【摘 要】 目的：建立雙山顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則相關(guān)方法，建立鑒別雙山顆粒中山藥、山萸肉、肉蓯蓉3味飲片的薄層色譜（TLC）法；建立高效液相色譜（HPLC）法分析雙山顆粒中莫諾苷和松果菊苷的含量。結(jié)果：TLC法能有效鑒別方中3味飲片；定量分析方法中，莫諾苷、松果菊苷質(zhì)量濃度分別在17.49～291.56 μg·mL-1、16.46～274.28 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為92.66%（RSD為0.81%）、104.26%（RSD為0.74%）。結(jié)論：建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡便準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于雙山顆粒的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】 雙山顆粒；莫諾苷；松果菊苷；薄層色譜法；高效液相色譜法

【中圖分類號】R284.1"" 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2024）15-0039-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.15.zgmzmjyyzz202414010

Research on the Quality Standard of Shuangshan Granules

Abstract：Objective To establish the quality standard of Shuangshan Granules. Methods According to the relevant methods presented in the fourth general rules of Pharmacopoeia of the Peoples Republic of China （2020），a TLC method was established to identify 3 Chinese medicinal materials in Shuangshan Granules，including Dioscoreae Rhizoma，Corni Fructus and Cistanches Herba; Establish an HPLC method for analyzing the content of Morroniside and Echinacoside in Shuangshan granules. Results TLC method can effectively identify three decoction pieces in the formula; Morroniside and Echinacoside concentration graph respectively showed a good linear relationship at a range of 17.49-291.56 μg·mL-1 and 16.46-274.28 μg·mL-1，with average sample recovery rates of 92.66% （RSD 0.81%） and 104.26% （RSD 0.74%），respectively. Conclusion The established quality standard is simple，accurate，and has strong specificity，and can be used for the quality control of Shuangshan granules.

Key-words：Shuangshan Granules; Morroniside; Echinacoside; Thin Layer Chromatography; High Performance Liquid Chromatography

阿爾茨海默?。╝lzheimers disease，AD）俗稱老年癡呆，是一種神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙［1］。隨著人口老齡化加速，AD的發(fā)病率、患病率及死亡率顯著上升，因AD帶來的照護(hù)壓力，已成為困擾我國城鄉(xiāng)居民的重大醫(yī)療和社會問題［2］。目前AD發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，相關(guān)藥物研發(fā)進(jìn)展緩慢，因此，開發(fā)有關(guān)防治AD的藥物，為臨床藥物治療提供新選擇和控制疾病流行具有重要意義［3］。雙山顆粒為新疆維吾爾醫(yī)多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，處方由山藥、山萸肉、肉蓯蓉3味藥組成，用于改善老年癡呆癥狀和延緩疾病發(fā)展［4-6］。處方中山藥為薯蕷科植物薯蕷的干燥根莖［7］，也稱懷山藥；山萸肉為山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果實(shí)；肉蓯蓉為列當(dāng)科植物管花肉蓯蓉的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，是維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材［8］。新疆是管花肉蓯蓉的主產(chǎn)地，主要集中在和田地區(qū)，但目前在新疆以管花肉蓯蓉為原料的藥品仍存在空缺［9-10］。雙山顆粒原方組成明確，臨床效果顯著，但未建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，成品質(zhì)量不可控。為發(fā)揮民族藥療效優(yōu)勢，現(xiàn)擬將雙山顆粒開發(fā)為1.1類中藥創(chuàng)新藥，目前處于臨床前研究階段。本文按照中藥新藥研究技術(shù)規(guī)范及《中國藥典》2020年版規(guī)定，對雙山顆粒處方中3味藥材進(jìn)行了薄層色譜（thin layer chromatography）法鑒別研究，對處方中的莫諾苷、松果菊苷進(jìn)行了含量測定方法的研究，建立雙山顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有效控制該制劑質(zhì)量，以期為其臨床用藥安全提供保障，也為促進(jìn)新疆特色植物藥、民族藥發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 infinity Ⅱ（美國安捷倫科技有限公司）；BS110S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司，感量：0.0001 g）；AB135-S型電子天平［梅特勒-托利多（上海）有限公司，感量：0.00001 g］；WP-UP-WF-20型超純水機(jī)（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東省鄄城永興儀器廠）；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；DZF型真空干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW-80高速萬能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；TDL-5-W型臺式低速離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；DZKEW-4型電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；WFH-201B紫外透射反射鏡（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；銀龍硅膠G薄層板（煙臺華陽新材料科技有限公司）；聚酰胺薄層板（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。

1.2 試藥 雙山顆粒（自制，批號：20230220-1、20230220-2、20230221-1、20230221-2、20230222-1、20230222-2、20230223、20230604、20230605）；山藥對照藥材（批號：121137-201807）、山茱萸對照藥材（批號：121495-202004）、肉蓯蓉對照藥材（批號：121276-201903）、莫諾苷對照品（批號：111998-202205，含量以96.8%計）、松果菊苷對照品（批號：111670-201907，含量以91.8%計）、馬錢苷對照品（批號：111640-201808，含量以99.0%計）、毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201914，含量以95.2%計）、絲氨酸對照品（批號：140688-202104，含量以 C3H7NO3計為 100.0%）、丙氨酸對照品（批號：140680-202005，含量以 C3H7NO2計為 99.9%）、亮氨酸對照品（批號：140687-201905，含量以 C6H13NO2計為 99.9%）、纈氨酸對照品（批號：140681-202204，含量以 C5H11NO2計為 99.8%）均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜乙腈（美國Fisher）；其他試劑均為分析純。

2方法

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 山藥 取本品5 g，研細(xì)，加水50 mL，加熱至沸，放冷，離心，取上清液作為供試品溶液。取缺山藥的顆粒同法制得陰性對照溶液。取山藥對照藥材2 g，加水50 mL，加熱至沸，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?.5 mL溶解，作為對照藥材溶液。取絲氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸對照品，加水制成每1 mL各含1 mg的混合對照品溶液。按照TLC法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則0502）實(shí)驗(yàn)，吸取上述混合對照品溶液1 μL、對照藥材溶液2 μL、供試品溶液和陰性對照溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正丁醇-冰醋酸-水（2∶1∶1）為展開劑，展開，晾干，噴以茚三酮試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視。

2.1.2 山萸肉 取本品4 g，加甲醇40 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取缺山萸肉顆粒同法制成陰性對照溶液。取山茱萸對照藥材0.5 g，加甲醇10 mL，同法制得山茱萸對照藥材溶液。取莫諾苷、馬錢苷對照品，加甲醇制成每1 mL各含2 mg的對照品溶液。按照TLC法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則0502）實(shí)驗(yàn)，吸取對照品溶液和陰性對照品溶液各2 μL，供試品溶液4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇（3：1）為展開劑，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇試溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.1.3 肉蓯蓉 取本品4 g，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至近干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取缺肉蓯蓉顆粒同法制成陰性對照溶液。取肉蓯蓉對照藥材1 g，加甲醇20 mL，同法制得肉蓯蓉對照藥材溶液。取松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品，加甲醇制成1 mL各含1 mg的對照品溶液。按照TLC法（《中華人民共和國藥典》2020年版通則0502）實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄層板上，以甲醇-冰醋酸-水（2∶1∶7）為展開劑，展開，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（C）-0.3%磷酸溶液（A），梯度洗脫（0～24 min，6.5% C；24～60 min，6.5% C→18% C；60～70 min，18% C→30% C；70～75 min，6.5% C）；流速為1 mL·min-1；檢測波長分別為240 nm、330 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按松果菊苷計算不低于3000。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取莫諾苷、松果菊苷對照品適量，用50%甲醇制成上述成分質(zhì)量濃度分別為0.583 mg·mL-1、0.548 mg·mL-1的對照品溶液。精密移取上述各成分對照品溶液1 mL，置于同一10 mL棕色量瓶中，以50%甲醇定容，即得混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取雙山顆粒適量，研細(xì)，取粉末1g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，超聲（功率100 W，頻率40 kHz）處理30 min；放冷，用50%甲醇定容，搖勻，取適量離心（6000 r·min-1，10 min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照品溶液的制備 按雙山顆粒處方和工藝制備缺山萸肉、缺肉蓯蓉的單一陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得單一陰性對照品溶液。

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 專屬性考察 取“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下的混合對照品、供試品、陰性對照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖。

2.2.5.2 線性關(guān)系考察 分別精密移取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液0.3 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸。

2.2.5.3 精密度考察 取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分峰面積，計算RSD值。

2.2.5.4 重復(fù)性考察 精密稱取雙山顆粒（20230220-2）6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并采用外標(biāo)法計算含量，計算RSD值。

2.2.5.5 穩(wěn)定性考察 精密稱取雙山顆粒（20230220-2）1份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h后，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并采用外標(biāo)法計算含量，計算RSD值。

2.2.5.6 日間精密度 考察精密稱取雙山顆粒（20230220-2）2份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在連續(xù)5 d的時間內(nèi)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行重復(fù)測定，記錄峰面積并采用外標(biāo)法計算含量，計算RSD值。

2.2.5.7 耐用性考察 精密稱取雙山顆粒（20230220-2）2份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別用3個不同品牌的色譜柱，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并采用外標(biāo)法計算含量。

2.2.5.8 加樣回收率 考察精密稱取雙山顆粒（20230220-2）6份，每份0.5 g，置于25 mL量瓶種；按各成分已知含量的100%加入相應(yīng)對照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。

2.2.5.9 含量測定 取自制7批雙山顆粒（20230220-1、20230220-2、20230221-1、20230221-2、20230222-1、20230222-2、20230223），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積并采用外標(biāo)法計算每批樣品中莫諾苷、松果菊苷的含量。

3 結(jié)果

3.1 薄層色譜鑒別

3.1.1 山藥 供試品色譜中，在與對照品、對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，且陰性對照品無干擾。如圖1所示。

3.1.2 山萸肉 供試品色譜中，在與對照品、對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，且陰性對照品無干擾。如圖2所示。

3.1.3 肉蓯蓉 供試品色譜中，在與對照品、對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，且陰性對照品無干擾。如圖3所示。

3.2 含量測定

3.2.1 專屬性考察 供試品色譜中，在與對照品溶液相同保留時間內(nèi)出現(xiàn)莫諾苷、松果菊苷色譜峰，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。如圖4所示。

3.2.2 線性關(guān)系考察 莫諾苷對照品溶液在濃度

17.49～291.56 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程：Y=18.049X+50.134（R=0.9999）。松果菊苷對照品溶液在濃度16.46～274.28 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，回歸方程：Y = 14.704X + 11.743，（R=0.9997）。

3.2.3 精密度考察 莫諾苷、松果菊苷峰面積RSD值分別為0.18%、0.38%（n=6），表明儀器精密度良好。

3.2.4 重復(fù)性考察 供試品溶液中莫諾苷、松果菊苷含量的RSD分別為0.61%、0.20%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.5 穩(wěn)定性考察 供試品溶液中莫諾苷、松果菊苷含量RSD值分別為2.06%、2.21%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.6 日間精密度考察 供試品溶液中莫諾苷、松果菊苷含量RSD值0.98%、0.77%（n=5），表明該方法準(zhǔn)確可靠。

3.2.7 耐用性考察 當(dāng)色譜柱發(fā)生變化時，對測定結(jié)果影響較小，表明該方法耐用性較好。見表1。

3.2.8加樣回收率考察 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合要求。見表2。

3.2.9 含量測定 自制7批樣品中莫諾苷、松果菊苷含量穩(wěn)定，根據(jù)測定結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)數(shù)據(jù)，暫定莫諾苷含量不得少于2.6018 mg·g-1、松果菊苷含量不得少于2.0163 mg·g-1。見表3。

3 討論

山藥的薄層色譜鑒別一般使用山藥對照藥材，本研究對多種供試品制備方法和展開系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果均不理想?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究［11-12］表明，山藥含有淀粉、氨基酸、多糖等多種藥理活性成分，其中氨基酸包括必需氨基酸和非必須氨基酸共18種。且有研究［13-14］表明，人腦內(nèi)氨基酸水平與老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，故考慮采用4種氨基酸對照品和對照藥材作為對照，對山藥進(jìn)行薄層鑒別。查閱《中華人民共和國藥典》2020年版（一部）有關(guān)氨基酸的薄層鑒別方法，發(fā)現(xiàn)藥材“地龍”項(xiàng)下氨基酸薄層鑒別中樣品制備方法簡單易操作，故參考此樣品制備方法和展開條件，并做適當(dāng)調(diào)整，對山藥進(jìn)行薄層鑒別研究。最終選定亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、絲氨酸作為主要鑒別成分，結(jié)果表明所得薄層斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對照品無干擾，考慮納入顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。山萸肉的薄層鑒別，用甲醇提取顆粒，能很好地使莫諾苷、馬錢苷溶出，供試品色譜與莫諾苷、馬錢苷對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾；鑒別熊果酸時，供試品色譜及陰性樣品色譜均未見相同斑點(diǎn)，因而不采用熊果酸作對照。肉蓯蓉的薄層鑒別，采用《中華人民共和國藥典》2020年版肉蓯蓉項(xiàng)下薄層鑒別方法，即能有效鑒別雙山顆粒中松果菊苷、毛蕊花糖苷成分，且專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好。

本研究所選含量測定方法的指標(biāo)莫諾苷和松果菊苷，分別是山萸肉和肉蓯蓉中重要的藥理活性成分。莫諾苷為環(huán)烯醚萜苷類化合物，松果菊苷為苯乙醇苷類化合物，兩者皆具有改善神經(jīng)系統(tǒng)功能和保護(hù)腦組織的作用，對老年癡呆癥的臨床防治具有巨大潛力［15-16］。本研究建立的含量測定方法，可同時對雙山顆粒中莫諾苷、松果菊苷進(jìn)行定量分析，縮短了測定時間，降低了測定成本［17-18］。在制備供試品溶液時，分別考察了溶劑倍量為25倍、50倍、100倍時兩種成分的含量，結(jié)果顯示，溶劑倍量為25倍時莫諾苷、松果菊苷總含量最高，表明在此溶劑倍量下即可將顆粒中莫諾苷、松果菊苷提取完全；流動相分別考察了甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.3%磷酸對各色譜峰峰形及分離度的影響，結(jié)果顯示，以乙腈-0.3%磷酸為流動相時，兩個成分的色譜峰峰形和分離度均較好。

4 結(jié)論

本文對雙山顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了初步研究，采用薄層色譜法確定了山藥、山萸肉、肉蓯蓉的定性鑒別方法；建立了高效液相色譜法測定雙山顆粒中莫諾苷、松果菊苷含量測定方法；初步擬定雙山顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。可為雙山顆粒質(zhì)量控制提供可靠參考。

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