鼠模型，結果發(fā)現T2DM模型大鼠多食、多飲、多尿、體質量減輕，所有大鼠空腹血糖均≥16.7mmol/L，且HOMA-IR升高，成功復制出了大鼠胰島素抵抗模型，即T2DM模型。飼養(yǎng)3mo后，T2DM模型大鼠FFA結果顯示，眼底可見稀疏的分支小動脈形成的淺層毛細血管網，毛細血管迂曲并可見熒光滲漏；HE染色結果顯示，視網膜各層細胞排列稀疏，細胞間隙明顯增寬，內核層和外核層細胞密度明顯減少，排列稀疏，厚度變??；透射電鏡結果顯示，內皮細胞與周細胞的細胞核異染色質凝聚并靠邊，核膜凹陷褶皺，線粒體嵴部分消失，個別呈空泡變，內皮細胞的胞質內飲泡增多且胞質向管腔突出，基底膜增厚。這些結果均提示本研究DR模型大鼠建立成功。而DR的發(fā)病機制非常復雜，炎癥反應和氧化應激在DR的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

Cys C是一類半胱氨酸蛋白酶抑制劑，研究發(fā)現，它在大鼠玻璃體、視網膜的各層細胞中均有表達[4]。有研究表明，隨著DR的發(fā)展，血清Cys C水平顯著升高[11]，其參與DR的機制可能有：(1)Cys C及其降解產物能夠激活并介導炎癥反應[12]。文獻報道Cys C與伴隨有TNF-α、IL-8和VEGF等炎性細胞因子升高的炎癥反應呈正相關[13-18]?？赡艿臋C制為，Cys C通過干擾素γ(interferon-γ, IFN-γ)介導的信號轉導通路發(fā)揮了重要的致炎作用。IFN-γ是一種由NK細胞和活化的T細胞產生可溶性細胞因子，通常作為巨噬細胞的重要激活因子，也是主要組織相容性復合物Ⅱ(MHC-Ⅱ)分子表達的誘導劑，IFN-γ異常高表達通常會導致自身炎癥的產生?，F有研究發(fā)現，向Cys C-/-小鼠巨噬細胞中加入Cys C會促進誘導的核轉錄因子κB(NF-κB)的激活，進而啟動多種細胞因子特別是TNF-α、IL-6、IL-8及VEGF等[19-21]基因的轉錄，而使炎癥反應放大；(2)同時，糖尿病患者體內原本就已經存在的慢性炎癥，在Cys C水平異常升高時，反之亦可引起患者視網膜血管內皮出現損傷，并引起硬化[22-24]；(3)同型半胱氨酸具有損傷血管內皮細胞、導致微血管病變的作用，而Cys C對同型半胱氨酸的表達及分泌可產生一定的激發(fā)作用[25],Cys C可通過影響蛋白水解酶的活性及對同型半胱氨酸的作用參與血管內皮細胞損傷、血管重塑、血管新生等病變過程，參與DR的發(fā)生[26]。本研究結果發(fā)現，分別與空白對照組A和空白對照組B相比，對應的T2DM組和DR組大鼠血清中Cys C含量明顯升高，同時伴有TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯升高，且隨著病程的延長，DR組大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量也均逐漸升高。本實驗與其他研究結果一致，提示血清Cys C在DR的發(fā)生和發(fā)展中都起了重要作用，并通過炎癥和氧化應激兩者所涉及的共同通路有關，可能為DR探討新的治療策略提供思路。

二甲雙胍來源于山羊豆堿，指南推薦其可以作為治療T2DM的一線和全程用藥[27]。研究發(fā)現，二甲雙胍不僅可以通過提高胰島素敏感性降低血糖，還可以通過減少視網膜損傷、抑制視網膜的炎癥反應和改善胰島素抵抗等，減少或延緩DR的發(fā)生與發(fā)展[28]。近年來多篇研究已報道二甲雙胍還具有抗氧化特性，通過促進SOD分泌，抑制超氧陰離子自由基分泌，最終改善患者的氧化應激[29]。本研究發(fā)現，與T2DM組比較，二甲雙胍干預組A大鼠HOMA-IR、Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均顯著降低，FFA、HE和透射電鏡結果均顯示與空白對照組A基本相似，視網膜均未出現明顯的異常改變，該結果提示二甲雙胍可有效改善胰島素抵抗及炎癥反應對視網膜的損傷，可預防DR的發(fā)生。在研究中還發(fā)現，在各時間點與DR組比較，二甲雙胍干預組B大鼠血清中Cys C、TNF-α、IL-8、VEGF和ROS含量均明顯下降，且隨著病程的延長，這些指標的增高也都不如DR組明顯，FFA、HE和透射電鏡結果示眼底改變較DR組各亞組均較輕，且眼底病變都明顯逐漸好轉，其機制可能是T2DM大鼠經二甲雙胍治療后，使得NF-κB的亞單位無法從失活狀態(tài)活化，從而無法從細胞質轉移到細胞核內與相應的炎癥相關基因結合，進而抑制了炎性細胞因子的轉錄以及炎性因子或遞質的合成和釋放[30-31]，通過抑制NF-κB介導的炎癥通路降低血清Cys C，延緩和改善了炎癥反應對視網膜的破壞，從而達到保護視網膜的效果[32]，從而提示二甲雙胍可能是通過下調血清Cys C介導的炎癥和氧化應激水平來預防和減緩T2DM大鼠發(fā)生DR。

綜上所述，二甲雙胍能夠有效下調血清中Cys C和其介導的TNF-α、IL-8、VEGF和ROS的含量，從而抑制T2DM大鼠的視網膜發(fā)生炎癥反應和氧化應激，提示二甲雙胍可能是預防和治療DR的有效藥物。本研究尚存在幾處不足：(1)本研究由于實驗周期較長，設亞組較多，且采用HE和透射電鏡兩種方法將視網膜組織制樣，故組織樣本數量有限，無法從局部檢測，后續(xù)有條件時將從視網膜組織進一步加以驗證；(2)本研究僅設立了安慰劑對照，如有條件后期將設立接受其他對DR有效的藥物治療的大鼠作為同期對照。