張?jiān)茖?羅云 丁婧 程遠(yuǎn)燦 曹?chē)?guó)平(泰興市人民醫(yī)院 輸血科，江蘇 泰興 225400)

不規(guī)則抗體是指除抗-A、抗-B 以外的血型抗體，也稱意外抗體，多經(jīng)妊娠或輸血免疫應(yīng)答產(chǎn)生，可導(dǎo)致(不全)流產(chǎn)、死胎、新生兒溶血病或溶血性[1-4]、遲發(fā)性血清學(xué)輸血不良反應(yīng)等[5]，也是干擾血型鑒定和交叉配血的主要因素之一。 我們?cè)趯?duì)1 名長(zhǎng)期依賴輸血的血液病患者交叉配血時(shí)發(fā)現(xiàn)高效價(jià)(IgG＋I(xiàn)gM)抗-Mur，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者，男，48 歲，全血細(xì)胞減少10 余年，伴有脂肪肝、高血壓9 年余。 從2017 年10 月起患者常因貧血、頭昏乏力加重入住本院，臨床診斷“骨髓增生異常綜合癥(MDS)不能排除”，給予靜脈丙球、美羅華等治療，長(zhǎng)期依賴輸B、RhD＋紅細(xì)胞糾正貧血。 所有B、RhD＋血液(包括獻(xiàn)血者1 及其他獻(xiàn)血者)均來(lái)源泰州市中心血站。

1.2 試劑與儀器 血型鑒定卡(強(qiáng)生，批號(hào):ABR356F)，抗人球蛋白檢測(cè)卡(長(zhǎng)春博迅，批號(hào):20221201)， 不規(guī)則抗體篩選細(xì)胞(長(zhǎng)春博迅，批號(hào):20221206/20230203)，譜細(xì)胞(上海血液生物，批號(hào):20230105/20230309)，2-Me(上海血液生物，批號(hào):20217703)，人類(lèi)紅細(xì)胞稀有血型基因分型試劑盒(熒光PCR 法)(江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰，批號(hào):20230103)，抗-M(上海血液生物，批號(hào):20220725)，抗-N(上海血液生物，批號(hào)20220620)，抗-Mia(Immucor 公司，批號(hào):NMIA00401)，抗-s(Immucor，批號(hào):625029)， 抗-S(Immucor，批號(hào):20230131)。AutoVue lnnova 全自動(dòng)血型及配血分析系統(tǒng)(Ortho 公司)，2005-2 型離心機(jī)(貝索公司)，F(xiàn)YQ 型試劑卡孵育器、TD-3A型血型血清學(xué)用離心機(jī)(長(zhǎng)春博研)。

1.3 方法

1.3.1 血型鑒定 采用微柱凝膠法檢測(cè)ABO 血型。

1.3.2 直接抗人球蛋白試驗(yàn) 將紅細(xì)胞稀釋成1%濃度，取50 μL 加入抗人球蛋白卡中，置專(zhuān)用37℃孵育箱15 min 后400×g 離心2 min，665×g 離心3 min。 紅細(xì)胞沉于凝膠底部的為陰性，懸浮于凝膠表面或中間的為陽(yáng)性。

1.3.3 特珠介質(zhì)交叉配血 采用IgG 微柱凝膠卡法。

1.3.4 不規(guī)則抗體檢測(cè)IgM 類(lèi)抗體 取3 只試管，分別加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)抗體篩選細(xì)胞50 μL，再各加入患者血清100 μL，混勻。 1 500×g 離心15 s 觀察凝集強(qiáng)度；IgG 類(lèi)抗體:取IgG 微柱凝膠卡分別加入1%的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號(hào)篩選細(xì)胞50 μL和受檢者血漿100 μL，置專(zhuān)用37℃孵育器孵育15 min 后放入血型血清學(xué)專(zhuān)用離心機(jī)400×g 離心2 min，665×g 離心3 min，觀察結(jié)果。 紅細(xì)胞沉于凝膠底部為陰性、懸浮于凝膠表面或中間為陽(yáng)性。

1.3.5 抗體特異性鑒定 采用鹽水試管法和微柱凝膠抗人球蛋白卡將患者血清分別與由10 人份O 型紅細(xì)胞組成的1%譜細(xì)胞及1%自身紅細(xì)胞反應(yīng)。 與譜細(xì)胞凝集、與自身紅細(xì)胞不凝集者為特異性抗體，根據(jù)與譜細(xì)胞在不同介質(zhì)中的反應(yīng)格局判定IgM 型和IgG 型抗體的特異性。

1.3.6 抗體效價(jià)測(cè)定 IgM 型效價(jià):在10 mm×70 mm 玻璃試管中加入用生理鹽水倍比稀釋患者血清與譜細(xì)胞反應(yīng)格局中出現(xiàn)凝集的最強(qiáng)或混合譜紅細(xì)胞等量，1 500×g 離心15 s，取出均勻輕揺試管至底部細(xì)胞泛起觀察結(jié)果，以凝集強(qiáng)度≥1＋的血清最高稀釋倍數(shù)報(bào)告IgM 效價(jià)；IgG 型效價(jià):取患者血清100 μL 與2-Me 應(yīng)用液等比例混合后密封，37℃孵育30 min后取100 μL 滅活液用生理鹽水倍比稀釋?zhuān)捎梦⒅z法與譜細(xì)胞反應(yīng)格局中出現(xiàn)最強(qiáng)凝集或混合陽(yáng)性的譜紅細(xì)胞反應(yīng)測(cè)定其效價(jià)，以凝集強(qiáng)度≥1＋的血清最高稀釋倍數(shù)報(bào)告IgG 型效價(jià)。

1.3.7 MNS 及其它稀有血型系統(tǒng)抗原 采用基因檢測(cè)(熒光PCR 法) 嚴(yán)格按操作說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2.1 血型鑒定及不規(guī)則抗體篩查 患者及所有獻(xiàn)血者血型均為B 型，RhD＋。 微柱凝膠法和鹽水試管法不規(guī)則抗體篩查結(jié)果患者均為陰性，見(jiàn)表1、表2。

表1 患者血清不規(guī)則抗體篩查結(jié)果(一)

表2 患者血清不規(guī)則抗體篩查結(jié)果(二)

2.2 交叉配血及直接抗人球蛋白試驗(yàn) 患者與獻(xiàn)血者1 配血呈主側(cè)4＋、次側(cè)-，其它多名獻(xiàn)血者配血結(jié)果均為陰性；獻(xiàn)血者1 與其它B、RhD＋獻(xiàn)血者配血結(jié)果均為陰性。 獻(xiàn)血者1直抗試驗(yàn)為陰性。

2.3 譜細(xì)胞抗體特異性鑒定 患者血清與2 個(gè)批號(hào)譜細(xì)胞在鹽水介質(zhì)中及血清經(jīng)2-Me 處理后在IgG 微柱凝膠卡中反應(yīng)格局如見(jiàn)表3、表4。

表3 患者血清與譜細(xì)胞反應(yīng)格局(一)

表4 患者血清與譜細(xì)胞反應(yīng)格局(二)

2.4 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果及抗體效價(jià) 患者血清抗-Mia陰性，抗-M4＋，抗-N3＋，抗-S 陰性，抗-s 4＋。 IgG 型抗-Mur 效價(jià)為128，IgM 型效價(jià)為16。

2.5 患者稀有血型基因分型(熒光法)結(jié)果CCee，LW*A/LW*A，F(xiàn)Y*A/FY*A，JK*B/JK*B，GYPA*M/GYPA*N，GYPB*s/GYPB*s，DI*02.04/DI*02.04，KEL*02/KEL*02，CO*A/CO*A，DO*A/DO*B，LU*B/LU*B，YT*A/YT*A。

2.6 Mur 抗原 獻(xiàn)血者1 為陽(yáng)性4＋，患者為陰性。

3 討論

MNS 血型系統(tǒng)是繼ABO 血型系統(tǒng)后第2 個(gè)被發(fā)現(xiàn)的血型系統(tǒng)，是最具多樣性的血型系統(tǒng)之一，其復(fù)雜程度僅次于Rh 血型系統(tǒng)[6-7]。 MNS 血型抗原決定簇位于紅細(xì)胞膜上的血型糖蛋白A 和血型糖蛋白B 上，并由相鄰的GYPA和GYPB基因進(jìn)行編碼。 Mur 抗原屬于MNS 系統(tǒng)中的Miltenberger(簡(jiǎn)稱Mi)亞系列抗原，表達(dá)在GP.Mur、GP.Hop、GP.Bun、GP.Dane 表型紅細(xì)胞上。 Mi 系列由11 種抗原交叉組合為11 種不同的表現(xiàn)型。 其中Mur 抗原存在于MiⅡ型紅細(xì)胞上，是MNS 系統(tǒng)變異抗原中最常見(jiàn)的1 種抗原。 Mur 抗原在白種人和黑種人中罕見(jiàn)，血型頻率僅0.012%[2]，但在華人中表達(dá)頻率較高，甚至被稱為“華人血型”，出現(xiàn)頻率為4.75%～7.3%，但產(chǎn)生抗-Mur 的頻率僅為0.18%[8]。

MNS 血型系統(tǒng)抗體有天然抗體和免疫抗體2 類(lèi)，大部分是IgM 型天然抗體，少數(shù)是免疫刺激產(chǎn)生的IgG 型。 抗-M、抗-N 多為自然發(fā)生，且多為冷性抗體，臨床意義不是很大，但抗-Mur 抗體多為免疫產(chǎn)生的抗體[9]，能夠引起溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血病等嚴(yán)重疾病[10-12]。

本例抗-Mur 的發(fā)現(xiàn)存在偶然性。 患者長(zhǎng)期依賴輸血，入院血型鑒定結(jié)果為B、RhD＋，不規(guī)則抗體未篩檢出，但以抗人球蛋白微柱凝膠卡交叉配血過(guò)程中發(fā)現(xiàn)患者與獻(xiàn)血者1 配血呈主側(cè)4＋、次側(cè)-。 據(jù)此首先考慮需驗(yàn)證雙方ABO＼Rh 血型、患者不規(guī)則抗體及獻(xiàn)血者直接抗人球蛋白試驗(yàn)。 排除雙方血型錯(cuò)誤因素后，可嘗試更換不同的患者與該獻(xiàn)血者，及不同的獻(xiàn)血者與該患者重復(fù)交叉配血加以驗(yàn)證，本例患者僅與獻(xiàn)血者1 配血呈主側(cè)凝集而與其它獻(xiàn)血者均相容；獻(xiàn)血者1 與其它B、RhD＋血液配血亦均相容，說(shuō)明在供、受雙方間一定存在稀有血型系統(tǒng)抗原、抗體因素，在排除供者紅細(xì)胞致敏因素后應(yīng)再次用不同批號(hào)篩選細(xì)胞復(fù)查患者不規(guī)則抗體，盡管結(jié)果仍為陰性，但我們高度懷疑因不規(guī)則抗體篩查細(xì)胞存在局限性、不能全面覆蓋紅細(xì)胞血型抗原而導(dǎo)致某種低頻抗體的漏檢，繼而追加了譜細(xì)胞檢測(cè)并根據(jù)陽(yáng)性反應(yīng)格局來(lái)確定抗體類(lèi)型及特異性并測(cè)定其效價(jià)。 結(jié)果也證實(shí)患者血清中存在(IgM＋I(xiàn)gG)型抗-Mur。 有條件時(shí)可運(yùn)用熒光PCR 法對(duì)雙方MNS 血型系統(tǒng)進(jìn)行基因分型，GP.Mur 總是和s 共同遺傳的[13]，該基因產(chǎn)生的s 抗原性質(zhì)與正常s 抗原不同，可能紅細(xì)胞與一些強(qiáng)的抗-s 血清不反應(yīng)。 通常和Ms 共同遺傳，其表型伴隨“N”表達(dá)的增強(qiáng)。

臨床交叉配血試驗(yàn)常發(fā)生配血不合的情況，如因妊娠、輸血等原因致體內(nèi)存在同種不規(guī)則抗體、自身免疫性疾病介導(dǎo)產(chǎn)生自身抗體、血清蛋白紊亂及藥物因素等均可致配血不合。特別是長(zhǎng)期反復(fù)輸血的患者，體內(nèi)易產(chǎn)生不規(guī)則抗體干擾血型鑒定和交叉配血[14]。 解決疑難配血的關(guān)鍵在于理清頭緒后對(duì)交叉配血不合的原因做出初步判斷，根據(jù)不同介質(zhì)、不同的試驗(yàn)條件，正確選用抗體篩查和抗體特異性鑒定細(xì)胞[15]，鑒定出有臨床意義的抗體，尤其要注意避免低頻抗體的漏檢。根據(jù)最終試驗(yàn)結(jié)果提供相合血液，保證臨床輸血安全。

本例中高效價(jià)低頻抗-Mur 也只是在交叉配血主側(cè)不合后被“意外”檢出，同時(shí)借助MNS 血型分子生物學(xué)分型技術(shù)也進(jìn)一步驗(yàn)證了血清學(xué)鑒定結(jié)果。 本研究發(fā)現(xiàn)，不規(guī)則抗體篩查細(xì)胞如缺少M(fèi)ur 抗原，會(huì)造成抗-Mur 漏檢致交叉配血不合。 患者此前多次配血未出現(xiàn)不相合現(xiàn)象，是因?yàn)镸ur 抗原在人群中出現(xiàn)頻率較低，患者抗-Mur 雖漏檢但未接觸到Mur抗原陽(yáng)性者。 建議醫(yī)療機(jī)構(gòu)為患者進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查時(shí)，盡量選擇紅細(xì)胞血型抗原覆蓋面較廣的抗體篩查細(xì)胞[16]，包含GP.Mur 紅細(xì)胞顯得尤為重要，以提高不規(guī)則抗體的檢出率與保障輸血的安全性，同時(shí)出具不規(guī)則抗體篩查報(bào)告時(shí)建議將“陰性”改為“未檢出”，結(jié)果更準(zhǔn)確。

致謝:江陰力博醫(yī)藥生物技術(shù)股份有限公司為本論文提供的基因檢測(cè)技術(shù)支持

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。