趙霞 李元敏 李依民 胡曉晨 高靜 顏永剛 張崗

doi：10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.017

https：//doi.org/10.7606/j.issn.1004-1389.2024.07.017

收稿日期：2023-01-05? 修回日期：2023-03-07

基金項目：國家自然科學基金（82104334，81973430）；咸陽市中青年科技創(chuàng)新領軍人才（L2022CXNLRC009）；陜西中醫(yī)藥大學學科創(chuàng)新團隊項目（2019-QN01）。

第一作者：趙? 霞，女，碩士研究生，研究方向為分子生藥學。E-mail：2443284316@qq.com

李元敏，并列第一作者，女，碩士研究生，研究方向為分子生藥學。E-mail：1272151264@qq.com

通信作者：張? 崗，男，教授，研究方向為分子生藥學。E-mail：jay_gumling2003@aliyun.com

李依民，女，副教授，研究方向為分子生藥學。E-mail：2051058@sntcm.edu.cn

摘? 要? 旨在克隆獲得? RpMYB2、? RpMYB3、? RpMYB5、? RpMYB6基因ORF，并對其理化特性、系統(tǒng)進化關系、不同組織表達、激素與非生物脅迫下的表達等展開分析。研究結果表明，? RpMYB2、? RpMYB3、? RpMYB5、? RpMYB6依次編碼333、275、293、291個氨基酸，分子質量分別為34.781、30.525、31.243、33.313 ku，4個RpMYBs蛋白均為親水性蛋白并具有較高的熱穩(wěn)定性，除? RpMYB2外其余3個基因結構主要為? α-螺旋和無規(guī)則卷曲，且均定位于細胞核。由蛋白結構域和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，? RpMYB2、? RpMYB5含有1個HTH-MYB結構域，? RpMYB3、? RpMYB6含有2個HTH-MYB結構域，且不同MYB轉錄因子包含的保守元件數(shù)量及種類存在差異，系統(tǒng)進化分析顯示? RpMYB2、? RpMYB5屬于R1-MYB亞家族，? RpMYB3、? RpMYB6屬于R2R3-MYB亞家族，與其結構域分類一致。實時熒光定量結果顯示，根中? RpMYB2、? RpMYB6轉錄本豐度最高，?? RpMYB3、? RpMYB5基因分別在葉片、葉柄中高表達。經(jīng)200 μmol·L-1脫落酸 （abscisic acid， ABA）處理，? RpMYB5于24 h達峰值；200 μmol·L-1茉莉酸甲酯 （methyl jasmonate， MeJA）誘導?? RpMYB6 表達，表達量隨時間推移呈逐漸上升趨勢且于24 h最高（為0 h的10.30倍），抑制? RpMYB3表達；200 μmol·L-1水楊酸 （salicylic acid， SA）誘導? RpMYB6表達最為明顯，3 h表達量上調至? 0 h的21.84 倍。 RpMYBs 在非生物脅迫處理下表達也各有差異，? RpMYB2受高溫脅迫誘導表達，? RpMYB3在損傷、高溫脅迫下表達下調，? RpMYB5在損傷脅迫下表達受抑制，? RpMYB6響應高溫、鹽脅迫。

關鍵詞? 掌葉大黃；MYB；表達分析；脅迫；實時熒光定量PCR

轉錄因子在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，通常通過與靶基因啟動子區(qū)域中的相關順式作用元件相互作用，參與基因表達調控［1］。在眾多的轉錄因子中，MYB存在于所有真核生物中，功能多樣且廣泛參與到植物生長、發(fā)育、防御及次生代謝調控等生理過程。 ZmMYBC1是植物中第一個被發(fā)現(xiàn)的MYB轉錄因子［2］，與玉米花青素的生物合成密切相關。近年來，越來越多的植物MYB家族成員相繼被報道，如擬南芥［3］、過路黃［4］、辣椒［5］中分別鑒定出197、51、172個MYB轉錄因子。

通常，MYB蛋白在N端有一段高度保守的DNA結構域，該結構域由50～53個氨基酸殘基的重復片段（R）組成［6-7］，依據(jù)包含的R結構數(shù)目又分為4個亞類：4R-MYB，最小的MYB亞家族，相關報道較少；3R-MYB（R1R2R3-MYB），植物中家族成員較少，主要參與調控細胞周期［8-9］；R2R3-MYB，植物MYB基因編碼蛋白中最豐富的一類，在初生與次生代謝、激素應答以及植物對逆境脅迫的響應等方面具有重要功能［10］；R1-MYB是植物中第二大類MYB亞家族，在細胞形態(tài)建成、染色體結構維持、根毛形成、生物鐘調節(jié)等生命過程具有重要調控作用［11］。諸多研究表明，MYB轉錄因子參與調控苯丙烷類次生代謝，如? McMYB4通過調節(jié)苯丙烷代謝和激素信號傳導，參與蘋果響應溫度變化的非生物抗性和生長［12］；白楊中? PtoMYB156參與調控苯丙烷途徑和次生細胞壁的初步形成［13］；? AtMYB4通過苯丙烷代謝途徑參與調節(jié)擬南芥中花粉壁的形成［14］。

掌葉大黃（Rheum palmatum? L.）是目前中國最為正宗、名貴的中藥材大黃屬三基源植物之一，以其干燥根、根莖為藥用，味苦、性寒，主治瀉下，清熱瀉火，涼血解毒，利濕祛黃［15］，主要分布于甘肅、青海等高海拔地區(qū)。蒽醌類是大黃的主要活性物質，具有保肝、抗腫瘤、抗氧化等作用，其成分積累是影響大黃品質的重要因素［16］。研究發(fā)現(xiàn)部分MYB轉錄因子負調控苯丙烷代謝［17］，Perassolo等［18］闡明有效抑制莽草酸途徑中苯丙氨酸解氨酶活性可改變代謝流，活化蒽醌類成分合成途徑進而導致蒽醌類成分累積。但是，MYB基因家族在掌葉大黃中是否參與調控蒽醌類化合物的合成還有待研究。李元敏［19］對1 a生掌葉大黃根、根莖和葉片進行比較轉錄組測序分析（SRR10855670），篩選到6條組織差異性表達且包含完整開放閱讀框（ORF）的MYB轉錄因子序列。本研究通過RT-PCR克隆得到4個MYB家族成員基因，并對其進行生物信息學、激素和非生物脅迫響應分析，有助于深入探討MYB基因在植物防御反應中的重要作用，為揭示大黃中蒽醌類活性成分合成與積累的調控機制及通過遺傳工程改良藥材品質奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材? 料

植物材料為1 a生掌葉大黃 （R. palmatum L.）及其成熟種子，2019年10月采集于甘肅省隴南市宕昌縣阿塢鄉(xiāng)麻界村，陜西中醫(yī)藥大學胡本祥教授對其進行鑒定。取大黃根、根莖、葉、葉柄及種子等樣品并置于液氮中速凍后，于-80 ℃冰箱保存。

基于黑小斌等［20］建立的大黃無菌苗體系培育出掌葉大黃無菌苗，參考李元敏等［21］的方法進行植物激素與非生物脅迫處理。選取生長旺盛、生長均勻的1月齡幼苗，激素處理組：噴施200 μmol·L-1茉莉酸甲酯 （MeJA）、200 μmol·L-1水楊酸 （SA）、200 μmol·L-1脫落酸 （ABA）；非生物脅迫處理組：包括干旱（10% PEG6000）、機械損傷（針刺葉片）、鹽（100?? mmol·L-1 NaCl）、低溫（4? ℃）、高溫（40? ℃）；此外，噴施純溶劑模擬激素對照組，噴灑無菌水作為脅迫對照組；所有樣品均于處理后1、3、6、12和24? h進行取樣，0 h為空白對照，每個處理組的每個處理時間作3個樣本重復，用液氮速凍后于-80? ℃冰箱保存。

1.2? 總RNA提取及cDNA合成

采用RN38-EASYspin Plus RNA試劑盒（艾德萊，中國北京）提取大黃各樣品總RNA，K5800自動檢測超微量分光光度計（凱奧，中國北京）測定質量，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。按說明書操作，利用PrimeScriptTM?? RT Master Mix反轉錄試劑盒（TaKaRa，日本）合成cDNA，-20 ℃保存。

1.3? 基因克隆

利用Primer Premier 5.0對篩選到的4條MYB轉錄因子序列設計跨ORF引物 （表1）。25 μL標準體系為：12.5 μL 2×Rapid Taq Master Mix、1 μL Forward Primer、1 μL Reverse Primer和1 μL cDNA，并用9.5 μL ddH2O補齊。PCR條件為：95? ℃ 5 min；95? ℃ 30 s，60? ℃?? 30 s，72? ℃ 2 min，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min，15? ℃保溫。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。隨后用50 μL體系進行擴增、DNA膠回收試劑盒（TianGen，中國北京）純化回收目的片段，與pUC19連接后并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取陽性克隆送上海生工完成測序。

1.4? 生物信息學分析

利用軟件及在線工具對掌葉大黃 RpMYBs 進行生物信息分析預測（表2）。

1.5? 基因表達模式

利用實時熒光定量PCR檢測 RpMYBs 在大黃不同樣品中基因表達。以β-actin為內參基因［22］，qPCR引物序列見表1。反應體系20 μL：包括10 μL TB Green○R? Premix Ex TaqTM? Ⅱ （TliRNaseHPlus） （2×）、Forward/Reverse Primer各0.8 μL、2 μL cDNA、0.4 μL ROX Reference Dye （50×）、6 μL ddH2O。反應程序為：95? ℃ 30 s；95? ℃ 5 s，60? ℃ 30 s，60? ℃ 34 s，40個循環(huán)；之后繪制熔解曲線，條件為95? ℃ 15 s，? 60? ℃ 1 min，95? ℃ 15 s。設置3次技術和試驗重復，包括不加模板的對照。用Step One Plus○R Real-Time （Applied Biosystems，美國）儀器進行qPCR檢測，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct計算基因相對表達量［23］，以SPSS? 24軟件進行統(tǒng)計分析，P<0.05代表有顯著性差異。

2? 結果與分析

2.1? 基因克隆

基于陜西中醫(yī)藥大學藥學院中藥資源與開發(fā)課題組前期篩選到的MYB基因家族成員，本研究對其中4條包含完整開放閱讀框（ORF）的MYB轉錄因子序列進行基因克隆研究。提取掌葉大黃全株的總RNA，以反轉錄的cDNA為模板，采用高保真DNA聚合酶進行RT-PCR擴增，產(chǎn)物各取5 μL經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別獲得4條清晰且特異性較好的條帶 （圖1），轉錄組數(shù)據(jù)與PCR產(chǎn)物大小相符且與克隆測序ORF序列吻合，基因命名為? RpMYB2、? RpMYB3、? RpMYB5、? RpMYB6 （注冊號 MW269444、MW269445、MW269447、MW269448） （表3）。

2.2? 蛋白理化特性及結構域分析

利用ProtParam分析RpMYB2、RpMYB3、RpMYB5、RpMYB6蛋白序列的一級結構發(fā)現(xiàn)（表4），蛋白的分子質量在30.525 （RpMYB3）～34.781 （RpMYB2） ku，等電點為6.18～9.14，

其中，RpMYB2、RpMYB3屬堿性蛋白，RpMYB5、RpMYB6屬酸性蛋白。4個MYB蛋白的平均親水性是負值，說明其均為親水性蛋白。二級結構預測結果顯示，RpMYB2、RpMYB3、RpMYB5、RpMYB6均由α-螺旋（alphahelix， Hh）、延伸鏈 （extendedstrand，Ee）、β-轉角 （betaturn，Tt） 和無規(guī)卷曲 （random coil，Cc） 組成，其中，RpMYB3、RpMYB5、RpMYB6主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲構成，而RpMYB2主要由延伸鏈和無規(guī)卷曲構成。亞細胞定位結果顯示其均定位于細胞核，SignalP-5.0和TMHMM在線分析表明RpMYB2屬于跨膜蛋白，其余3個均無跨膜結? 構域。

借助InterProScan與PROSITE對RpMYBs蛋白結構域分析預測結果一致（圖2），顯示RpMYB2、RpMYB5含有1個HTH-MYB結構域，屬于R1-MYB亞族，RpMYB3、RpMYB6是典型的R2R3-MYB，含有2個HTH-MYB結構。

2.3? 系統(tǒng)進化分析

從NCBI和PlantTFDB數(shù)據(jù)庫下載擬南芥、大豆、丹參、水稻、玉米、苦蕎麥、羊草7種植物MYB蛋白序列進行多序列比對，篩選出相似度較高的序列，采用MEGA7軟件中的鄰接法進行MYB蛋白分子演化分析。圖3結果表明，RpMYB2與RpMYB5被劃入R1-MYB家族，且RpMYB2與GmMYB176、RpMYB5與OsMYBS1蛋白序列相似性最高；RpMYB3與RpMYB6屬于R2R3-MYB類型的家族成員，RpMYB3與FtMYB15、RpMYB6與擬南芥S20亞家族中AtMYB62/116同源性較高，可能具有相似的生物學功能。

2.4? 保守基序分析

利用在線軟件MEME對掌葉大黃4個MYB蛋白序列進行保守基序分析（圖4）。結果表明，不同亞類的MYB基因包含的保守元件數(shù)量及種類存在差異。4個MYB序列中均包括Motif1，且存在3個均勻分布的氨基酸 （W） 殘基，可能是掌葉大黃MYB轉錄因子的特征基序，但每條序列中Motif所處位置不同，RpMYB3和RpMYB6中Motif1均位于近N端且與Motif2相鄰，而RpMYB2和RpMYB5中Motif1單獨位于序列中間區(qū)段內。Motif3是R2R3亞族的特征基序，Motif4是R1亞族的特征基序，二者均含有6個氨基酸殘基，是最短基序。Motif2是最長基序，包括48個氨基酸殘基。

2.5? 組織表達特異性

以根為參考樣本，qPCR檢測4個 RpMYBs 基因在大黃根、根莖、葉片、葉柄和種子中的表達情況。從圖5可以看出，? RpMYB2在根中高表達，葉柄中低表達；? RpMYB3在種子中表達量最低，但在葉片中表達量為根中的4.39倍；相反的，? RpMYB5在葉片中的表達量僅為根中的0.36倍，而在葉柄中表達量高；? RpMYB6在根中表達量最高，在其余器官中均較低。

2.6? 激素應答分析

分析MYB基因于MeJA、SA、ABA激素處理下不同時間點 （1、3、6、12、24 h） 的應答情況 （圖6），以0 h（CK）為對照：? RpMYB2受SA誘導，相對表達量隨時間推移呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，同Mock變化趨勢一致，且于24 h最高，為CK的3.57倍；MeJA處理1 h、3 h顯著上調基因表達；ABA處理1 h顯著上調，12 h、24 h受到顯著抑制。

RpMYB3受MeJA抑制表達，相對表達量隨時間推移呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢，其中1、3、6 h與Mock相比表達量無差異，但于12 h最低，為CK的0.08倍；同樣，SA處理12 h顯著抑制基因表達；ABA處理24 h顯著上調，6 h下調表達。

RpMYB5受SA誘導，相對表達量呈先上升后下降再上升的變化趨勢，24 h最高且與Mock相比無明顯變化；ABA處理也于24 h顯著上調基因表達；MeJA處理1 h顯著誘導。

RpMYB6受MeJA誘導，相對表達量隨時間推移呈逐漸上升趨勢，且于24 h最高，為CK的10.30倍；SA處理3 h顯著誘導表達且為CK的21.84倍，ABA處理6 h、12 h、24 h誘導表達，1 h抑制表達。

2.7? 非生物脅迫響應

分析掌葉大黃無菌苗于不同脅迫處理下 RpMYBs 基因在不同時間點 （1、3、6、12、24 h） 的響應情況 （圖7），以0 h為對照：

RpMYB2受高溫脅迫誘導，相對表達量于24 h達峰值，且為CK的5.19倍；損傷脅迫3 h顯著誘導，為CK的2.44倍，1 h顯著抑制；干旱、低溫、鹽脅迫表達水平未見明顯變化。

RpMYB3受損傷脅迫抑制表達，相對表達量于3 h達谷值，為CK的0.30倍；干旱和低溫處理均在24 h受到顯著抑制；相反，鹽和高溫處理均在24 h顯著誘導。

RpMYB5受損傷脅迫抑制表達，相對表達量于24 h達谷值，為CK的0.14倍；干旱和高溫脅迫均在1 h、24 h誘導表達；鹽脅迫于12 h顯著抑制；低溫脅迫于3 h、6 h抑制表達。

RpMYB6受高溫脅迫誘導，相對表達量隨時間推移呈先上升后下降再上升的變化趨勢，且于24 h達峰值，為CK的4.68倍；受鹽、損傷脅迫抑制，均在24 h達谷值，且都為CK的0.09倍；干旱和低溫脅迫均在3 h上調表達。

3? 討? 論

MYB蛋白是植物生長發(fā)育、代謝、防御和應激反應調控網(wǎng)絡中的關鍵因素［24］。鑒于此，對該類基因的研究不斷從模式植物向主要農(nóng)作物、藥用植物、園藝植物等方向擴展，包括擬南芥［7］、小麥［25］、丹參［26］、棗樹［27］等。本研究利用RT-PCR技術從掌葉大黃中克隆到? RpMYB2、? RpMYB3、? RpMYB5和? RpMYB6的ORF序列，其中? RpMYB2編碼跨膜蛋白，可能介導細胞與外界之間的信號轉導，并參與細胞膜內外物質、能量及信號的交換［28］，其余3個屬于非跨膜蛋白。4個目標序列均具有熱穩(wěn)定性和親水性，對其進行亞細胞定位預測均為核蛋白，推測基因主要在細胞核內行使功能。

進化樹分析主要用于基因家族成員分類及進化關系研究，有助于推測親緣關系密切相關的蛋白家族成員的生物學功能。 RpMYBs 與其他7種植物MYBs的分子進化分析表明，這些MYBs可分為兩個亞族，即R1-MYB和R2R3-MYB。其中? RpMYB2和? RpMYB5具有同源性，歸屬于R1-MYB亞族。? RpMYB2與? GmMYB176關系最近，R1-MYB轉錄因子? GmMYB176可調節(jié)大豆中異黃酮積累增加的關鍵基因? CHS8基因表達，從而促進異黃酮生物合成［29］，推測? RpMYB2可能作用于苯丙烷類生物代謝途徑。同時? RpMYB2與? LcMYB2聚在一大支，猜測其可能具有干旱和ABA處理下促進種子萌發(fā)和根系生長的功能［30］。?? RpMYB5與? OsMYBS1親緣關系密切，而? OsMYBS1可抑制葡萄糖傳導因子HXK1的表達，使ABA活力下降，繼而促進種子發(fā)芽及幼苗的早期發(fā)育［31］；類似地，? RpMYB3和? RpMYB6具有同源性，并且聚集在R2R3-MYB亞家族。?? RpMYB3與? FtMYB15親緣關系最近，推測其可能一定程度上參與植物花青素合成的調控［32］。? RpMYB6與擬南芥S20亞家族成員? AtMYB62和? AtMYB116聚在一支，可能通過赤霉素信號通路調節(jié)磷脅迫反應［33］。然而，4個RpMYBs是否參與調控大黃蒽醌類化合物合成仍有待深入研究。

基因結構是決定基因功能的前提。分析RpMYBs蛋白結構域和保守基序發(fā)現(xiàn)，同一亞家族含有相似的結構域和保守基序。R1-MYB類蛋白中所含Motif數(shù)量與分布不同，表明R1-MYB類轉錄因子的空間位置保守性相對較低。而R2R3-MYB類蛋白中Motif類型和分布情況均較為相似，表明其在R2R3-MYB中的分布不具有隨機性，但具有較高的保守性，推測其在植物體內發(fā)揮核心調控功能。MYB轉錄因子家族雖在序列特征上相對保守，但在不同物種不同器官中功能呈現(xiàn)多樣化。擬南芥中? AtMYB33、? AtMYB65和? AtMYB101可促進花藥和花粉發(fā)育［34］。? MoMYB53于葉中高表達，參與調控巴戟天子葉中黃酮醇的合成［35］。本研究采用SYBRGreen實時熒光定量PCR方法，測定 RpMYBs基因在1 a生掌葉大黃不同組織中的相對表達量，揭示? RpMYB2、? RpMYB6在根中高表達特性，推測可能通過調控大黃藥用部位根的生長發(fā)育及次生代謝進而影響大黃藥材品質；? RpMYB3、? RpMYB5分別在葉片、葉柄中高表達，可能在地上部分的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的調控作用。葉片直接暴露于大氣中，受到陽光和溫差變化的影響大，根深埋地下，受到土壤微生態(tài)顯著影響，這勢必導致MYB基因在表達水平做出響應，從而可能在植物適應環(huán)境和介導次生代謝產(chǎn)物合成方面發(fā)揮重要作用。

MYB類轉錄因子廣泛參與植物對非生物脅迫的響應，如調控生長發(fā)育，影響代謝產(chǎn)物的合成和影響激素信號等［36］。擬南芥? AtMYB41通過促進ABA積累參與植物脅迫反應［37］。? CaMYB306通過調控MDA和H2O2含量、ROS清除酶活性及抗性相關基因的表達，負調控辣椒對低溫的響應［38］。? MYB96既能通過CBFs途徑參與低溫反應，又能通過ABA的信號通路調節(jié)其抗旱性［39］。本研究結果表明4個大黃 RpMYBs響應激素和非生物脅迫ABA處理導致? RpMYB2表達下調，而高溫脅迫下24 h時顯著誘導其表達，說明? RpMYB2可能通過ABA信號通路參與高溫脅迫應答。MeJA處理? RpMYB6顯著上調表達，且受低溫、高溫脅迫誘導表達。MeJA是植物CBF/DREB1冷脅迫響應途徑的早期關鍵信號［24］，而 RpMYB4［20］在MeJA和低溫脅迫處理下均下調表達，可能參與MeJA負調控凍害脅迫的耐受過程。? RpMYB2和? RpMYB4可能響應冷脅迫轉錄調控網(wǎng)絡，更好地維持大黃生存，同時也為激素和冷信號通路互相協(xié)調傳遞和響應寒冷信號的作用機制提供了新的理論基礎。? RpMYB3受MeJA應答和高溫脅迫響應表達趨勢一致，均在12 h達谷值后緩慢恢復，可能通過MeJA信號傳遞正調控高溫脅迫應答。? RpMYB5可能通過ABA和SA信號途徑共同負調控大黃的機械損傷脅迫防御。 RpMYBs 基因響應激素和非生物脅迫差異表達，表明它們可能通過參與多種生物學過程的調節(jié)影響掌葉大黃的生理? 代謝。

4? 結? 論

基于掌葉大黃轉錄組數(shù)據(jù)，對掌葉大黃MYB轉錄因子進行基因克隆、生物信息學研究，并合理預測了其在掌葉大黃中的部分功能，為進一步揭示 RpMYBs 基因功能探究其生理機制奠定基礎，也為掌葉大黃蒽醌類成分合成調控及遺傳改良提供科學支撐。

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Molecular Cloning and Stress Expression of Four MYB

Transcription Factors in? Rheum palmatum

ZHAO Xia1，2， LI Yuanmin1，3， LI Yimin1，2， HU Xiaochen1，2， GAO Jing1，2， YAN Yonggang1，2 and? ZHANG Gang1，2

（1.College of Pharmacy and Shaanxi Qinling Application Development and Engineering Center of Chinese Herbal

Medicine，Shaanxi University of Chinese Medicine， Xian? 712046， China; 2.Key Laboratory for Research and

Development of? “Qin Medicine”?? of Shaanxi Administration of Traditional Chinese Medicine， Shaanxi

University of Chinese Medicine， Xian? 712046，China; 3.The Second Affiliated Hospital

of Shaanxi University of Chinese Medicine， Xian? 712046， China）

Abstract? In this study，we searched the transcriptome database to obtain the sequence information of four MYB gene family members，?? RpMYB2，?? RpMYB3，?? RpMYB5 and?? RpMYB6 genes. The corresponding physicochemical properties， phylogenetic relationships， tissue-specific expression， and induced expression under hormonal and abiotic stresses were analyzed. The results showed that?? RpMYB2，?? RpMYB3，?? RpMYB5 and?? RpMYB6 encoded 333， 275， 293 and 291 amino acids with molecular masses of 34.781， 30.525， 31.243 and 33.313 ku， respectively， and the four RpMYBs proteins were all hydrophilic proteins with high thermal stability， except for?? RpMYB2. The remaining three gene structures were mainly α-helix and randomly coiled， and all of them were localized in the nucleus. Analysis of the protein structural domains and conserved motifs revealed that?? RpMYB2 and?? RpMYB5 contained one HTH-MYB structural domain， and?? RpMYB3 and?? RpMYB6 contained two HTH-MYB structural domains， and there were differences in the number and types of conserved elements contained in different MYB transcription factors. Phylogenetic analysis showed that?? RpMYB2 and?? RpMYB5 belonged to the R1-MYB subfamily， and?? RpMYB3 and?? RpMYB6 belonged to the R2R3-MYB subfamily， consistent with their structural domain classification. The protein structural domains and phylogenetic trees consistently indicated that?? RpMYB2 and?? RpMYB5 belonged to the R1-MYB subfamily， and?? RpMYB3 and?? RpMYB6 belonged to the R2R3-MYB subfamily. Real-time fluorescence quantification revealed that?? RpMYB2 and? ?RpMYB6 were the most highly expressed in roots， and?? RpMYB3 and?? RpMYB5 were highly expressed in leaves and petioles. Respectively，?? RpMYB5 peaked at 24 h when treated with 200 μmol·L-1 abscisic acid （ABA）. The highest expression of?? RpMYB6 was induced by 200 μmol·L-1 methyl jasmonate （MeJA）， and the expression level increased gradually with time and was 10.30 times higher at 24 h than at 0 h， and inhibited?? RpMYB3 expression. 200 μmol·L-1 salicylic acid （SA） induced the most pronounced expression of ??RpMYB6 at 21.84 fold. The expression of? RpMYBs? also varied under abiotic stress treatments.?? RpMYB2 was induced by high temperature.?? RpMYB3 was inhibited by damage and high temperature.?? RpMYB5 was inhibited by damage stress.?? RpMYB6 responded to high temperature and salt stress response. This study provides a foundation for the functional identification of RpMYBs ， which will be useful for the development of germplasm innovation and molecular breeding of R. palmatum L.

Key words? ?Rheum palmatum; MYB; Expression analysis; Stress; qRT-PCR

Received ??2023-01-05??? Returned? 2023-03-07

Foundation item? National Natural Science Foundation of China（No.82104334，No.81973430）; Middle Youth Science and Technology Innovation Leaders of Xianyang Municipality （No.L2022CXNLRC009）;Project for Discipline Innovation Team of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine（No.2019-QN01）.

First author? ZHAO Xia， female，master student.Research area：molecular biopharmacology.?? E-mail：2443284316@qq.com

LI Yuanmin， female，master student.Research area：molecular biopharmacology.E-mail：1272151264@qq.com

Corresponding?? author? ZHANG Gang，male，professor.Research area：molecular biopharmacology.? E-mail：jay_gumling2003@aliyun.com

LI? Yimin，female，associate professor.Research area：molecular biopharmacology.E-mail：2051058@sntcm.edu.cn

（責任編輯：郭柏壽? Responsible editor：GUO Baishou）