彭偉　張繼紅　梁力建

[摘要] 目的 探討三磷酸肌醇（IP3）和PTEN基因表達(dá)變化在槲皮素（quercetin）治療裸鼠移植人肝癌中的作用。 方法 以裸鼠移植人肝癌為對(duì)照組，槲皮素治療組腹腔注入槲皮素50 mg/（kg·d），對(duì)照組腹腔注入含0.04%DMSO的RPMI1640培養(yǎng)基0.05 mL/g，3周后觀察肝癌增長(zhǎng)情況，并應(yīng)用同位素試劑盒檢測(cè)肝癌組織IP3含量，RT-PCR分析癌組織PTEN mRNA表達(dá)，Western blotting分析肝癌組織PTEN蛋白表達(dá)。 結(jié)果 治療組肝癌體積和重量均顯著低于對(duì)照組[體積（15.8±10.1） mm3 vs （52.3±26.5） mm3，重量（44.8±10.4） mg vs （91.3±31.4） mg]，PTEN mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組[RI（灰度與面積之積的相對(duì)強(qiáng)度）0.81±0.24 vs 0.36±0.09]（P ＜ 0.01），PTEN蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組[RI（灰度與面積之積的相對(duì)強(qiáng)度）3.14±0.13 vs 1.08±0.15]。 結(jié)論 槲皮素能減少I(mǎi)P3生成，上調(diào)肝癌組織PTEN基因表達(dá)，抑制裸鼠移植人肝癌增長(zhǎng)。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌；染料木黃酮；PTEN基因

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）21-0008-03

機(jī)體應(yīng)激的變化及基因是否表達(dá)的過(guò)程都受到細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的影響，而且對(duì)細(xì)胞整體生命機(jī)制的表達(dá)過(guò)程如細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、衰老及死亡起到了重要的作用[1]。對(duì)于細(xì)胞分化、增殖、凋亡的動(dòng)態(tài)穩(wěn)態(tài)及肝癌的產(chǎn)生，關(guān)系十分密切[2，3]；惡性腫瘤細(xì)胞主要表現(xiàn)為不受控制的生長(zhǎng)、凋亡和增殖過(guò)程受阻[4]。因此，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制從而達(dá)到調(diào)控機(jī)體基因表達(dá)的過(guò)程，對(duì)于肝癌治療來(lái)講，我們可以使得癌細(xì)胞進(jìn)入到凋亡的程序從而達(dá)到抑制細(xì)胞繁殖的過(guò)程。本文研究中是以三磷酸肌醇（IP3）和PTEN基因的表達(dá)為對(duì)比指標(biāo)，探討其在槲皮素（quercetin）治療鼠移植人肝癌中具體的表達(dá)情況，為磷酸肌醇信號(hào)通路抑制劑應(yīng)用于臨床提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌細(xì)胞株（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)），胎牛血清（Hyclone），β-肌動(dòng)蛋白鼠抗（Neomarker），Taq酶（Takara），槲皮素（Sigma），dNTP（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），Tris-EDTA（Sigma），Trizol試劑（MRC），核糖核酸（Ambion），逆轉(zhuǎn)錄酶（Gibco BRL），胰蛋白酶（Sigma），RPMI1640培養(yǎng)基（Invitrogen），RNase inhibitors（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），IP3檢測(cè)試劑盒（Amersham），寡糖D（T）18（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），PVDF膜（羅氏），發(fā)光materialanti小鼠（第二抗體）（武漢博士德公司），西班牙低熔點(diǎn)瓊脂糖（Biowest公司）。流式細(xì)胞儀（貝克曼-庫(kù)爾特公司），PTEN基因單克隆抗體（Santa Cruz），SDS（羅氏），PCR引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型的構(gòu)造取HepG2細(xì)胞加入培養(yǎng)液中，培養(yǎng)成分為鏈霉素濃度為100 μg/mL，10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，在5% CO2和95%濕度空氣條件、常溫37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基更換時(shí)間為3 d。觀察細(xì)胞為培養(yǎng)基85%左右時(shí)，進(jìn)行傳代操作。當(dāng)傳代達(dá)到移植要求時(shí)，進(jìn)行裸鼠模型移植操作。

將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液制成5×107/mL的懸液，接種時(shí)取0.2 mL懸液注射到4只裸鼠的皮下組織，取體積為1 cm3大小的腫瘤為瘤源模型。待處死動(dòng)物后，將瘤源完整取下，保持腫瘤的獨(dú)立性，去除周?chē)慕M織成分，將生長(zhǎng)良好的腫瘤切成直徑在2 mm左右的小塊，放置到生理鹽水中等待使用。取裸鼠27只，發(fā)育條件為4～6周，待麻醉操作后沿腹部正中線切開(kāi)，移植瘤塊到動(dòng)物肝實(shí)質(zhì)中，然后縫合腹部，模型構(gòu)造完成。待裸鼠飼養(yǎng)2周后進(jìn)行觀察研究。

1.2.2 分組操作標(biāo)準(zhǔn)槲皮素500 mg溶于DMSO 2 mL，將RPMI1640培養(yǎng)基配成1 mg/mL槲皮素溶液。注射標(biāo)準(zhǔn)為每克動(dòng)物0.05 mL，DMSO濃度控制為0.04%。對(duì)照組溶劑制備：將2 mL的DMSO加入到培養(yǎng)基中，調(diào)配成濃度為0.04%的500 mL備用。飼養(yǎng)14 d后，隨機(jī)將動(dòng)物分為兩組，每組9只動(dòng)物：槲皮素治療組動(dòng)物按照50 mg/（kg·d）注入槲皮素；對(duì)照組每克動(dòng)物取0.05 mL，注入培養(yǎng)溶液，待3周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 測(cè)定腫瘤大小快速對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處死，采取正中切口，肝臟游離后，觀察腫瘤的浸潤(rùn)類(lèi)型，對(duì)腫瘤就行切除，用電子天平稱(chēng)重。對(duì)腫瘤長(zhǎng)短進(jìn)行測(cè)量，取最長(zhǎng)單位m和最短單位n，按照公式V=πmn2/6對(duì)腫瘤的體積進(jìn)行計(jì)算。取腫瘤小部分制成標(biāo)本，在-70℃的儀器條件下進(jìn)行保存。

1.2.4 IP3含量的測(cè)定首先制作肝癌組織，保持整體環(huán)境低溫，取肝癌組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室的離心操作，取上清液調(diào)pH值到7.5，再進(jìn)行離心操作除去KClO4沉淀后，取上清液待測(cè)定。

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，取樣品加入到100 μL緩沖液、100 μL結(jié)合蛋白，100 μL[3H]-IP3稀釋液中，逐步經(jīng)過(guò)離心、干燥處理，取沉淀物與1 mL去離子水進(jìn)行混合，進(jìn)行10 min的孵育操作，待操作完成后在液體中加入液閃，混合均勻后進(jìn)行計(jì)數(shù)，與標(biāo)準(zhǔn)參考計(jì)數(shù)值進(jìn)行對(duì)比后即可得到IP3的測(cè)定含量。

蛋白濃度的測(cè)定：在堿性條件下，加入蛋白后會(huì)有紫色沉淀發(fā)生，通過(guò)562 nm吸收值的測(cè)定可得到蛋白的具體濃度，進(jìn)而得到IP3含量。

1.2.5 PTEN mRNA是否表達(dá)的檢測(cè)遵照Trizol Reagent法對(duì)RNA進(jìn)行提取操作，完整性檢測(cè)以1%的瓊脂凝膠電泳為準(zhǔn)。定量RNA后以2 μg為單位進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR操作。上游引物：5-CATTATGACACCGCCAAA-3，下游引物：5-AACGGGGCTACATTATTT-3。循環(huán)35次。β-actin上游引物：5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3；下游引物：5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3。循環(huán)35次，72℃進(jìn)行延伸10 min。在凝膠100 V電泳后進(jìn)行成像觀察，通過(guò)半定量分析及面積比，得出相對(duì)強(qiáng)度的值，通過(guò)比較得出基因的表達(dá)規(guī)律。

1.2.6 檢測(cè)PTEN蛋白PENT蛋白的表達(dá)測(cè)定參照Western blotting法設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)，依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉操作，在一抗加入后，去除未結(jié)合的抗體后加入二抗進(jìn)行孵育過(guò)程，通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行成像分析及半定量分析處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 分組動(dòng)物模型的觀察

通過(guò)觀察兩分組動(dòng)物均可見(jiàn)腫瘤繁殖生長(zhǎng)的表現(xiàn)。對(duì)照組模型動(dòng)物精神不佳，但體重?zé)o增減變化，開(kāi)腹后腫瘤狀況較好，腹水未發(fā)現(xiàn)，無(wú)轉(zhuǎn)移跡象。槲皮素組動(dòng)物在瘤體的質(zhì)量和體積測(cè)定上均小于對(duì)照組，動(dòng)物檢查未發(fā)現(xiàn)腹水及腫瘤轉(zhuǎn)移跡象。

2.2 移植瘤

通過(guò)公式：抑瘤率=（兩組瘤體重量差/對(duì)照組瘤體重量）×100%，得到治療組的抑瘤率為50.3%。

2.3 IP3測(cè)定值

治療組IP3含量明顯小于對(duì)照組含量（P ＜ 0.01）。在重量（t = 3.84）和體積（t = 6.67）的比較上，治療組瘤體均小于對(duì)照組（P ＜ 0.01）。見(jiàn)表1。

表1 兩組移植瘤重量、體積及IP3含量的比較（x±s）

2.4 PCR結(jié)果處理

見(jiàn)表1、圖1。經(jīng)圖表分析可得，在PTEN mRNA的表達(dá)比較上槲皮素組較對(duì)照組增加明顯，經(jīng)圖像分析結(jié)果和半定量測(cè)定均得到證實(shí)（P ＜ 0.01）。

2.5 Western blotting法分析

見(jiàn)表1、圖2。經(jīng)圖表分析可得，在PTEN蛋白的表達(dá)比較上槲皮素組較對(duì)照組增加明顯，經(jīng)圖像分析結(jié)果和半定量測(cè)定均得到證實(shí)（P ＜ 0.01）。

3 討論

細(xì)胞的整體生命過(guò)程都受到基因表達(dá)的控制。磷酸酶基因編碼的PTEN蛋白可表現(xiàn)為兩種不同的表達(dá)類(lèi)型，其底物主要為PIP3與Akt。因此，在表達(dá)的過(guò)程上來(lái)說(shuō)PTEN蛋白大都是利用PI3K/Akt通路來(lái)控制細(xì)胞的生命程序，如周期和凋亡變化[5，6]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)出現(xiàn)惡性腫瘤時(shí)，PI3K/Akt通路會(huì)出現(xiàn)異常的激活表現(xiàn)，具體體現(xiàn)在激發(fā)的反應(yīng)上，PIP2磷酸化以及PKB/Akt的特殊活化[7]，后者可出現(xiàn)釋放細(xì)胞色素C的反應(yīng)從而使Forkhead家族等轉(zhuǎn)錄子磷酸化，是細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題，從而起到影響細(xì)胞凋亡的目的[8，9]。

磷酸肌醇通路信號(hào)的特殊變化，在化學(xué)反應(yīng)上不僅表現(xiàn)在對(duì)反應(yīng)有催化作用的PIP和PI兩種激酶活性的增高，而且也可以體現(xiàn)在反應(yīng)物IP3和二酰基甘油的增高，這對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究的肝癌細(xì)胞的生命過(guò)程有著重要的影響[10-12]。筆者通過(guò)研究也得到在PI及PIP兩種激酶抑制的情況下槲皮素[13，14]可表現(xiàn)出對(duì)肝癌PTEN基因的表達(dá)的特殊性調(diào)節(jié)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。

筆者通過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)槲皮素對(duì)磷酸肌醇信號(hào)通路進(jìn)行抑制的研究，通過(guò)裸鼠肝癌模型的建立，發(fā)現(xiàn)其可使癌細(xì)胞內(nèi)IP3的含量向減少的方向發(fā)展，通過(guò)對(duì)PTEN基因表達(dá)的影響可達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。而且槲皮素可對(duì)PI和PIP兩種激酶進(jìn)行同時(shí)抑制[14，15]，說(shuō)明其可對(duì)PTEN基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，即影響抑制肝癌細(xì)胞的生命過(guò)程。

本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究表明了肝癌細(xì)胞磷酸肌醇通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及PTEN基因?qū)Ω伟┥L(zhǎng)的影響，磷酸肌醇信號(hào)通路抑制劑方向的研究，是一種新型治療肝癌的方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1]孫大業(yè)，郭艷林，馬力耕，等. 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[M]. 第2版. 北京：科學(xué)出版社，2000：1-9.

[2]Duan XX，Ou JS，Li Y，et al. Dynamic expression of apoptosis-related genes during development of laboratory hepatocellular carcinoma and its relation to apoptosis[J]. World J Gastroenterol，2005，11（30）：4740-4744.

[3]Kountouras J，Zavos C，Chatzopoulos D. Apoptotic and anti-angiogenic strategies in liver and gastrointestinal malignancies[J]. J Surg Oncol，2005，90（4）：249-259.

[4]Baskin-Bey ES，Gores GJ. Caspase-8, death-receptor signaling, and hepatocarcinogenesis: the Fas and the furious[J]. Gastroenterology，2005， 129（5）：1790-1792.

[5]Waite KA，Eng C. Protean PTEN: form and function[J]. Am J Hum Genet， 2002，70（4）：829-844.

[6]Hu TH，Huang CC，Lin PR，et al. Expression and prognostic role of tumor suppressor gene PTEN/MMAC1/TEP1 in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer，2003，97（8）：1929-1940.

[7]Franke TF，Hornik CP，Segev L，et al. PI3K/Akt and apoptosis: size matters[J]. Oncogene，2003，22（56）：8983-8998.

[8]Di Cristofano A，Pandolfi PP. The multiple roles of PTEN in tumor suppression[J]. Cell，2000，100（4）：387-390.

[9]Kops GJ，Burgering BM. Forkhead transcription factors: new insights into protein kinase B (c-akt) signaling[J]. J Mol Med (Berl)，1999，77（9）：656-665.

[10]Singhal RL，Yeh YA，Look KY，et al. Coordinated increase in activities of the signal transduction enzymes PI kinase and PIP kinase in human cancer cells[J]. Life Sci，1994，55（19）：1487-1492.

[11]Weber G，Shen F，Prajda N，et al. Increased signal transduction activity and down-regulation in human cancer cells[J]. Anticancer Res，1996， 16（6A）：3271-3282.

[12]Weber G，Shen F，Prajda N，et al. Regulation of the signal transduction program by drugs[J]. Adv Enzyme Regul，1997，37：35-55.

[13]賀福初，孫建中，葉鑫生，等. 蛋白質(zhì)科學(xué)[M]. 北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2009：32-35，51-55.

[14]Teixeira CC，Costas AP，Nemelivsky Y. Apoptosis of growth plate chondrocytes occurs through a mitochondrial pathway[J]. Angle Orthod，2007，77（1）：129-134.

[15]Schulte-Hermann R，Bursch W，Low-Baselli A，et al. Apoptosis in the liver and its role in hepatocarcinogenesis[J]. Cell Biol Toxicol，1997，13（4-5）：339-348.

（收稿日期：2012-05-07）