賴誠 李明新

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥之一[1]。視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)作為血-視網(wǎng)膜外屏障(blood-retinal barrier，BRB)的重要部分，在DR發(fā)展過程中出現(xiàn)了不可逆的細(xì)胞和分子功能障礙[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-B(vascular endothelial growth factor-B，VEGF-B)與VEGF-A一樣與VEGFR1和NP1兩種受體結(jié)合，已被證明是一種有效的神經(jīng)保護(hù)因子和不同類型神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的抑制劑[3-6]。Huang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境能上調(diào)RPE細(xì)胞內(nèi) VEGFR1和NP1表達(dá)，VEGF-B具有抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡作用，但機(jī)制尚不清楚。Li 等[4]發(fā)現(xiàn)，在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和皮層神經(jīng)元中，VEGF-B處理后能夠?qū)е录?xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracelluar regulated protein 1/2,ERK1/2)活化。因此，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上探討VEGF-B對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(human retinal pigmentepithelial cells，HRPE-19)細(xì)胞株ARPE-19在高糖環(huán)境下細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制，為臨床上各種視網(wǎng)膜退行性病變的治療提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器ARPE細(xì)胞株(American Type Culture Collection，ATCC，美國)；VEGF-B(Peprotech，美國)；PD98059(Cell Signaling，美國)；DMEM/F-12培養(yǎng)基及胎牛血清(Gibco，美國)；CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)； SDS-PAGE試劑盒(碧云天，中國)；Western blot二抗(Santa Cruz，美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takala公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冷凍超速離心機(jī)、流式細(xì)胞儀(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組ARPE-19用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DEME/F12培養(yǎng)基于 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2，濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基更換為無血清5.6 mmol·L-1DMEM培養(yǎng)基同步化24 h。將其分為正常組(體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+5.6 mmol·L-1葡萄糖)、高糖組(體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+30 mmol·L-1葡萄糖)、藥物組(100 μg·L-1VEGF-B+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+30 mmol·L-1葡萄糖)、抑制組[20 μmol·L-1PD98059(ERK1/2阻滯劑)+100 μg·L-1VEGF-B+體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清+30 mmol·L-1葡萄糖]。

1.2.2 CCK8檢測(cè)各組細(xì)胞存活率各組ARPE-19以每孔5000個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入100 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h使細(xì)胞貼壁，換體積分?jǐn)?shù)1.5%胎牛血清的培養(yǎng)基同步化，予相應(yīng)處理后棄培養(yǎng)基，每孔中加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的光密度(A)值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率胰蛋白酶消化并收集各組細(xì)胞，1000 r·min-1離心5 min，棄上清液。PBS洗滌兩次，1000 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入500 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞后各加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光20～30 min,1000 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μL PI混勻，室溫避光保存，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、ERK1/2、p-ERK1/2的表達(dá)BCA法測(cè)定蛋白濃度，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉3 h，加入一抗(抗Bcl-2、Bax抗體為1500，抗p-ERK抗體為11000，抗ERK抗體為12000)，4 ℃過夜，洗膜3次；加入二抗室溫2 h后，洗膜5次。ECL顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達(dá)用Trizol試劑提取RNA，測(cè)量RNA濃度。Bax上游引物為5’-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3’，下游引物為5’-GTCCAGCC CATGATGGTTCT-3’；Bcl-2上游引物為5’- TTCTTTGA GTTCGGTGGGGTC-3’，下游引物為5’-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3’。采用RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min預(yù)變性，95 ℃ 20 s、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，收集并分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組和藥物組細(xì)胞體積大，有突起從胞體伸出；高糖組細(xì)胞皺縮變圓，體積明顯變?。慌c高糖組相比，抑制組細(xì)胞體積大，突起多。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)(×200)

2.2 CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞活性與高糖組相比，正常組、藥物組、抑制組在450 nm處的A值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=57.126、31.649、20.859，均為P<0.05)。與正常組相比，高糖組細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.411,P<0.05)；與高糖組相比，藥物組細(xì)胞存活率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.129，P<0.05)；抑制組細(xì)胞存活率介于高糖組與藥物組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=482.606，P<0.05)。見表1。

組別A值細(xì)胞存活率/%正常組0.685±0.011100.000±3.000高糖組0.308±0.00244.979±0.452藥物組0.506±0.06473.260±1.507抑制組0.414±0.00860.538±1.413

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率各組細(xì)胞凋亡率為：正常組(3.29±0.67)%、高糖組(15.50±0.45)%、藥物組(8.41±1.05)%、抑制組(10.33±1.14)%。與正常組相比，高糖組細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.895，P<0.05)；與高糖組相比，藥物組細(xì)胞凋亡率減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.655，P<0.05)。抑制組細(xì)胞凋亡率介于高糖組和藥物組之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=98.358，P<0.05)。見圖2。

2.4 Western blot檢測(cè)各組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá)與正常組比較，高糖組Bcl-2表達(dá)減少、Bax表達(dá)增多、Bcl-2/Bax比值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.264、25.626、56.885，均為P<0.05)；與高糖組比較，藥物組及抑制組Bcl-2表達(dá)均增多(t=7.383、5.327 ，均為P<0.05)，Bax表達(dá)均降低(t=15.087、6.890，均為P<0.05)，Bcl-2/Bax比值均升高(t=9.240、7.464， 均為P<0.05)；與藥物組比較，抑制組Bcl-2表達(dá)減少、Bax表達(dá)增多、Bcl-2/Bax比值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.717、7.580、5.240，均為P<0.05)。見圖3。

與正常組比較，高糖組p-ERK1/2表達(dá)量增多(t=9.067，P<0.05)；與高糖組比較，藥物組及抑制組p-ERK1/2表達(dá)量均增多(t=20.505、8.244 , 均為P<0.05)；與藥物組比較，抑制組p-ERK1/2表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.028，P<0.05)。四組總的ERK1/2表達(dá)水平不變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.050，P>0.05)。見圖4。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá) 與正常組比較，*P<0.05;與高糖組比較，#P<0.05;與藥物組比較，&P<0.05

圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá) 與正常組比較，*P<0.05;與高糖組比較，#P<0.05;與藥物組比較，&P<0.05

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達(dá)與正常組比較，高糖組的Bcl-2 mRNA表達(dá)量降低、Bax mRNA表達(dá)量增加、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.264、25.626、56.885，均為P<0.05)；與高糖組比較，藥物組Bcl-2 mRNA表達(dá)量增加、Bax mRNA表達(dá)量降低、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.383、15.087、9.240，均為P<0.05)。抑制組Bcl-2 mRNA與Bax mRNA表達(dá)量介于高糖組和藥物組之間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=90.178、171.518，均為P<0.05)。見表2。

組別Bcl-2 mRNABax mRNABcl-2 mRNA/Bax mRNA正常組1.00±0.031.00±0.021.00±0.01高糖組0.40±0.044.49±0.090.17±0.02藥物組0.71±0.021.92±0.060.55±0.06抑制組0.63±0.023.27±0.090.33±0.02

3 討論

VEGF-B是血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞的有效存活因子[3]，主要通過結(jié)合VEGFR1和NP1兩種受體發(fā)揮生理功能，但其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑目前尚不清楚[8]。RPE細(xì)胞是視網(wǎng)膜中VEGF的主要來源之一[9]，有研究表明，RPE細(xì)胞可能是高糖條件下VEGF-B主要靶細(xì)胞[7]。Huang等[7]利用大鼠糖尿病模型研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-B及其受體在正常大鼠視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜中表達(dá)，且被高糖上調(diào)，同時(shí)導(dǎo)致Akt、Erk的活化，證實(shí)了VEGF-B抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。本研究通過CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率及AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下ARPE-19細(xì)胞體積變小皺縮變圓，細(xì)胞存活率明顯下降，凋亡率明顯升高。而VEGF-B處理后細(xì)胞存活率明顯上升，凋亡率明顯下降，證實(shí)VEGF-B通過抑制凋亡率來實(shí)現(xiàn)對(duì)高糖環(huán)境下ARPE-19的保護(hù)作用。本研究與劉玉潔等[10]研究VEGF-B對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株(retinal ganglion cell-5,RGC-5)細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)和抑制細(xì)胞凋亡結(jié)果是一致的。

ERK1/2在細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用[11]。研究表明，長(zhǎng)期高糖應(yīng)激激活p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和JNK，上調(diào)線粒體Bim，下調(diào)Bcl-2[12]；Bcl-2蛋白具有抗凋亡作用，而Bax蛋白是促凋亡蛋白的家族成員，Bcl-2與Bax的比值反映細(xì)胞凋亡的水平[13]。 本實(shí)驗(yàn)采用ARPE-19為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)VEGF-B影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中VEGF-B通過增加ARPE-19的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)、降低促凋亡蛋白Bax表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用，而VEGF-B的抗凋亡作用可以被ERK1/2阻滯劑PD98059部分阻斷，其中四組總的ERK1/2表達(dá)不變。p-ERK1/2是ERK1/2的活性形式，p-ERK1/2表達(dá)量在藥物組較高糖組增加，而抑制組的p-ERK1/2表達(dá)量比藥物組下降。這與Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)VEGF-B主要通過抑制BH3-only蛋白基因從而抑制多種細(xì)胞凋亡，其中在小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，VEGF-B處理導(dǎo)致ERK1/2活化的結(jié)果相似。生理狀態(tài)下p-ERK1/2表達(dá)水平較低，當(dāng)受到應(yīng)激損傷刺激后，p-ERK1/2表達(dá)水平升高發(fā)揮保護(hù)作用，而VEGF-B處理后p-ERK1/2表達(dá)水平更高，且經(jīng)ERK1/2抑制劑處理后p-ERK1/2表達(dá)水平明顯下降，提示VEGF-B對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的ARPE-19凋亡的保護(hù)作用部分是通過ERK1/2信號(hào)通路完成的。

本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)，相較于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，影響因素相對(duì)單一，利于人為控制，適合藥物作用機(jī)制的研究。其次，體外培養(yǎng)ARPE-19可以創(chuàng)造無血管內(nèi)皮細(xì)胞參與的實(shí)驗(yàn)條件，有利于研究VEGF-B直接作用視網(wǎng)膜細(xì)胞來保護(hù)視神經(jīng)的可能性。不足之處在于缺少體內(nèi)實(shí)驗(yàn)支持，難于解釋復(fù)雜的分子機(jī)制；同時(shí)樣本數(shù)較少，對(duì)結(jié)果可能有一定的影響?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)VEGF-B對(duì)高糖環(huán)境下的ARPE-19凋亡具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制部分是通過ERK1/2信號(hào)通路，調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax等相關(guān)基因的表達(dá)來完成。VEGF-B是否還與其他的凋亡相關(guān)蛋白有關(guān)則有待于進(jìn)一步的研究。