潘敏麗，黃國定，蔡冠虎，盧宏全

摘要 目的：探討芒果苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷（MIRI）的保護機制。方法：60只無特定病原體（SPF）級健康雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、MIRI組、芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組、芒果苷＋核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）抑制劑（ML385）組，每組12只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立MIRI模型。再灌注4 h后，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定血清肌鈣蛋白I（cTnI）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）水平；蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織病理學(xué)變化；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法（TUNEL）分析心肌細(xì)胞凋亡情況；二氫乙錠（DHE）熒光法檢測心肌組織活性氧（ROS）水平；比色法檢測心肌組織超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和亞鐵離子（Fe2＋）含量；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌組織Nrf2、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、鐵蛋白重鏈1（FTH1）、長鏈脂酰輔酶A合成酶4（ACSL4）的基因和蛋白表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，MIRI組大鼠血清cTnI、CK和LDH水平，心肌細(xì)胞凋亡率，ROS、MDA、Fe2＋含量，ACSL4 mRNA和蛋白水平升高；SOD活性和GSH含量，Nrf2、GPX4、FTH1 mRNA和蛋白水平降低（P＜0.05）；心肌細(xì)胞腫脹，心肌纖維排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤。與MIRI組比較，芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組血清cTnI、CK和LDH水平，心肌細(xì)胞凋亡率，ROS、MDA和Fe2＋含量，ACSL4 mRNA和蛋白水平降低；SOD活性和GSH含量，Nrf2、GPX4、FTH1 mRNA和蛋白水平升高（P＜0.05）；心肌細(xì)胞水腫減輕，少量心肌纖維斷裂和炎性細(xì)胞浸潤。使用Nrf2抑制劑ML385抑制Nrf2的核易位可明顯阻斷芒果苷對心肌鐵死亡的抑制作用（P＜0.05）。結(jié)論：芒果苷可通過激活Nrf2-GPX4軸抑制鐵死亡對MIRI發(fā)揮保護作用。

關(guān)鍵詞心肌缺血再灌注損傷；鐵死亡；芒果苷；核因子E2相關(guān)因子2；谷胱甘肽過氧化物酶4；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.011

Effect of Mangiferin on Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rats Based on Nrf2-GPX4 Ferroptosis Pathway

PAN Minli， HUANG Guoding， CAI Guanhu， LU Hongquan

Hainan Western Central Hospital， Danzhou 571700， Hainan， China， E-mail： pml1984p@163.com

AbstractObjective：To investigate the protective effect of mangiferin on myocardial ischemia-reperfusion injury（MIRI） in rats.Methods：Sixty healthy male SD rats without specific pathogen（SPF） grade were randomly divided into sham operation group，MIRI group，low-dose mangiferin group，high-dose mangiferin group，and mangiferin ＋Nrf2 inhibitor（ML385） group，with 12 rats in each group.Except the sham group，the MIRI model was established by ligation of the anterior descending branch of the left coronary artery.After 4 h of reperfusion，serum troponin I（cTnI），lactate dehydrogenase（LDH） and creatine kinase（CK） levels were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The cardiac histopathological changes were observed by hematoxylin-eosin（HE） staining.Myocardial cell apoptosis was analyzed by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） method.Dihydroethidium（DHE） fluorescence assay was used to detect the level of reactive oxygen species（ROS） in myocardial tissue.Superoxide dismutase（SOD） activity，malondialdehyde（MDA），glutathione（GSH），and ferrous ion（Fe2＋） contents were detected by colorimetry.Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（qRT-PCR） and Western Blot were used to detect the gene and protein expression of nuclear factor E2-related factor 2（Nrf2），glutathione peroxidase 4（GPX4），ferritin heavy chain 1（FTH1），and long chain fatty acyl-CoA synthetase 4（ACSL4） in myocardial tissue.Results：Compared with sham group，serum levels of cTnI，CK and LDH，cardiomyocyte apoptosis rate，ROS，MDA，F(xiàn)e2＋ content，ACSL4 mRNA and protein levels of rats in MIRI group increased，SOD activity and GSH content，Nrf2，GPX4，F(xiàn)TH1 mRNA and protein levels decreased（P＜0.05），cardiomyocytes were swollen，myocardial fibers were disordered，and a large number of inflammatory cells were infiltrated.Compared with MIRI group，serum cTnI，CK and LDH levels，cardiomyocyte apoptosis rate，ROS，MDA and Fe2＋ contents，ACSL4 mRNA and protein levels in low-dose mangiferin group，high-dose mangiferin group decreased，SOD activity and GSH content，Nrf2，GPX4，F(xiàn)TH1 mRNA and protein levels increased（P＜0.05），cardiomyocyte edema? reduced，with a small amount of myocardial fiber rupture and inflammatory cell infiltration.Inhibition of nuclear translocation of Nrf2 by Nrf2 inhibitor ML385 could significantly block the inhibitory effect of mangiferin on cardiac ferroptosis（P＜0.05）.Conclusion：Mangiferin can protect MIRI by inhibiting ferroptosis through activation of Nrf2-GPX4 axis.

Keywordsmyocardial ischemia-reperfusion injury; ferroptosis; mangiferin; nuclear factor-E2-related factor 2; glutathione peroxidase 4; experimental study

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是缺血性心臟病病人冠狀動脈血流恢復(fù)后導(dǎo)致心肌功能障礙、結(jié)構(gòu)損傷和心肌梗死死亡率增加的一種病理過程［1］。MIRI已成為威脅人類健康的主要危險因素之一。鐵死亡是一種依賴鐵的新型細(xì)胞死亡形式，以活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增加和脂質(zhì)過氧化為特征，與氧化應(yīng)激密切相關(guān)［2］。研究顯示，鐵死亡是心肌細(xì)胞死亡的一種重要形式，由谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）的失活和脂質(zhì)過氧化物的積累引起，是MIRI的主要驅(qū)動因素［3-4］。心肌梗死期間GPX4的下調(diào)有助于心肌細(xì)胞的鐵死亡［5］，而鐵死亡抑制劑可通過恢復(fù)GPX4水平，減輕MIRI［6］。因此，鐵死亡是MIRI的治療新靶點。

近年來，中醫(yī)藥防治MIRI的探索和研究備受關(guān)注。芒果苷（mangiferin，MF）是一種在芒果和木瓜中發(fā)現(xiàn)的天然葡糖基黃酮，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用［7］；芒果苷已被證實可保護心肌細(xì)胞免受心肌梗死和MIRI的影響［8-9］，然而，潛在的機制仍不完全明確。研究顯示，芒果苷的保護作用與激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）增強抗氧化劑防御系統(tǒng)有關(guān)［10］。Nrf2是維持鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白，主要通過直接影響GPX4的合成和功能來調(diào)節(jié)鐵死亡［11］。然而，探討芒果苷減輕MIRI的作用是否與鐵死亡有關(guān)的研究較少。因此，本研究基于Nrf2-GPX4介導(dǎo)的鐵死亡通路評估芒果苷減輕MIRI的機制。

1材料與方法

1.1動物

60只無特定病原體（SPF）級8～10周健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量260～300 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司［許可證號為SCXK（魯）2019 0003］提供。將所有SD大鼠置于12 h黑暗/12 h光照循環(huán)、溫度23～25 ℃和濕度55%～70%的環(huán)境下，給予標(biāo)準(zhǔn)食物飼養(yǎng)，可以自由飲水。實驗前所有動物禁食12 h。

1.2主要試劑與儀器

芒果苷（純度＞98%，M-018，成都瑞芬思生物科技有限公司，中國）；Nrf2特異性抑制劑ML385（HY-100523，MedChemExpress，美國）；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）（ml059111）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）（ml059178）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（A001-3-2）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）（A006-2-1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（A003-1-2）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國）；二氫乙錠（dihydroethidium，DHE）熒光探針（D11347，invitrogen，美國）；亞鐵離子（Fe2＋）檢測試劑盒（E-BC-K304-S，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，中國）；兔源一抗Nrf2（ab137550）、Lamin B1（ab133741）、GPX4（ab125066）、鐵蛋白重鏈1（Ferritin Heavy Chain 1，F(xiàn)TH1）（ab183781）、長鏈脂酰輔酶A合成酶4（long-chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4）（ab155282）、GAPDH（ab181602）（Abcam，英國）。iMark680多功能酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國）；ABI Prism 7500型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（Applied Biosystems，美國）；NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）；LSM 510激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國）。

1.3分組與建模

將大鼠隨機分為假手術(shù)組、MIRI組、芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組、芒果苷＋Nrf2抑制劑（ML385）組，每組12只。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，氣管插管后用動物呼吸機進(jìn)行機械通氣。三導(dǎo)聯(lián)心電圖用于監(jiān)測心肌缺血開始時的心跳以及典型的心電圖變化。通過活結(jié)結(jié)扎左冠狀動脈前降支30 min誘導(dǎo)心肌缺血，然后心肌再灌注4 h建立MIRI模型［12］。假手術(shù)組接受相同的手術(shù)方法，但不結(jié)扎左冠狀動脈前降支。心電圖ST段持續(xù)升高、左心室心尖和前壁白色表示缺血模型誘導(dǎo)成功，心電圖ST段下降50%以上、左心室心尖和前壁恢復(fù)和變紅表明再灌注成功。手術(shù)完成后，仔細(xì)逐層縫合大鼠肌肉和皮膚，并在切口處注射少量青霉素或用碘伏擦拭，對創(chuàng)面進(jìn)行消毒，防止創(chuàng)面感染。假手術(shù)組和MIRI組大鼠在術(shù)前給予生理鹽水灌胃1周，芒果苷低劑量組和芒果苷高劑量組大鼠在術(shù)前分別灌胃芒果苷20、40 mg/kg，芒果苷＋ML385組大鼠灌胃芒果苷40 mg/kg的同時腹腔注射30 mg/kg ML385，每日1次，連續(xù)干預(yù)1周［6，8］。

1.4ELISA法測定血清cTnI、LDH、CK水平

再灌注4 h后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動脈取血，靜置后離心（1 000×g，10 min），取血清，并將血清儲存在－20 ℃冰箱。采用ELISA試劑盒檢測血清LDH、cTnI、CK水平。

1.5蘇木精-伊紅（HE）染色觀察心肌組織病理學(xué)變化

取血完成后，小心取出大鼠心臟并將其置于預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，去除結(jié)締組織和脂肪組織。然后每組隨機選取6只大鼠心肌并分為兩部分，一部分心肌組織在異戊烷中快速冷凍，并防止冰晶形成，然后用冷凍切片機小心地將組織切成薄片，用于檢測ROS水平；另一部分在4%多聚甲醛中固定24 h，包埋在石蠟中，切成4 μm厚的切片，經(jīng)脫蠟、水化后用蘇木精染色5 min，用流水洗滌，然后用1%鹽酸乙醇分化1～3 s，弱氨水浸泡5～10 s，0.5%伊紅溶液染色30～60 s，之后用不同濃度的乙醇浸泡，中性樹膠密封。每張切片隨機選取5個視野在光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.6末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法（TUNEL）測定心肌細(xì)胞凋亡

取石蠟包埋的心肌組織切片，充分脫蠟和水化，然后在蛋白酶K中透化10 min。PBS洗滌后將切片在黑暗條件下與TUNEL反應(yīng)混合液反應(yīng)1 h，然后用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。在熒光顯微鏡下對組織切片進(jìn)行成像，并計算TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量。TUNEL陽性染色細(xì)胞顯示綠色熒光，所有用DAPI染色的細(xì)胞核均產(chǎn)生藍(lán)色熒光。凋亡率＝TUNEL陽性染色的凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7DHE熒光染色法檢測心肌組織ROS水平

使用DHE熒光探針檢測心肌冰凍切片中的ROS。將左心室心肌樣品（10 μm切片）與10 μmol/L的DHE在暗室中于37 ℃孵育20 min；然后用PBS清洗3次。在熒光顯微鏡下觀察DHE染色的熒光強度，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析所有圖像。為了量化，每張切片隨機選擇3個視野，分析陽性染色細(xì)胞的平均熒光強度。

1.8比色法檢測心肌組織SOD、MDA、GSH和Fe2＋含量

將每組剩余6只大鼠的心肌組織分為兩部分，一部分液氮速凍后于－80 ℃保存，用于實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測；另一部分加入9倍的預(yù)冷生理鹽水研磨，以12 000×g離心10 min，收集上清液為組織勻漿液，參照試劑盒說明使用比色法檢測勻漿液中MDA、GSH含量和SOD活性以及Fe2＋含量。

1.9qRT-PCR檢測心肌組織鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)

使用Trizol試劑分離心肌組織中的總RNA，并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。用SYBR Green PCR Master Mix在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴增，測量所有基因的表達(dá)。PCR擴增條件如下（總體積25 μL）：55個循環(huán)，95 ℃變性5 min，50 ℃退火60 min，72 ℃延伸15 min。采用2－△△Ct法分析目的基因表達(dá)，并將目的基因的相對表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的相對表達(dá)量。引物序列詳見表1。

1.10Western Blot檢測心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1、ACSL4蛋白表達(dá)

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液從心肌組織中提取總蛋白，并使用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白。使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白質(zhì)試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。PVDF在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后在4 ℃下用適當(dāng)稀釋度的特異性一抗孵育過夜。用于實驗的一抗有GPX4（1∶1000）、Nrf2（1∶1 000）、FTH1（1∶1 000）、ACSL4（1∶1 000）、Lamin B1（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）。然后，將膜用HRP偶聯(lián)的二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h，并用增強的化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色。通過Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶的灰度值，并以Lamin B1、GAPDH為內(nèi)參蛋白，分析膜上目的蛋白相對表達(dá)量。

1.11統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1芒果苷對MIRI大鼠血清cTnI、LDH、CK水平的影響

與假手術(shù)組比較，MIRI組大鼠血清cTnI、CK和LDH水平升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組大鼠血清cTnI、CK和LDH水平降低（P＜0.05）；與芒果苷高劑量組比較，芒果苷低劑量組和芒果苷＋ML385組大鼠血清cTnI、CK和LDH水平升高（P＜0.05）。詳見表2。

2.2芒果苷對MIRI大鼠心肌組織病理損傷的影響

HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組心肌細(xì)胞形態(tài)均勻，心肌纖維結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)斷裂；MIRI組心肌結(jié)構(gòu)受損，心肌細(xì)胞腫脹、核固縮，心肌細(xì)胞減少，纖維排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤；與MIRI組比較，芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組上述病理變化明顯減輕，可見輕度細(xì)胞水腫，心肌細(xì)胞數(shù)量增加，少量心肌纖維斷裂和炎性細(xì)胞浸潤；與芒果苷高劑量組比較，芒果苷低劑量組和芒果苷＋ML385組心肌細(xì)胞排列較紊亂，炎性細(xì)胞浸潤增加。詳見圖1。

2.3芒果苷對MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

與假手術(shù)組比較，MIRI組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，凋亡率升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，凋亡率降低（P＜0.05）；與芒果苷高劑量組比較，芒果苷低劑量組和芒果苷＋ML385組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡率升高（P＜0.05）。詳見圖2、表3。

2.4芒果苷對MIRI大鼠心肌組織ROS水平的影響

與假手術(shù)組比較，MIRI組ROS水平升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組ROS水平降低（P＜0.05）；與芒果苷高劑量組比較，芒果苷低劑量組和芒果苷＋ML385組ROS水平升高（P＜0.05）。詳見圖3、表3。

2.5芒果苷對MIRI大鼠心肌組織SOD活性、MDA、GSH和Fe2＋含量的影響

與假手術(shù)組比較，MIRI組心肌組織MDA和Fe2＋含量升高，SOD活性和GSH含量降低（P＜0.05）；與MIRI組比較，芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組MDA和Fe2＋含量降低，SOD活性和GSH含量升高（P＜0.05）；與芒果苷高劑量組比較，芒果苷低劑量組和芒果苷＋ML385組MDA和Fe2＋含量升高，SOD活性和GSH含量降低（P＜0.05）。詳見表4。

2.6芒果苷對MIRI大鼠心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1、ACSL4 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，MIRI組心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1 mRNA水平降低，ACSL4 mRNA水平升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組Nrf2、GPX4、FTH1 mRNA水平升高，ACSL4 mRNA水平降低（P＜0.05）；與芒果苷高劑量組比較，芒果苷低劑量組和芒果苷＋ML385組Nrf2、GPX4、FTH1 mRNA水平降低，ACSL4 mRNA水平升高（P＜0.05）。詳見表5。

2.7芒果苷對MIRI大鼠心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1、ACSL4蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，MIRI組心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1蛋白水平降低，ACSL4蛋白水平升高（P＜0.05）；與MIRI組比較，芒果苷低劑量組、芒果苷高劑量組Nrf2、GPX4、FTH1蛋白水平升高，ACSL4蛋白水平降低（P＜0.05）；與芒果苷高劑量組比較，芒果苷低劑量組和芒果苷＋ML385組Nrf2、GPX4、FTH1蛋白水平降低，ACSL4蛋白水平升高（P＜0.05）。詳見圖4、表6。

3討論

本研究結(jié)果顯示，芒果苷干預(yù)降低了MIRI大鼠血清cTnI、CK和LDH水平，改善了心肌病理學(xué)變化，減少了心肌細(xì)胞凋亡，增強了抗氧化防御能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷可通過降低ROS、鐵和脂質(zhì)過氧化物的表達(dá)以及增加抗鐵死亡酶的表達(dá)抑制MIRI引起的心肌鐵死亡。鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)模式之一，其特征是鐵依賴性脂質(zhì)過氧化［2］。鐵死亡與多種心血管疾病有關(guān)，是心血管疾病的潛在治療靶點［13-14］。研究顯示，MIRI后產(chǎn)生大量ROS，F(xiàn)e2＋可以通過芬頓反應(yīng)增強ROS的產(chǎn)生，然后ROS會與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞鐵死亡［12］。鐵蛋白（FTH1、FTL）是一種鐵死亡抑制劑，可將Fe2＋氧化成三價鐵以避免芬頓反應(yīng)的發(fā)生［14］。ACSL4不僅是鐵死亡的敏感監(jiān)測器，而且是鐵死亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，其過表達(dá)誘導(dǎo)鐵死亡［15］。隨著對鐵死亡分子機制的日益了解，鐵死亡已成為心肌病潛在的診斷和治療靶點。本實驗結(jié)果顯示，MIRI后心肌組織中ROS、MDA水平和Fe2＋含量顯著增加，GSH含量和SOD活性明顯降低；qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，促進(jìn)鐵死亡的相關(guān)基因和蛋白（ACSL4）表達(dá)也顯著增加，抗鐵死亡基因和蛋白（GPX4、FTH1）表達(dá)顯著降低，表明MIRI誘導(dǎo)后大鼠心肌組織中鐵死亡增加。

GPX4是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵抗氧化酶，可特異性有效地去除磷脂過氧化氫，從而抑制鐵死亡［16］。研究顯示，在心肌梗死的早期和中期，GPX4的下調(diào)有助于心肌細(xì)胞的鐵死亡［5］。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子，在鐵死亡中起著至關(guān)重要的作用，GPX4、FTH1、FTL和FPN等基因均是參與鐵死亡的Nrf2靶基因［17-18］。Nrf2依賴的細(xì)胞防御機制在刺激后被激活，導(dǎo)致Nrf2與Keap1分離，促進(jìn)Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核以激活其下游基因［19-20］。在本研究中，MIRI大鼠心肌組織發(fā)生鐵死亡的同時伴隨著Nrf2（胞核）的下調(diào)，表明Nrf2核易位被抑制，導(dǎo)致抗鐵死亡基因和蛋白表達(dá)降低。多項研究證實，芒果苷主要通過激活Nrf2表現(xiàn)出藥理作用。芒果苷在體外和體內(nèi)可通過激活Nrf-2/血紅素加氧酶（HO-1）通路，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減輕MIRI［8］；還可通過激活Nrf2以減輕心臟纖維化［21］。因此，推測芒果苷對MIRI的保護作用可能與Nrf2-GPX4信號通路介導(dǎo)的鐵死亡有關(guān)。在本研究中，芒果苷應(yīng)用于MIRI大鼠后，Nrf2、GPX4和FTH1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均增加，表明Nrf2-GPX4軸被激活。為了驗證此結(jié)果，本研究在給予芒果苷干預(yù)的基礎(chǔ)上，使用Nrf2抑制劑ML385抑制Nrf2的核易位，結(jié)果顯示，ML385可明顯阻斷芒果苷對心肌鐵死亡的抑制作用，提示芒果苷可通過激活Nrf2-GPX4軸抑制鐵死亡，對MIRI發(fā)揮保護作用。

綜上所述，芒果苷可以通過調(diào)節(jié)Nrf2-GPX4軸抑制鐵死亡，從而減輕大鼠MIRI。本研究表明，芒果苷可作為一種潛在的鐵死亡抑制劑預(yù)防MIRI期間的鐵死亡，為芒果苷治療MIRI提供了堅實的基礎(chǔ)。在未來的研究中，將結(jié)合體外細(xì)胞實驗進(jìn)一步驗證芒果苷的抗鐵死亡作用及分子機制。

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（收稿日期：2022-05-31）

（本文編輯鄒麗）