洪文娟 洪志鵬

終末期肺病患者缺乏有效的內(nèi)科治療手段，其導(dǎo)致的肺功能衰竭致殘率和致死率高，因此肺移植已成為治療終末期肺病的有效方法。肺移植是指采用自體肺葉、同種異體肺葉、單側(cè)肺、雙側(cè)肺、心肺聯(lián)合，甚至不同物種的異種肺置換病肺，重建肺生理功能的技術(shù)，是胸外科不可或缺的重要工作之一。1983年首例人的肺移植獲得成功，目前臨床肺移植多以同種異體移植為主，自體肺移植應(yīng)用于根治肺癌，異種肺移植尚未從實(shí)驗(yàn)室走進(jìn)臨床。據(jù)國(guó)際心肺移植協(xié)會(huì)(The International Society for Heart and Lung Transplantation Transplant Registry，ISHLT)資料統(tǒng)計(jì)，截至2016年6月30日，全球成人肺移植累計(jì)60 107例，心肺移植3 992例，年成人肺移植手術(shù)量2015年為4 122例[1]。雖然肺移植在該領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，手術(shù)適應(yīng)癥不斷拓展，在外科技術(shù)操作水平層面展現(xiàn)出幾乎沒(méi)有無(wú)法逾越的難關(guān)，但是較為突出的問(wèn)題依然是移植免疫排斥反應(yīng)導(dǎo)致的移植肺功能喪失，極大的影響了肺移植患者的生活質(zhì)量和生存期。我國(guó)肺移植起步于1979年，作為一門(mén)新興的學(xué)科走過(guò)了近40年的路程[2]。迄今全國(guó)肺移植總量939例，移植經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)得到高度認(rèn)可。盡管基礎(chǔ)研究成績(jī)斐然，但學(xué)術(shù)前沿與國(guó)際先進(jìn)水平尚存差距。2016 年我國(guó)腦死亡和心臟死亡器官捐獻(xiàn)者達(dá)4 080余例，而肺移植為204例，僅利用了不到5%的供肺[3]。因此供肺的利用面臨著巨大的挑戰(zhàn)，但同時(shí)也是機(jī)遇，研究者應(yīng)充分利用供肺資源，掌握肺移植的研究現(xiàn)狀，把握好研究思路和研究方法，使肺移植的基礎(chǔ)及臨床研究取得創(chuàng)新性的飛躍。

一、肺移植免疫的作用機(jī)理和特點(diǎn)

肺移植免疫是受體免疫系統(tǒng)與供體肺抗原的特異性免疫應(yīng)答。供體肺抗原除組織相容性抗原(MHC, mH, ABO)外，與其它移植器官相比肺是進(jìn)行氣體交換的器官，同時(shí)外界環(huán)境的微生物從鼻孔吸入到肺泡，構(gòu)建了一個(gè)自己的微生物群(microbiota)，作為呼吸道守護(hù)者，參與維持呼吸生理和免疫的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。肺移植供體和受體呼吸道內(nèi)的兩個(gè)微生物王國(guó)可能通過(guò)調(diào)整天然免疫的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，改變抗原遞呈細(xì)胞(antibody presentation cells, APCs)的能力，致敏T細(xì)胞，影響移植排斥[4-5]。臨床上可見(jiàn)嚴(yán)重的排斥反應(yīng)通常緊隨細(xì)菌或病毒感染之后。

供體移植肺抗原與受體間的差異是導(dǎo)致排斥反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)直接通路、部分或不完全直接通路(semi-direct pathway)和間接通路激活T細(xì)胞。直接通路指受體T細(xì)胞直接識(shí)別供體APCs表面的MHC抗原，活化CD8 T細(xì)胞和CD4 T細(xì)胞。間接通路則是受體MHC Ⅱ類(lèi)分子將供體MHC多態(tài)區(qū)域的多肽即脫落的抗原提呈給T細(xì)胞，活化CD4 T細(xì)胞，以及激活天然免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致移植肺功能紊亂。通過(guò)間接識(shí)別非主要組織相容性復(fù)合物分子(non-major histocompatibility complex molecules, non-MHC)基因編碼的異己抗原決定簇，激活受體單核吞噬細(xì)胞與分化，增強(qiáng)異體反應(yīng)T細(xì)胞的致敏。不完全直接通路是供體完整的MHC分子轉(zhuǎn)移給受體的APCs，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，間接識(shí)別的CD4 T細(xì)胞交叉調(diào)控直接識(shí)別的CD8+T或CD8-T細(xì)胞的功能[6-8]。

移植肺所攜帶的異體MHC抗原細(xì)胞如過(guò)路白細(xì)胞(主要是APCs)、淋巴細(xì)胞和碎片組織進(jìn)入受體，激活CD8T和CD4T細(xì)胞，CD8T細(xì)胞直接攻擊移植肺的靶細(xì)胞，CD4T釋放IL2等細(xì)胞因子；B細(xì)胞在輔助細(xì)胞2(type2 T helper, Th2)細(xì)胞釋放IL3、IL4、IL5的幫助下，轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生供體特異性抗體(donor specific antibodies, DSA)，激活補(bǔ)體，引起補(bǔ)體C4裂解為小分子片段的C4a和大分子片段的C4b，再轉(zhuǎn)換為補(bǔ)體經(jīng)典活化途徑裂解成份C4d，與毛細(xì)血管基底膜、內(nèi)皮細(xì)胞Ⅳ型膠原結(jié)合，DSA作用于移植物內(nèi)皮細(xì)胞表面的抗原，產(chǎn)生微血管炎、內(nèi)皮損傷和一系列分子改變，導(dǎo)致包括超急排斥、急性排斥和慢性排斥反應(yīng)損傷均在內(nèi)的抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)(antibody-mediated rejection, AMR)，導(dǎo)致移植肺失敗。AMR是以移植肺功能障礙、組織病理學(xué)改變和DSA為特征的臨床綜合征，其診斷依據(jù)有賴(lài)于組織病理學(xué)改變，治療通常以綜合管理為主，包括靜脈內(nèi)免疫球蛋白(intravenous immune globulin，IVIG)、血漿置換、單抗和C1酯酶抑制劑等處理[9-12]。

二、外泌體、DMAPs、mi RNA 和長(zhǎng)鏈非編碼RNA

外泌體(exosomes)直徑均30～100 nm，從許多細(xì)胞釋放，在生理、病理和移植免疫系統(tǒng)都發(fā)揮著重要的作用。經(jīng)過(guò)外泌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間遠(yuǎn)程通訊，將完整的供體MHC分子信息從供體樹(shù)突狀細(xì)胞傳遞至受體樹(shù)突狀細(xì)胞表面，參與肺移植急性排斥反應(yīng)和慢性排斥如閉塞性細(xì)支氣管炎(bronchiolitis obliterans syndrome, BOS) 的免疫發(fā)病過(guò)程[13]。

移植免疫應(yīng)答不但能夠識(shí)別異體抗原，還能夠識(shí)別“危險(xiǎn)信號(hào)”(danger/damage associated molecular patterns, DMAPs)，DMAPs源于機(jī)體自身的內(nèi)源性分子。它們是細(xì)胞外熱休克蛋白(extracellular heat shock protein, eHsp72)、尿酸晶體(uric acid crystals)、線粒體DNA、高遷移率族蛋白(high mobility group box1, HMGB1)和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)，可激活天然免疫和機(jī)體的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)[14]。

mi RNA 是小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)和免疫過(guò)程，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖與分化(miR-185-5p, miR-200a-3p)，抑制NF-κB的表達(dá)(miR-26a-5p, miR-140-3p, miR-339-5p)[15]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNA)是非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度大于200的核苷酸。lncRNA在移植免疫中的作用與激活免疫相關(guān)，研究表明發(fā)生免疫移植排斥反應(yīng)時(shí)，lncRNA表達(dá)升高，有效的抗排斥治療后恢復(fù)正常。小鼠心臟移植后lncRNA表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明lncRNA可以用于早期診斷或預(yù)測(cè)急性排斥反應(yīng)[16]。

三、移植肺的保護(hù)和保存、缺血再灌注損傷激發(fā)的炎癥事件與免疫損傷

供肺保存不良可導(dǎo)致排斥反應(yīng)，支氣管上皮和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮MHC表達(dá)增加，以及細(xì)胞間粘附分子ICAM的升高[17]。我們課題組長(zhǎng)期聚焦于供體移植肺的保護(hù)研究，在離體肺損傷的保護(hù)及其機(jī)制方面取得了系列原創(chuàng)性成果，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提出了更加符合生理的保存方法，更好的保護(hù)了離體肺的器官活性、組織結(jié)構(gòu)及正常功能，降低了免疫損傷，有望為肺移植患者提供優(yōu)質(zhì)肺源。

缺血再灌注損傷對(duì)移植免疫排斥的發(fā)生與發(fā)展具有重要的影響，天然免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體能夠識(shí)別缺血再灌注損傷產(chǎn)生的DMAPs，產(chǎn)生天然免疫反應(yīng)以及T細(xì)胞活化所需的信號(hào)(粘附分子、細(xì)胞因子等)，增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。減輕缺血再灌注損傷的天然免疫損傷，則有助于調(diào)控抗原特異性排斥反應(yīng)[18]。

四、表觀遺傳與移植免疫

表觀遺傳是DNA序列以外的化學(xué)標(biāo)記編輯的遺傳密碼，通過(guò)DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、遺傳印記、隨機(jī)染色體失活和非編碼RNA從多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)移植免疫的精準(zhǔn)調(diào)控[19]。以miRNA作為移植免疫耐受的生物標(biāo)記物，通過(guò)miRNA芯片能夠發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控移植排斥反應(yīng)的miRNA。

五、免疫抑制和免疫耐受誘導(dǎo)

肺移植的適應(yīng)證不斷向兒童、高齡、HIV和HCV感染性疾病患者或以前不能移植的危重癥病人擴(kuò)大。肺移植排斥反應(yīng)的大小取決于宿主識(shí)別異體抗原T細(xì)胞的數(shù)量、攻擊頻率、細(xì)胞分化階段和先天免疫的激活程度。 肺移植急性排斥反應(yīng)典型臨床表現(xiàn)為呼吸困難、低熱、肺門(mén)周?chē)g質(zhì)性浸潤(rùn)、缺氧和白細(xì)胞升高。急性排斥反應(yīng)的次數(shù)和嚴(yán)重程度和慢性排斥反應(yīng)的發(fā)生明顯相關(guān)，慢性排斥的病理特征為BOS，但是并非所有的移植后BOS都是免疫介導(dǎo)，誤吸或慢性感染亦可導(dǎo)致。慢性移植肺功能不全(chronic lung allograft dysfunction, CLAD)是目前遠(yuǎn)期生存的一大障礙，其危險(xiǎn)因素有感染(巨細(xì)胞病毒、曲霉菌、假單胞菌)、胃食管返流、AMR等。免疫抑制藥物是肺移植取得成功的關(guān)鍵，所有臨床移植均依賴(lài)于免疫抑制藥物治療移植排斥。

聯(lián)合用藥顯著增強(qiáng)了抗移植排斥的效果：①鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor, CNI)他克莫司(tacrolimus)、環(huán)孢素；②抗增殖劑嗎替麥考酚酯、硫唑嘌呤 ③糖皮質(zhì)激素。

針對(duì)AMR的臨床用藥有單克隆抗體(利妥昔單抗、依庫(kù)麗單抗、貝利木單抗、托珠單抗)、普羅沙福、硼替佐米、卡非佐米和IVIG、血漿置換；針對(duì)CLAD的有阿奇霉素、環(huán)孢素霧化吸入、孟魯司特；抗纖維化的尼達(dá)尼布、吡非尼酮和甲氨蝶呤；治療頑固性排斥反應(yīng)的有抗胸腺細(xì)胞球蛋白、阿侖單抗、體外光分離置換(extracorporeal photopheresis, ECP)和全身淋巴組織照射(total lymphoid irradiation, TLI)。他克莫司長(zhǎng)效釋放劑、舌下含服劑和靜脈給藥的新型制劑，可維持免疫治療。通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)的監(jiān)控，達(dá)到免疫抑制劑用藥最小化，療效最大化，并最大限度降低毒副作用(腎毒性、神經(jīng)毒性、高氨血癥和惡性腫瘤)，提高無(wú)病生存期(CLAD-free survival)。免疫治療在保護(hù)移植肺的同時(shí)還需要避免長(zhǎng)期用藥的毒性作用。

如何才能不以犧牲全身免疫防御能力為代價(jià)，接受外來(lái)的器官，使移植肺被作為受體自身器官的一部分，不會(huì)被排異，建立免疫耐受，或許是解決該問(wèn)題的選項(xiàng)之一：①功能性免疫耐受，不用免疫抑制藥，受體免疫系統(tǒng)不排斥供體器官；②部分免疫耐受，低劑量免疫抑制藥即可維持治療，防止急、慢性排斥；③自發(fā)性免疫耐受，移植手術(shù)后未經(jīng)任何特殊的誘導(dǎo)手段，而自發(fā)形成的免疫耐受。免疫耐受是異體器官與宿主共存無(wú)免疫損傷的一種狀態(tài)，形成機(jī)制與嵌合體(微嵌合、全嵌合、混合嵌合)等有關(guān)。通過(guò)阻斷特異性移植免疫應(yīng)答、主動(dòng)免疫、誘導(dǎo)免疫偏離、干細(xì)胞、胸腺移植和復(fù)合組織移植建立嵌合體(chimerism)等手段產(chǎn)生移植耐受，(如應(yīng)用IL-2受體拮抗藥巴利昔單抗(basiliximab)或胸腺細(xì)胞球蛋白)，使肺移植患者生存獲益[20-23]。

研究并闡明肺移植的免疫應(yīng)答和免疫耐受機(jī)制，降低肺移植后的排異反應(yīng)，尤其是慢性排異的發(fā)生，延長(zhǎng)移植肺的使用壽命，仍有許多基礎(chǔ)研究尚待深入。

六、肺的再移植

肺的再移植手術(shù)適應(yīng)證可概括為氣道并發(fā)癥、原發(fā)性移植物功能障礙(primary graft dysfunction, PGD)導(dǎo)致急性移植肺衰竭、難治性排斥反應(yīng)和CLAD。有的病人再移植術(shù)后獲得了很好的生存結(jié)果，近期文獻(xiàn)報(bào)道30 d、90 d、1年、3年和5年生存率再移植組分別為96.5%、96.5%、88.9%、74.5%和63.8%；首次移植組為99.2%、98.2%、89.3%、68.1%和53.1%，可見(jiàn)再移植5年生存率高出首次移植10.7個(gè)百分點(diǎn)。通常65%的患者再移植術(shù)后5年內(nèi)發(fā)生慢性排斥，28.5%的患者1年內(nèi)發(fā)生過(guò)1次急性排斥反應(yīng)。對(duì)已經(jīng)發(fā)生初次移植排斥的受體進(jìn)行第二方供體肺的再移植，依然遵循初次移植排斥的基本規(guī)律。初次與再次移植的排斥反應(yīng)交叉，DSA負(fù)荷增大，再移植的免疫狀態(tài)可能更為復(fù)雜[24-25]。

七、異種移植

異種移植的免疫障礙包括： ①受體內(nèi)天然抗體介導(dǎo)的超級(jí)排斥反應(yīng)；②急性體液異種移植排斥反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)；③血栓微血管病和慢性排斥反應(yīng)?；蚬こ虖脑搭^上很大程度的克服了超急排斥反應(yīng)和保護(hù)移植器官功能。2003年第一個(gè)α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因敲除(α-1,3-galactosyltransferase gene-knockout, GTKO)的基因修飾豬產(chǎn)出后，將基因修飾豬的心臟移植給狒狒，存活了945 d，腎移植存活了136 d，肺移植卻只存活了1 d多。除了形態(tài)學(xué)改變外，與肺內(nèi)豐富的巨噬細(xì)胞聚集相關(guān)，并涉及區(qū)域免疫即組織滯留免疫細(xì)胞(tissue-resident lymphocytes)機(jī)制。單基因修飾只能消除單一因素的影響如人類(lèi)補(bǔ)體或血栓調(diào)節(jié)蛋白基因、CD39、人類(lèi)組織因子途徑抑制劑基因等的轉(zhuǎn)入。人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)的發(fā)展，例如：鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFNs)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)、規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR )技術(shù)，現(xiàn)今已能構(gòu)建多基因修飾，隨著基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，將有力的促進(jìn)異種移植從實(shí)驗(yàn)室向臨床轉(zhuǎn)化，但能否實(shí)現(xiàn)異種肺移植，臨床應(yīng)用還面臨著巨大的挑戰(zhàn)[26-27]。

八、組織工程肺

肺移植現(xiàn)今與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)有著廣泛的學(xué)科聯(lián)系，通過(guò)多學(xué)科交叉和肺移植團(tuán)隊(duì)建設(shè)，使知識(shí)結(jié)構(gòu)向基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)縱向延伸，將把新的研究成果及時(shí)整合，積極參與到國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)與協(xié)作中，并利用轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)(translational medicine)將基礎(chǔ)研究和臨床緊密連接。

現(xiàn)實(shí)生活中，利用移植肺中質(zhì)檢不合格的肺源，制造脫細(xì)胞支架成為了現(xiàn)實(shí)。脫細(xì)胞支架由細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，宏觀和微觀更接近解剖結(jié)構(gòu)。通過(guò)復(fù)合因子誘導(dǎo)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、分化。理想的細(xì)胞外基質(zhì)應(yīng)具備良好的生物相容性，在體內(nèi)不引起炎癥反應(yīng)和毒性反應(yīng)；能被自身組織所取代；在體內(nèi)可保持特定形狀；表面化學(xué)特性和表面微結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞的粘附和生長(zhǎng)；降解速率可根據(jù)不同細(xì)胞的再生速率而進(jìn)行調(diào)整。脫細(xì)胞后支架的質(zhì)量評(píng)估：可通過(guò)分析基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)、毛細(xì)血管基底膜和肺泡小葉間隔是否保留完整，其中上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞是否容易黏附和分化將是脫細(xì)胞是否成功的重要指標(biāo)。 肺組織工程為解決移植免疫排斥帶來(lái)了新希望，目前仍有許多研究障障，需要更多的努力和探索[28]。

九、免疫功能調(diào)控

肺移植的免疫調(diào)控貫穿于免疫應(yīng)答的全過(guò)程，移植免疫可以通過(guò)多層面、多種機(jī)制包括表觀遺傳調(diào)控機(jī)體的免疫細(xì)胞功能，移植損傷可能改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，通過(guò)mRNA修飾如RNAm6A的修飾從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。m6A修飾經(jīng)IL-7/STAT5/SCOS信號(hào)通路控制T細(xì)胞免疫穩(wěn)態(tài)。蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modification, PTM)參與了關(guān)鍵免疫信號(hào)通路的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)生、分化、活化、功能和終止，以及體液免疫的精準(zhǔn)調(diào)控。通過(guò)能量代謝途徑亦可影響免疫系統(tǒng)對(duì)DMAPs的感知和應(yīng)答[29]。

十、結(jié)語(yǔ)

隨著肺移植手術(shù)適應(yīng)證的不斷拓展，呼吸道微生態(tài)免疫、AMR、外泌體、DMAPs、miRNA和lncRNA，以及免疫細(xì)胞功能的表觀調(diào)控、PTM調(diào)控和細(xì)胞代謝調(diào)控，為我們深入研究肺移植免疫機(jī)制的全貌提供了契機(jī)。移植排斥反應(yīng)涉及多種免疫細(xì)胞，T細(xì)胞和B細(xì)胞是機(jī)體的二大衛(wèi)士，在移植排斥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在移植的實(shí)體器官中，肺的獲取、保護(hù)和保存有其特殊性。臨床免疫抑制劑以聯(lián)合應(yīng)用、局部給藥和誘導(dǎo)免疫耐受為主要措施。再移植是治療肺移植術(shù)后移植肺衰竭的重要手段。異種移植的免疫學(xué)障礙通過(guò)基因工程、嵌合體誘導(dǎo)耐受等技術(shù)逐漸得到克服。組織工程肺為擴(kuò)大供肺來(lái)源提供了新的途徑。