王若麟 賈亞男 朱繼巧 賀強(qiáng) 李先亮

器官移植是終末期器官衰竭的唯一治療選擇，免疫抑制治療的進(jìn)步顯著降低了急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，改善了短期移植物存活率。但慢性排斥反應(yīng)和免疫抑制藥的不良反應(yīng)如腎毒性、心血管風(fēng)險(xiǎn)增加和全身過度免疫抑制導(dǎo)致的機(jī)會性感染以及惡性腫瘤等仍然是患者遠(yuǎn)期存活的重大障礙。臨床上亟須找到新的策略來減少免疫抑制藥物的劑量，誘導(dǎo)臨床免疫耐受[1]。免疫耐受的建立依賴于針對供者產(chǎn)生的主動免疫抑制機(jī)制，即在供器官特殊免疫微環(huán)境影響下，形成由多種調(diào)節(jié)性細(xì)胞共同組成的免疫負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。調(diào)節(jié)性細(xì)胞過繼回輸已在動物實(shí)驗(yàn)中證明了其誘導(dǎo)免疫耐受的巨大潛力。

2011 年，Li 等[2]提出通過調(diào)節(jié)性細(xì)胞過繼回輸，重塑受體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，誘導(dǎo)免疫耐受的概念，并在大鼠的心臟移植模型中得到驗(yàn)證。同年，為評估調(diào)節(jié)性細(xì)胞在實(shí)體器官移植領(lǐng)域應(yīng)用的有效性和安全性，在歐盟資助下，法國南特器官移植中心和德國Rosenberg 移植中心牽頭在歐洲開展器官移植領(lǐng)域第一個(gè)調(diào)節(jié)性細(xì)胞的臨床試驗(yàn)研究——The One Study[3]，開啟了調(diào)節(jié)性細(xì)胞臨床研究的序幕。近年來，隨著細(xì)胞治療在腫瘤治療領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展，藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（good manufacturing practice，GMP）下的細(xì)胞分選、擴(kuò)增技術(shù)日趨完善和標(biāo)準(zhǔn)化，越來越多的調(diào)節(jié)性細(xì)胞回輸被應(yīng)用于臨床研究，取得了令人矚目的成效[4-6]。本文主要綜述調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）、髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）、調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞（regulatory B cell，Breg）在動物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中的進(jìn)展，總結(jié)調(diào)節(jié)性細(xì)胞過繼回輸臨床上所面臨的主要問題，展望基于免疫評估細(xì)胞治療概念，以期加深對調(diào)節(jié)性細(xì)胞治療的理解，為臨床應(yīng)用找到新的突破口。

1 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞過繼回輸

Treg 作為最早被發(fā)現(xiàn)、定義的調(diào)節(jié)性細(xì)胞亞群，在動物實(shí)驗(yàn)中得到了充分的論證，也最先被應(yīng)用于臨床研究。1995 年，Sakaguchi 等[7]報(bào)道了Treg 是一種表達(dá)高水平白細(xì)胞介素-2 受體α（interleukin-2 receptor α，IL-2Rα）（CD25）的CD4+T 細(xì)胞亞群，可以保護(hù)胸腺切除小鼠免受自身免疫的攻擊。2003 年，F(xiàn)oxp3 被確定為Treg 表型和功能的主要轉(zhuǎn)錄因子后，大量的研究集中于CD4+Treg，證明了其免疫抑制能力及潛在機(jī)制，為臨床應(yīng)用鋪平了道路[8]。

2016 年Todo 等[9]報(bào)道了關(guān)于Treg 治療的首項(xiàng)研究，對10 例肝移植受者使用富集的供者特異性Treg 聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)免疫抑制藥治療，在術(shù)后18 個(gè)月內(nèi)逐漸停藥，所有受者均維持移植物功能穩(wěn)定，其中7 例患者成功實(shí)現(xiàn)免疫耐受停用免疫抑制藥，3 例因自身免疫性肝病行肝移植的受者在后續(xù)免疫抑制藥停用中發(fā)生了輕度排斥反應(yīng)，這可能是受者自身免疫調(diào)節(jié)失衡所致。2020 年Sánchez-Fueyo 等[4]也報(bào)道了對9 例肝移植在術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)免疫抑制治療的同時(shí)過繼回輸CD4+CD25+Treg，1 年內(nèi)均未發(fā)生排斥反應(yīng)和明顯不良反應(yīng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)4.5×106/kg 劑量回輸?shù)幕颊? 個(gè)月內(nèi)均可檢測到循環(huán)Treg 明顯升高，而以1×106/kg 回輸?shù)幕颊卟荒?。這提示過繼回輸?shù)挠行钥赡芤蕾嚦渥愕募?xì)胞量。

腎移植的臨床試驗(yàn)也得到了令人欣慰的結(jié)果。2017 年Chandran 等[10]體外分離CD4+CD127low/-CD25+Treg 與氘代葡萄糖培養(yǎng)進(jìn)行標(biāo)記，擴(kuò)增后約109Treg 分次自體回輸給3 例腎移植受者，回輸?shù)腡reg 循環(huán)濃度1 周后達(dá)到巔峰，僅3 個(gè)月內(nèi)可以檢測到，3 例受者均未發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。隨后又有研究報(bào)道的腎移植臨床試驗(yàn)證明了Treg 回輸?shù)目尚行约坝行訹5-6]，共32 例患者接受了CD4+CD25+Treg 回輸治療，所有受者隨訪期內(nèi)均未發(fā)生排斥反應(yīng)，未增加感染風(fēng)險(xiǎn)，無新發(fā)惡性腫瘤。僅1 例接受低細(xì)胞劑量治療的患者在移植術(shù)后1 年出現(xiàn)低滴度的供者特異性抗體，并在2 年隨訪后出現(xiàn)原發(fā)病復(fù)發(fā)。Harden 等[5]對12 例受者進(jìn)行了長達(dá)4 年的隨訪，Treg 回輸顯著減少了移植物中炎癥細(xì)胞浸潤，4 例成功實(shí)現(xiàn)最小化免疫抑制。

CD8+Treg 作為最早被發(fā)現(xiàn)的抑制性T 細(xì)胞亞群，最初因缺乏明確的表型而在基礎(chǔ)研究中起步較晚[11]。CD8+效應(yīng)T 細(xì)胞已在臨床上已被用作過繼回輸治療癌癥和感染性疾病，但仍未有臨床上用作過繼回輸治療自身免疫性疾病或誘導(dǎo)移植免疫耐受的報(bào)道。隨著越來越多的研究證明了CD8+Treg 的強(qiáng)大免疫抑制能力，RESHAPE 聯(lián)盟發(fā)起了一項(xiàng)名為Eight-Treg 的臨床Ⅰ期研究，旨在探究腎移植受者過繼回輸CD8+Treg 的安全性、有效性及劑量[11]。相信CD8+Treg 作為調(diào)節(jié)性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，可與多種細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同調(diào)節(jié)作用，在細(xì)胞回輸治療中將會發(fā)揮巨大作用[12]。

2 髓源性抑制細(xì)胞過繼回輸

MDSC 是一群具有異質(zhì)性的未成熟髓系細(xì)胞，具有負(fù)向調(diào)節(jié)免疫功能。在小鼠中被定義為CD11b+Gr1+，根據(jù)表型及形態(tài)可進(jìn)一步分為兩類：具有單核細(xì)胞樣形態(tài)的M-MDSC（CD11b+Ly6ChiLy6G-）和具有粒細(xì)胞樣形態(tài)的G-MDSC（CD11b+Ly6ClowLy6G+）[13]。人MDSC 的表型是CD33+CD11b+HLA-DR-/low[14]。與小鼠類似，人MDSC 也分為2 個(gè)不同的亞群，分別為CD33+CD11b+HLA-DR-CD14+CD15-和CD33+CD11b+CD15+CD66b+，但具體仍然存在爭議[15]。

MDSC 可通過與其他免疫細(xì)胞相互作用從而發(fā)揮強(qiáng)大的免疫抑制功能，是誘導(dǎo)免疫耐受的潛在工具。過繼回輸MDSC 的治療作用已在動物模型中得到證實(shí)。Drujont 等[16]發(fā)現(xiàn)在皮膚移植當(dāng)日單次注射脂多糖激活的MDSC 可提高移植物的存活率，而每周重復(fù)注射可更大程度提高移植物存活率。利用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 體外刺激小鼠MDSC，過繼回輸后可抑制血管生成，延長角膜、胰島移植物存活[17-18]。在大鼠心臟和腎臟移植模型中，MDSC 通過建立CC 趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）5 移植物-外周梯度引導(dǎo)Treg 從次級淋巴器官遷移到移植物部位[19]。鑒于MDSC 和Treg 的這種協(xié)同作用，在小鼠皮膚移植的模型中發(fā)現(xiàn)，接受粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）誘導(dǎo)的MDSC 和IL-2 誘導(dǎo)的Treg 聯(lián)合過繼回輸后表現(xiàn)出了更好的效果[20]。

但一些腎移植模型中得到了相反的結(jié)論，Dugast等[21]從耐受大鼠中分離了2×106個(gè)MDSC 進(jìn)行多次過繼回輸，并沒有顯著延長腎移植大鼠的存活時(shí)間。Ezzelarab 等[22]針對猴腎移植的研究中，與對照組相比，移植術(shù)后7 d 和14 d，移植物存活情況和病理變化不受自體M-MDSC（CD14+HLA-DR-CD33+）過繼回輸?shù)挠绊?。這說明了我們對MDSC 的認(rèn)識仍存在局限，再加上其免疫抑制表型、刺激方案尚不明確，這也使得目前在器官移植領(lǐng)域暫無過繼回輸MDSC 的臨床試驗(yàn)報(bào)道。相信隨著研究的不斷深入，MDSC 會成為細(xì)胞治療中的重要環(huán)節(jié)[23]。

3 調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞過繼回輸

21 世紀(jì)初，Breg 的概念被提出，指的是具有抑制性特征的B 細(xì)胞亞群，通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β、IL-10 等調(diào)節(jié)細(xì)胞因子發(fā)揮其功能，抑制T 細(xì)胞增殖和輔助性T 細(xì)胞（helper T cell，Th）1 生成細(xì)胞因子（干擾素-γ 和腫瘤壞死因子-α）[24-25]。動物模型研究表明，回輸少量體外擴(kuò)增的Breg 足以保護(hù)受體長期抵抗各種自身免疫性疾病，表明Breg 在體內(nèi)或可以與其他免疫抑制細(xì)胞產(chǎn)生有效的免疫抑制級聯(lián)反應(yīng)[26]。除抑制Th1 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答外，B 細(xì)胞還誘導(dǎo)效應(yīng)T 細(xì)胞生成1 型Treg（Tr1）。Gray 等[27]報(bào)道，凋亡細(xì)胞可以誘導(dǎo)T 細(xì)胞和B 細(xì)胞分泌IL-10。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)來源于B 細(xì)胞的IL-10 是誘導(dǎo)分泌IL-10 的T 細(xì)胞的必要條件，表明Breg 的功能對于維持免疫穩(wěn)態(tài)和耐受性至關(guān)重要[28]。

與其他調(diào)節(jié)性細(xì)胞相比，Breg 在移植中的應(yīng)用十分有限。但許多動物實(shí)驗(yàn)證明了其在誘導(dǎo)免疫耐受中的巨大潛力。在胰島細(xì)胞移植的小鼠模型中，使用抗T 細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域分子（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule，TIM）-1 抗體在體內(nèi)擴(kuò)增TIM-1+B10 細(xì)胞，可顯著延長胰島細(xì)胞同種異體移植物的存活時(shí)間。過繼轉(zhuǎn)移的TIM-1+B10 細(xì)胞以抗原特異性方式表現(xiàn)出強(qiáng)效的耐受活性，以延長胰島細(xì)胞同種異體移植物的存活，同時(shí)提高受體中Treg 的水平[29]。

在腎移植中，與仍需要免疫抑制的穩(wěn)定患者或發(fā)生慢性排斥反應(yīng)患者相比，達(dá)到免疫耐受的患者表現(xiàn)出Breg 水平升高[30]。雖然仍缺乏直接過繼回輸Breg 促進(jìn)免疫耐受的臨床研究，但上述研究表明Breg 在誘導(dǎo)移植免疫耐受中具有重要作用，可作為細(xì)胞回輸?shù)臐撛谥委熯x擇。

4 調(diào)節(jié)性細(xì)胞回輸治療所面臨的挑戰(zhàn)

除上述3 種調(diào)節(jié)性細(xì)胞外，還有調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性自然殺傷細(xì)胞等共同構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，為調(diào)節(jié)性細(xì)胞治療提供了多種可選擇的工具[31-32]。雖然Treg 的過繼回輸在臨床試驗(yàn)中取得了令人樂觀的成果，證明了調(diào)節(jié)性細(xì)胞治療的安全性、有效性，然而距離臨床大規(guī)模應(yīng)用調(diào)節(jié)性細(xì)胞仍存在許多有待解決的挑戰(zhàn)[33]，包括：（1）確立標(biāo)準(zhǔn)化的調(diào)節(jié)性細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增方案，在兼顧細(xì)胞表型和功能多樣性前提下保證體外擴(kuò)增細(xì)胞調(diào)節(jié)性功能的穩(wěn)定性，這也是Breg 等“環(huán)境反應(yīng)性”細(xì)胞所面臨的最大問題。（2）確保所輸注的細(xì)胞到達(dá)靶器官，目前觀點(diǎn)認(rèn)為基于細(xì)胞的免疫治療的成功依賴于細(xì)胞募集到靶器官、在區(qū)域內(nèi)發(fā)揮免疫抑制的功能。在體內(nèi)追蹤回輸細(xì)胞對于評價(jià)其治療效能有重要價(jià)值。嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）細(xì)胞技術(shù)、單光子發(fā)射斷層掃描、正電子發(fā)射斷層掃描等新興技術(shù)有望為解決這一難題提供新的思路。（3）在目前的臨床試驗(yàn)中缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的療效評估指標(biāo)或有效的療效替代終點(diǎn)，不同中心的臨床研究所報(bào)道的結(jié)果通常不具有可比性，難以評估及驗(yàn)證結(jié)論的一致性，這極大地阻礙了細(xì)胞治療領(lǐng)域的快速發(fā)展。

5 嵌合抗原受體調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的應(yīng)用

如前所述，充足的功能穩(wěn)定的細(xì)胞數(shù)量與所輸細(xì)胞遷移至靶器官是細(xì)胞治療能否成功的關(guān)鍵。因此，與多克隆Treg 相比，單克隆供者特異性Treg 表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢，CAR 細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展為獲得供者特異性Treg 提供了新的方案[34-35]。HLA-A2 作為引起排斥反應(yīng)的主要分子靶點(diǎn)受到了廣泛應(yīng)用。

在臨床前研究中，MacDonald 等[36]將人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）移植到免疫缺陷小鼠中引起異種移植物抗宿主病后進(jìn)行細(xì)胞回輸治療，發(fā)現(xiàn)與接受非特異性CAR-Treg 或多克隆Treg 治療的小鼠相比，接受HLA-A2-CAR-Treg 治療的小鼠存活率顯著提高。同樣，在免疫缺陷小鼠的人類皮膚異種移植模型中，HLA-A2-CAR-Treg 比多克隆Treg 更有效地保護(hù)了移植物[37]。除此之外，多項(xiàng)人源化小鼠皮膚移植模型研究證明了HLA-A2-CAR-Treg 能夠更快速、更完全地遷移至移植物中[38-39]，高效發(fā)揮免疫抑制作用。同時(shí)，在體外研究中發(fā)現(xiàn)CAR-Treg 在同種異體抗原的刺激下能夠產(chǎn)生IL-10，構(gòu)建抑制性免疫微環(huán)境[40]。除CD4+Treg 外，CD8+CAR Treg 在臨床前模型中同樣表現(xiàn)出高效的抑制活性，可能與CD4+Treg 協(xié)同發(fā)揮作用[41]。

目前，在實(shí)體器官移植領(lǐng)域CAR Treg 治療臨床研究已陸續(xù)開展。一項(xiàng)多中心試驗(yàn)（STEADFAST）擬納入接受HLA-A*02 陽性供體腎臟的HLA-A*02陰性患者，給予HLA-A*02-CAR-Treg 治療，與無細(xì)胞治療的對照組進(jìn)行對比，以評估CAR Treg 的安全性和療效[40]。另一項(xiàng)臨床研究（LIBERATE）對肝移植受者接受HLA-A2-CAR-Treg 治療的療效進(jìn)行了觀察[42]。這些研究將使我們有機(jī)會監(jiān)測CAR-Treg 在移植物及外周的定位、表型、持久性和功能，對后續(xù)研究具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。

然而CAR-Treg 的應(yīng)用同樣存在許多問題有待解決，如暫無明確的給藥時(shí)機(jī)與劑量、潛在的細(xì)胞因子風(fēng)暴風(fēng)險(xiǎn)、CAR-Treg 在體內(nèi)易于被耗盡等，仍需在完備的細(xì)胞治療體系下明確給藥方案，監(jiān)控全身過度免疫抑制風(fēng)險(xiǎn)，找到明確的療效替代終點(diǎn)。

6 基于量化免疫評分的細(xì)胞治療體系

如果將個(gè)體的免疫狀態(tài)看作一個(gè)“天平”，左右兩端分別代表過度免疫激活（自身免疫疾病、排斥反應(yīng)）與過度免疫抑制（機(jī)會性感染、惡性腫瘤），那么正向和負(fù)向的細(xì)胞因子以及免疫細(xì)胞亞群就像分別加在左右兩端的“砝碼”。負(fù)向調(diào)節(jié)性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)與正向效應(yīng)細(xì)胞之間存在復(fù)雜的相互作用，在生理及病理狀態(tài)下，這些相互作用及反饋調(diào)節(jié)機(jī)制共同維持著免疫穩(wěn)態(tài)。這就要求我們將免疫環(huán)境看作一個(gè)整體，辯證地看待。當(dāng)免疫環(huán)境中出現(xiàn)同種異體移植物，“免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)定點(diǎn)”開始向免疫激活的方向傾斜，同時(shí)細(xì)胞間相互作用的機(jī)制開始防止免疫過度激活，然而自然調(diào)節(jié)機(jī)制往往難以對抗移植物造成的巨大沖擊，在無免疫抑制藥的情況下會造成調(diào)節(jié)紊亂，導(dǎo)致排斥反應(yīng)。調(diào)節(jié)性細(xì)胞的過繼回輸技術(shù)提供了最直接有效干預(yù)“免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)定點(diǎn)”的手段。

筆者所在團(tuán)隊(duì)有邏輯性地選擇淋巴細(xì)胞亞群，通過淋巴細(xì)胞功能和數(shù)量分析，建立統(tǒng)一的算法模型，最終形成了一個(gè)免疫評分，正常健康人群的免疫評分設(shè)為0 分，負(fù)分過低和正分過高分別代表免疫抑制和免疫水平激活。銘道全面免疫狀態(tài)評估分析技術(shù)（MICA）和銘道免疫量化評分體系（MISS），成功將“免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)定點(diǎn)”量化，可應(yīng)用于臨床的免疫監(jiān)測評估體系[43]。前期研究已在肝移植術(shù)后個(gè)體化免疫抑制管理中取得了顯著成效[44]。在此基礎(chǔ)上，以免疫穩(wěn)態(tài)（MISS 評分趨近于0）為細(xì)胞治療的療效替代終點(diǎn)，建立基于免疫評估的細(xì)胞治療體系，將有效解決所面臨的療效評估、療效終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化問題，若同時(shí)利用CAR 細(xì)胞技術(shù)對所回輸細(xì)胞進(jìn)行了特異性編輯，將做到整體醫(yī)學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的辯證統(tǒng)一。

7 展 望

近年來，細(xì)胞治療的相關(guān)研究及產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，對調(diào)節(jié)性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的機(jī)制及協(xié)同作用，研究不斷深入，對免疫系統(tǒng)有了更為全面的認(rèn)識。推動調(diào)節(jié)性細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用于臨床，將對器官移植受者的遠(yuǎn)期預(yù)后帶來巨大改善。