王新宇　許愛娥　傅麗芳　錢國培　陳俊帆　嚴(yán)后友

[摘要] 目的 建立毛囊隆突處外根鞘細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。 方法 利用中性蛋白酶分離得到單個毛囊，采用胰酶消化法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)， 倒置6顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，繪制細(xì)胞生長增殖曲線，免疫熒光檢測干細(xì)胞相對特異性標(biāo)識分子角蛋白19（K19）和β1整合素表達(dá)情況，分別用分離培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocytes，KCs）做對照。 結(jié)果 免疫熒光檢測顯示90%左右的毛囊外根鞘細(xì)胞胞漿中均有K19和β1整合素的陽性表達(dá)。 結(jié)論 應(yīng)用中性蛋白酶和胰酶消化法體外培養(yǎng)毛囊隆突處外根鞘細(xì)胞簡單、可行。

[關(guān)鍵詞] 毛囊；外根鞘細(xì)胞；毛囊干細(xì)胞；角質(zhì)形成細(xì)胞；分離；培養(yǎng)

[中圖分類號] R392.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）06-0001-03

毛囊的上皮由表皮延伸而來，主要分為外根鞘（outer root sheath，ORS）和內(nèi)根鞘（inner root sheath，IRS），外根鞘相當(dāng)于表皮的基底層和棘細(xì)胞層。皮脂腺下部的外根鞘通常稱為隆突部[1]，該隆突部位目前被認(rèn)為是毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cell，F(xiàn)SC）存在的主要部位[2]。Hong等[3]將人FSC在黑色素細(xì)胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，其中有20%～40%的細(xì)胞出現(xiàn)了黑色素細(xì)胞特有的樹枝狀形態(tài)等特點。因此分離毛囊隆突部的ORS細(xì)胞即獲得具有向黑素細(xì)胞分化的FSC。K19、β1整合素[4-6]等被認(rèn)為是皮膚干細(xì)胞的標(biāo)志。我們通過免疫熒光檢測毛囊ORS細(xì)胞胞漿中K19和β1整合素的陽性表達(dá)以證實其干細(xì)胞的特性。

1 材料與方法

1.1 材料

皮膚外科手術(shù)切除的成人頭皮15例；分離毛囊的器械包括眼科剪刀、鑷子、解剖顯微鏡和顯微器械；中性蛋白酶（dispase，Gibco）；胰蛋白酶-EDTA（Gibco）；無血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（K-SFM， Gibco）；表皮生長因子和牛垂體添加物；紅細(xì)胞計數(shù)儀。

1.2 方法

1.2.1 ORS細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[7，8]，將皮膚外科手術(shù)切除的成人頭皮用PBS液清洗2次，盡量去除皮下脂肪，再用PBS液清洗2次，將頭皮切成細(xì)長條并分成3～5個毛囊的小塊，在解剖顯微鏡下用無菌手術(shù)刀片在皮脂腺下方（約表皮側(cè)1/5～1/4處）橫切毛囊（切去的表皮側(cè)留做KCs的分離、培養(yǎng)），并將去除表皮側(cè)的毛囊置入含0.25%Dispase酶的試管中，37℃消化50～100 min（肉眼見標(biāo)本稍變毛糙）后用PBS液清洗1次，解剖顯微鏡下收集形態(tài)完好的生長期毛囊，用眼科鑷輕輕擠出毛囊（不包含毛乳頭），放入試管A，加DMEM培養(yǎng)基清洗，1 000 r/min離心5 min，加入0.25%的胰酶-EDTA 37℃孵育15 min左右，加入10%的胎牛血清（FBS）終止消化。靜置1 min后毛囊沉入離心管底，取上清液至試管B。試管A加0.25%的胰酶-EDTA 37℃孵育10 min左右，重復(fù)上述過程一次，以增加分離的ORS細(xì)胞數(shù)。將試管B內(nèi)的液體離心，用添加了表皮生長因子和牛垂體添加物的K-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，2～3 d換液。

1.2.2 KCs的分離、培養(yǎng) 被去除的表皮側(cè)頭皮加入0.25%Dispase酶分離表真皮，將表皮加入0.25%的胰酶-EDTA 37℃孵育5 min左右，加入10%的FBS終止消化，離心獲得KCs，用添加了表皮生長因子和牛垂體添加物的K-SFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，用作與ORS細(xì)胞的鑒定做對照。

1.2.3 ORS細(xì)胞與KCs的傳代 ORS細(xì)胞培養(yǎng)10～12 d，KCs培養(yǎng)8～10 d生長至匯合，分別以0.05%胰酶37℃消化細(xì)胞1～3 min，10%的FBS終止消化，收集細(xì)胞懸液離心（1 500 轉(zhuǎn)，5 min），棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，計數(shù)。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察KCs與ORS細(xì)胞的生長情況 分別于原代培養(yǎng)的第2天、第5天及細(xì)胞生長至匯合拍攝照片，以觀察細(xì)胞生長的動態(tài)，比較二者的異同。

1.2.5 四甲基偶氮唑藍(lán)比色法（MTT法）行細(xì)胞增殖測定并繪制細(xì)胞生長增殖曲線 選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化5～8 min，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL加于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，再分別加入不同濃度藥物（1.5、1.8、2.2、2.5、2.8、3.2 mg/mL），并設(shè)置培養(yǎng)液對照。置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)56～72 h，于結(jié)束前4 h加入MTT 10 μL/孔，4 h后棄上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）100 μL/孔，振蕩10 min左右，置酶標(biāo)儀測A值，波長為570 nm。

1.2.6 免疫熒光檢測進(jìn)行干細(xì)胞特性的鑒定 分別將第2代ORS細(xì)胞與KCs爬片行K19、β1整合素的免疫熒光檢測，分析ORS細(xì)胞是否具有干細(xì)胞的特性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

KCs（圖1）呈特征性鋪路石樣生長，原代細(xì)胞一般需8～10 d生長至匯合可以傳代，以后代數(shù)的細(xì)胞6～8 d即可消化傳代一次，隨著標(biāo)本來源的年齡和細(xì)胞代數(shù)的增加，KCs體外培養(yǎng)增殖的速度減慢，從第4代起，細(xì)胞呈多形性，偽足增多，呈老化的表現(xiàn)。相對于KCs，ORS細(xì)胞（圖2）也呈鋪路石樣生長，原代培養(yǎng)呈慢周期性，細(xì)胞呈圓形，從第4天開始可見呈多角形的細(xì)胞，形成幾個細(xì)胞聚集的小克隆， 此后細(xì)胞增殖加速，12～14 d生長至匯合。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞第2天就貼壁生長，10～12 d匯合，細(xì)胞在K-SFM培養(yǎng)基中傳至5代細(xì)胞大小仍均勻一致，呈克隆狀生長，說明毛囊隆突處的ORS細(xì)胞具有慢周期性、高度克隆狀生長、高增殖活性等干細(xì)胞的特點。

2.2 細(xì)胞生長曲線

原代培養(yǎng)的KCs 第4天始進(jìn)入對數(shù)生長期，第8天左右進(jìn)入平臺期；ORS細(xì)胞第6天進(jìn)入對數(shù)生長期，10～14 d達(dá)高峰后進(jìn)入平臺期。繪制的細(xì)胞生長曲線皆呈“S”形，ORS細(xì)胞高峰期明顯高于KCs，且ORS細(xì)胞的生長周期較長。表明ORS細(xì)胞與KCs相比，具有慢周期性，增殖活性更強(qiáng)（圖3）。

2.3 免疫熒光檢測K19和β1整合素表達(dá)情況

KCs（圖3）的K19免疫熒光染色陰性，β1整合素染色部分細(xì)胞胞漿有少許紅色熒光。ORS細(xì)胞（封三圖1）K19染色示胞漿內(nèi)綠色熒光，陽性細(xì)胞90%左右，β1整合素染色示β1整合素染色示胞漿內(nèi)紅色熒光，陽性細(xì)胞>90%。K19和β1整合素是皮膚干細(xì)胞的特異性標(biāo)志，進(jìn)一步證實了毛囊隆突處的ORS細(xì)胞具有干細(xì)胞性。

3 討論

皮膚干細(xì)胞主要有表皮干細(xì)胞（epidermal stem cell，ESC）和FSC。通過標(biāo)記滯留技術(shù)，F(xiàn)SC的標(biāo)記滯留時間比毛囊間ESC時間長[9，10]，從隆突部來源細(xì)胞做培養(yǎng)時比毛囊間ESC有更高的克隆形成能力[10]。Oshima[11]通過切取轉(zhuǎn)基因鼠觸須和毛囊隆突部片段移植到胚胎鼠背部，發(fā)現(xiàn)β-gal 陽性細(xì)胞在移植后生長的整個毛囊內(nèi)均可觀察到，證實毛囊隆突部的干細(xì)胞不但可再生整個毛囊，還可生發(fā)出表皮。從而引起毛囊間ESC是FSC的子代的假設(shè)[12]。Lavker[13]研究結(jié)果證實了毛囊間ESC來源于FSC的觀點，他指出FSC和毛囊間ESC從其基本上來說是一種干細(xì)胞， 它位于毛囊隆突部。Rochat等[14]研究發(fā)現(xiàn)毛囊的大部分克隆形成細(xì)胞位于毛囊隆突處，此處的單個細(xì)胞可進(jìn)行130次以上的分裂，分裂增殖至1.7×1038個。在正常情況下，這些毛囊隆突部的FSC可生成3種主要類型的皮膚上皮細(xì)胞，即毛囊、表皮和皮脂腺[15]。Taylor G等[16]研究也證實了FSC不但可以形成毛囊，還可以形成表皮。通過改變FSC的特性甚至可能分化為其他類型的細(xì)胞。Sieber-Blum等[17，18]在體外將FSC分化成神經(jīng)元、平滑肌細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和雪旺細(xì)胞；Drewa[19]應(yīng)用FSC成功重建了膀胱壁。尚有FSC分化成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞的報道[20]。從組織工程種子細(xì)胞的角度來看，F(xiàn)SC是一種獲取容易、增殖和分化能力強(qiáng)的組織工程種子細(xì)胞，在構(gòu)建組織工程皮膚中能分化為更符合正常皮膚的結(jié)構(gòu)，同時有望重建皮膚附屬器官結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)修復(fù)到功能修復(fù)。因此，F(xiàn)SC即隆突部的毛囊ORS細(xì)胞的分離培養(yǎng)技術(shù)越來越受到研究者的重視。Limat于1986 年探索毛囊外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)，利用拔出的生長期毛囊培養(yǎng)外根鞘細(xì)胞獲得成功[21]，1996 年Limat 培養(yǎng)自體毛囊外根鞘細(xì)胞治療慢性潰瘍?nèi)〉贸晒22]。此后，不斷有毛囊外根鞘細(xì)胞和毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)的報道。Vanscheidt 和 Hunziker[23]做了個小樣本的研究，用從毛囊外根鞘提取的單細(xì)胞懸液治療白癜風(fēng)。研究發(fā)現(xiàn)5例中有3例幾乎是全部復(fù)色（90%），1例在3個月內(nèi)復(fù)色面積達(dá)到50%，并呈彌散型，另1例患者復(fù)色面積達(dá)10%。他們的方法簡單、無創(chuàng)，而且操作簡單、直接和可以反復(fù)使用。Mohanty S等[8]用FUE法獲取15～25個毛囊，用胰酶-EDTA 37℃消化90 min以分離ORS細(xì)胞。70 μm細(xì)胞篩過濾后1 000轉(zhuǎn)離心5 min后重懸移植至去表皮的受皮區(qū)。14例患者中9例獲得了75%以上的復(fù)色。穩(wěn)定期>1年的患者平均復(fù)色比例明顯高于穩(wěn)定期<1年的。我們的實驗利用中性蛋白酶分離得到單個毛囊， 采用胰酶消化法獲得單個的毛囊ORS細(xì)胞，可以減少機(jī)械分離毛囊對細(xì)胞的損傷；應(yīng)用角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)，可以排除血清中許多未知因素的干擾，并減少動物血清可能帶來的不利影響。在無血清角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞生長良好，P5 代細(xì)胞大小仍均勻一致，呈干細(xì)胞的克隆狀生長。免疫熒光結(jié)果分析，P2代毛囊ORS細(xì)胞表達(dá)K19 和β1整合素，且陽性率高達(dá)90%左右，同一標(biāo)本分離培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞分別呈陰性和少許陽性反應(yīng)，證實毛囊ORS細(xì)胞包含干細(xì)胞。該實驗成功分離培養(yǎng)了毛囊隆突處的ORS細(xì)胞，為進(jìn)一步純化FSC奠定了基礎(chǔ)。與以往的報道不同的是，我們的方法分別去除了毛囊表皮側(cè)1/5及毛乳頭，保證了獲取的細(xì)胞為毛囊隆突處的ORS細(xì)胞，即FSC。

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（收稿日期：2012-12-29）