摘要：【目的】揭示馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便中可培養(yǎng)細菌群落結構及多樣性，為系統(tǒng)研究該蟲腸道菌群多樣性及相關細菌功能提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳择R鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便和干糞便為研究對象，采用培養(yǎng)分析法將幼蟲糞便菌懸液于LB培養(yǎng)基上進行細菌分離培養(yǎng)和純化，根據(jù)16S rDNA雙向測序結果，結合細菌菌株的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征進行分類鑒定；利用Contigexpress對測序結果進行序列拼接和校對，并將結果提交至NCBI（GenBank）數(shù)據(jù)庫比對；通過MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹；通過Margalef豐富度指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)等綜合評估新鮮糞便和干糞便中可培養(yǎng)細菌群落的多樣性。【結果】馬鈴薯塊莖蛾新鮮糞便中可培養(yǎng)細菌有3門9科9屬14種，其中蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）為優(yōu)勢種，相對豐度達71.25%。干糞便中可培養(yǎng)細菌有3門6科7屬11種，其中琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）和腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）為優(yōu)勢種，相對豐度分別為29.45%和18.70%。新鮮和干糞便中細菌群落物種多樣性指數(shù)分別為1.23和2.02、均勻度指數(shù)分別為0.47和0.84，表明干糞便可培養(yǎng)細菌多樣性高于新鮮糞便，且細菌群落種類組成更為均勻，而新鮮糞便可培養(yǎng)細菌種類組成相對集中?！窘Y論】馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便中的細菌種類豐富，且新鮮糞便與干糞便在可培養(yǎng)細菌的種類組成、優(yōu)勢種、豐富度和均勻度上均存在明顯差異，新鮮糞便中可培養(yǎng)細菌種類組成相對集中且群落表現(xiàn)出較高的物種豐富度，干糞便則展現(xiàn)出更均勻的細菌群落種類組成。

關鍵詞：馬鈴薯塊莖蛾；干糞便；新鮮糞便；細菌群落結構；多樣性

中圖分類號：S433.4 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2024）11-3298-13

Community structure and diversity of culturable bacteria in the feces of potato tuber moth（ Phthorimaea operculella Zeller） larvae

ZHANG Ling-ying1，2，3， SU Zao-tang1，2，3， ZHENG Ya-qiang3， XU Tian-mei3，4 WANG Wen-qian3， XIAO Guan-li1*， CHEN Bin3*

（1College of Agronomy and Biotechnology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China；College of Agronomy and Life Sciences， Zhaotong University， Zhaotong， Yunnan 657000， China； 3College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources in Yunnan， Kunming， Yunnan 650201， China； 4Mouding Branch， Chuxiong company， Yunnan Tobacco Company， Chuxiong， Yunnan 675500， China）

Abstract：【Objective】To reveal the community structure and diversity of culturable bacteria in the feces of potato tu‐ber moth（ Phthorimaea operculella Zeller） larvae， which provide scientific basis for a deeper understanding of the diver‐sity and function of its gut microbiota.【 Method】Fresh and dry feces of potato tuber moth larvae were used as research ob‐jects. The bacterial suspension of potato tuber moth larvae feces was isolated， cultured， and purified on LB medium using culture analysis method. Various species were classified and identified based on the results of 16S rDNA bidirectional se‐quencing， combined with the culture characteristics and morphological features of the strain. Contigexpress software was used for sequence assembly and proofreading of the sequencing results， and the results were submitted to the NCBI（ Gen‐Bank） database for alignment. A phylogenetic tree was constructed using MEGA7.0 software. The diversity of the cultura-ble bacterial community in fresh and dry feces was comprehensively assessed using Margalef richness index， Simpson dominance index， Shannon Wiener diversity index， and Pielou evenness index.【 Result】There were 3 phyla， 9 families， 9 genera and 14 species of culturable bacteria in the fresh feces of potato tuber moth， with Enterococcus mundtii being the dominant species， with 71.25% relative abundance. In the dry feces， there were 3 phyla， 6 families， 7 genera， and 11 species of culturable bacteria， with Staphylococcus succinus and Staphylococcus saprophyticus being the dominant species， relative abundances were 29.45% and 18.70% respectively. The bacterial community species diversity indexes in fresh and dry feces were 1.23 and 2.02 respectively， and the evenness indexes were 0.47 and 0.84 respectively. The results indicated that the diversity of culturable bacteria in dry feces was higher than that in fresh feces， and the bacterial community had a more even species composition， while the culturable bacterial community in fresh feces was rela‐tively concentrated in species composition. 【Conclusion】The bacterial species in potato tuber moth feces are abundant， and there are obvious differences in the composition of culturable bacteria， dominant species， richness， and evenness between fresh and dry feces， especially the culturable bacterial community in fresh feces is concentrated and show higher species richness， while the dry feces show a more even bacterial community composition.

Key words： potato tuber moth； dry feces； fresh feces； bacterial community structure； diversity

Foundation items： National Natural Science Foundation of China（32360711，31760519）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea opercu‐lella Zeller）又名馬鈴薯麥蛾，隸屬于鱗翅目（Lepi‐doptera）麥蛾科（Gelechiidae）（閆俊杰等，2019）。作為一種分布廣泛的害蟲，馬鈴薯塊莖蛾已遍布全球除南極洲外的六大洲，尤其在氣候溫暖、干燥、風力較小的馬鈴薯種植區(qū)域常見，對馬鈴薯生產構成嚴重威脅（Rondon and Xue，2010；Gao，2018）。馬鈴薯塊莖蛾的繁殖速度快，對溫度的耐受性高，對農藥具有較強的抗性，防治極為困難（Do?ramaci and Tingey，2010；馬艷粉等，2012；Andreadis et al.，2016）。昆蟲腸道微生物群對其消化和代謝過程、生長調節(jié)以及環(huán)境適應至關重要（楊紅和黃勇平，2018；李青晏等，2020）。而微生物可以通過“食物—腸道—糞便循環(huán)”模型傳播，因而昆蟲糞便細菌菌群組成能夠部分反映腸道的細菌菌群組成（Qin et al.，2022）。此外，不同種類昆蟲其糞便菌群組成不同，糞便中含有一些對昆蟲具有特殊功能的微生物（Wada-Katsumata et al.，2015；Suraporn et al.，2024）。因此，對昆蟲糞便細菌群落結構及其多樣性的研究，不僅有助于挖掘具有潛在應用價值的微生物，還可以加深對昆蟲生物學特性的理解，對系統(tǒng)研究糞便細菌對昆蟲生命活動的影響具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】昆蟲糞便細菌群落研究已引起學術界的廣泛關注。如Vencl等（2009）發(fā)現(xiàn)葉甲科昆蟲Chelymorpha alter‐nans享受著糞便中尖孢鐮刀菌（Fusarium oxyspo‐rum）的保護，在甲蟲脆弱的蛹期，尖孢鐮刀菌以某種方式抵御天敵昆蟲的捕食；當成年甲蟲從蛹中出來時，甲蟲會將尖孢鐮刀菌傳播到其共同宿主植物上。Leroy等（2011）從豌豆蚜蜜露中分離到1種相當于利它素功能的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri），其能提高食蚜蠅對蚜蟲的捕食效率，利用這種與寄主有關的細菌為控制田間和溫室系統(tǒng)的蚜蟲提供了一條新途徑。Chouvenc等（2013）發(fā)現(xiàn)臺灣乳白蟻（Coptotermes formosanus）將糞便用作其巢穴結構的建筑材料，糞巢中有多種腸道微生物群，其中鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）菌株#2338為臺灣乳白蟻群體提供了一層保護罩，使其免受天敵和病原體的侵害。李文紅等（2015）從小菜蛾幼蟲糞便中分離獲得5屬6種細菌，與腸道菌群結構具有一定的相似性，其中蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）數(shù)量最多，但這些菌株在體外具體的生理功能并不清楚。Azeem等（2015a，2015b）發(fā)現(xiàn)大松象蟲（Hylobius abietis）可以通過糞便覆蓋的方式來保護自身，其原因是糞便中漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、Ophios‐toma canum和Ophiostoma pluriannulatum等真菌可產生具有揮發(fā)性氣味的拒食素來對抗天敵。Diehl等（2015）發(fā)現(xiàn)不同齡期的歐洲球螋（Forficula auricu‐laria）糞便的抑菌活性存在差異，其中幼齡歐洲球螋糞便對真菌的抗性高于老齡歐洲球螋，但對細菌的抗性無明顯差異。Wada-Katsumata等（2015）發(fā)現(xiàn)德國小蠊（Blattella germanica）通過其糞便中的鳥腸球菌（Enterococcus avium）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）和不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）等細菌參與了聚集信息素的誘導生成，產生的聚集信息素有助于使德國小蠊彼此靠近。Grau等（2017）從地中海面蛾（Ephestia kuehniella）幼蟲糞便中分離出1株蒙氏腸球菌，該菌株對革蘭氏陽性和陰性細菌具有廣譜抗菌活性。張碩等（2020）對黃翅大白蟻（Macro‐termes barneyi）糞便進行了微生物種類分析，發(fā)現(xiàn)其終級糞便菌群結構與腸道菌群結構具有相似性，但終級糞便微生物的豐度明顯高于初級糞便（菌圃）。Suraporn等（2024）在家蠶幼蟲糞便中分離到8株潛在益生菌，其中5株糞腸球菌（Enterococcus faecalis）具有耐酸性、膽鹽耐受性以及細胞表面疏水性，可顯著提高腸道適應能力。上述研究表明，昆蟲糞便中的微生物群落不僅具有多樣性，而且在昆蟲的生存和適應中發(fā)揮關鍵作用。【本研究切入點】盡管近年來對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲腸道細菌群落結構、多樣性及功能的研究取得了一定進展（樊清艷等，2020，2021；Zheng et al.，2020；Wang et al.，2022a，2022b），但其糞便細菌群落結構、多樣性和功能還不清楚，尚待進一步研究?！緮M解決的關鍵問題】以馬鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便和干糞便為研究對象，采用培養(yǎng)分析法結合16S rDNA雙向測序技術對幼蟲糞便中可培養(yǎng)細菌進行分類鑒定，以期明確馬鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便和干糞便中可培養(yǎng)細菌群落結構及多樣性，為系統(tǒng)研究馬鈴薯塊莖蛾腸道菌群多樣性及相關細菌功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試蟲源：馬鈴薯塊莖蛾采集自云南省馬龍區(qū)月望鄉(xiāng)馬鈴薯種植基地（25°18′42″N，103°44′6″E），在室內用馬鈴薯薯塊（麗薯6號）飼養(yǎng)3代以上，直到構建穩(wěn)定種群。主要儀器設備：SW-CJ-1FD無菌超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、LDZM-40KCS-Ⅱ高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠公司）、2-16R高速冷凍離心機（湖南恒諾儀器設備有限公司）、T100 PCR儀（Bio-Rad公司）、1645050電泳儀（Bio-Rad公司）、萊卡ICC50W顯微鏡、佳能EOS-6D單反微距相機。主要試劑：氯化鈉、酵母粉和胰蛋白胨購自北京奧博星生物技術有限責任公司，瓊脂購自德國BioFroxx公司，細菌通用引物27F和1492R由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，Taq PCR Master Mix購自北京全式金生物技術有限公司。LB培養(yǎng)基：氯化鈉10 g、酵母粉5 g、胰蛋白胨10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH 7.0，121 ℃（101 kPa）蒸汽滅菌20 min（樊清艷等，2020）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便收集 試驗前通過高壓蒸汽滅菌鍋對培養(yǎng)皿、稱量紙、稱量勺和離心管等進行滅菌，收集糞便過程使用一次性無菌手套，減少因人為操作過程對糞便中細菌的污染。新鮮糞便收集：挑取200頭以馬鈴薯薯塊飼養(yǎng)的3齡幼蟲移入滅菌培養(yǎng)皿中，收集當天滅菌培養(yǎng)皿中的糞便。收集的糞便置于離心管并封口，放置在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫ㄈ戊o濤等，2007）。干糞便收集：與新鮮糞便收集方法相同，但培養(yǎng)皿中的糞便在蓋上培養(yǎng)皿蓋的情況下自然風干15 d，備用。

1. 2. 2 糞便原液制備及細菌的分離、純化 取0.1 g糞便加入0.9 mL無菌水，在30 ℃、200 r/min的搖床上振蕩浸提30 min，取出后置于高速離心機中，以3000 r/min離心1 min使糞便中的雜質沉淀，取上清液備用。通過稀釋涂布法培養(yǎng)糞便中微生物：將上清液分別稀釋為10-3、10-4和10-5 3個濃度梯度，然后分別吸取0.1 mL糞便上清液涂布在LB培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，統(tǒng)計各培養(yǎng)基上顏色、形態(tài)和大小各異的細菌菌落，并及時將不同形態(tài)的單菌落用新的無菌培養(yǎng)基進行多次轉接純化，取純化菌株用于后續(xù)研究（樊清艷等，2020）。試驗重復3次。

1. 2. 3 細菌菌株分子鑒定 參照馮廣達等（2013）采用凍溶法提取細菌DNA，使用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'- AAGGAGGTGATCCAGCC-3'）作為16S rDNA序列擴增的上、下游引物。PCR反應體系25.0 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進行32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1. 3 統(tǒng)計分析

1. 3. 1 可培養(yǎng)細菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Contigexpress對雙向測序原始序列進行拼接和校對，提交至NCBI（GenBank）數(shù)據(jù)庫比對，下載相似性最高的同源序列。將下載的序列通過MEGA 7.0，采用Neighbor-joining和Kimura雙參數(shù)矯正模型構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以重復抽樣1000次進行Bootstrap驗證，分析評估系統(tǒng)進化樹拓撲結構的穩(wěn)定性（張凌英等，2020）。

1. 3. 2 馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便中可培養(yǎng)細菌多樣性分析 細菌多樣性分析參數(shù)Margalef豐富度指數(shù)（D'）、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)（D）、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H'）和Pielou均勻度指數(shù)（J）等均用Excel 2013進行計算。

N=∑Ni， D'=， D=1-∑Pi2， H'=-∑Pi ln Pi，

J=H'/ln S。式中，Ni為物種i的個體數(shù)，N為群落中所有物種的總個體數(shù)，S為物種總數(shù)，Pi為物種i的個體數(shù)占全部個體數(shù)的比例（王蕊蕊等，2018）。

2 結果與分析

2. 1 馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便可培養(yǎng)細菌分離結果

分離結果顯示，無菌條件下通過自然干燥得到的干糞便與新鮮糞便中的細菌菌量存在顯著差異（Plt;0.05，下同），干糞便中的細菌菌量為7.1×106 CFU/g，而新鮮糞便中的細菌菌量高達1.3×107 CFU/g，后者的可培養(yǎng)菌量是前者的1.8倍?？膳囵B(yǎng)細菌的菌體形

態(tài)特征及培養(yǎng)性狀描述見表1，菌落形態(tài)見圖1。

干糞便經(jīng)稀釋涂布法培養(yǎng)分離得到23株細菌，其中共有11種典型的顏色、形狀、大小各異的細菌菌落。從菌落形態(tài)來看，分為不規(guī)則、邊緣葉形，圓形、邊緣規(guī)則，圓形、邊緣齒形，圓形、邊緣瓣狀，不規(guī)則、邊緣細小瓣狀等；從顏色來看，分為橘黃色、淡黃色、白色、初期白色后期深紅、黃色、乳白色、土黃色、黃色至白色等；從凸起狀態(tài)來看，分為隆起、凸起、高凸、四周隆起中央凹陷、中央略凹陷、中央微凸有褶皺、隆起、菌落扁平、四周較低中央凸起等；從透明度來看，分為不透明和邊緣透明；從濕潤度來看，所有菌株均為濕潤；從光澤度來看，分為無光澤和有光澤。

新鮮糞便經(jīng)稀釋涂布法培養(yǎng)分離得到24株細菌，其中共有14種典型的顏色、形狀、大小各異的細菌菌落。從菌落形態(tài)來看，分為圓形、邊緣規(guī)則，圓形、邊緣不規(guī)則，不規(guī)則、邊緣細小瓣狀，圓形、邊緣齒形等；從顏色來看，分為白色、淡黃色、黃色、乳白色、土黃色、黃色至白色等；從凸起狀態(tài)來看，分為表面褶皺狀凸起、表面褶皺中央凸起、中央凹陷四周褶皺隆起、凸起、中央略凹陷、中央微凸有褶皺、隆起、菌落扁平、四周較低中央凸起等；從透明度來看，分為不透明和邊緣透明；從濕潤度來看，分為半濕潤、濕潤和濕潤有黏性；從光澤度來看，分為無光澤和有光澤。

2. 2 馬鈴薯塊莖蛾幼蟲干糞便細菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析結果

提取馬鈴薯塊莖蛾幼蟲干糞便細菌菌株的基因組DNA并作為模板用于16S rDNA擴增及雙向測序，共獲得23條具有差異的DNA序列。將測序序列于GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結果（表2）顯示，23株細菌與模式菌株的相似性均在99.00%以上。

從系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2）可看出，馬鈴薯塊莖蛾幼蟲干糞便的可培養(yǎng)細菌可分為三大支11小支。第一大支由厚壁菌門（Firmicutes）菌株組成，Kd3141、Kd5241和Kd3143等10株菌株與已公布的隸屬于芽孢桿菌目（Bacillales）葡萄球菌科（Staphylococca‐ceae）葡萄球菌屬（Staphylococcus）的5株模式菌株首先聚為5小支，說明該10株來自馬鈴薯塊莖蛾幼蟲干糞便的細菌菌株之間親緣關系較近，10株菌再與模式菌株乳桿菌目（Lactobacillales）腸球菌科（Enterococcaceae）的蒙氏腸球菌（Enterococcus mun- dtii）及Kd5321和Kd4261聚為一大支。第二大支由放線菌門（Actinobacteria）菌株組成，Kd3231、Kd3131、Kd3171和Kd3161與已公布的微球菌目（Micrococ‐cales）微球菌科（Micrococcaceae）的鹽生谷氨酸桿菌（Glutamicibacter halophytocola）和噬尼古丁節(jié)桿菌（Paenarthrobacter nicotinovorans）2株模式菌株聚為2小支。第三大支由變形菌門（Proteobacteria）菌株組成，Kd5221、Kd5121、Kd3322和Kd4121與已公布的隸屬于假單胞菌目（Pseudomonadales）莫拉氏菌科（Moraxellaceae）的乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）聚為一小支，Kd4231、Kd3312和Kd3211與已公布的隸屬于腸桿菌目（Enterobacterales）歐文菌科（Erwiniaceae）的側耳泛菌（Pantoea pleuroti）和耶爾森菌科（Yersiniaceae）的深紅沙雷氏菌（Serratia

rubidaea）聚為另外2小支。

綜上所述，從馬鈴薯塊莖蛾幼蟲干糞便中分離出的23株細菌中，厚壁菌門（12株）、放線菌門（4株）和變形菌門（7株）菌株分別占總分離菌株的52.17%、17.39%和30.43%。12株厚壁菌門細菌中有4株與腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）關系密切，其次分離到3株琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）、2株蒙氏腸球菌、1株松鼠葡萄球菌、1株雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）、1株木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）；放線菌門細菌主要與鹽生谷氨酸桿菌（2株）和噬尼古丁節(jié)桿菌（2株）密切相關；7株變形菌門細菌中有4株與乙酸鈣不動桿菌關系密切，其次分離到2株深紅沙雷氏菌和1株側耳泛菌（Pantoea pleuroti）。

2. 3 馬鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便細菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析結果

提取馬鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便細菌菌株的基因組DNA并作為模板用于16S rDNA擴增及雙向測序，共獲得24條具有差異的DNA序列。將測序序列于GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結果（表3）顯示，24株細菌中除KW2331與模式菌株MK424284.1的相似性為98.79%外，其余菌株與模式菌株的相似性均在99.00%以上。

從系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）可看出，馬鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便的可培養(yǎng)細菌可分為三大支14小支。第一大支由厚壁菌門菌株構成，KW2141、KW2341和KW3341等10株菌株與已公布的隸屬于芽孢桿菌目葡萄球菌科葡萄球菌屬的4株模式菌株首先聚為4小支，表明該10株來自馬鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便的細菌菌株之間親緣關系較近；KW2391、KW22101和KW2292與已公布的隸屬于芽孢桿菌目芽孢桿菌科芽孢桿菌屬（Bacillus）的3株模式菌株聚為3小支，表明3株菌之間親緣關系較近；最后該2小支與乳桿菌目腸球菌科的模式菌株蒙氏腸球菌及KW2261小支聚在一起。第二大支由放線菌門菌株構成，第二大支可分為4小支，其中3小支分別由KW3331、KW2331、KW2372與微球菌目的皮桿菌科（Dermabacteraceae）、微桿菌科（Microbacteriaceae）和微球菌科（Micrococcaceae）的3株模式菌株組成，4小支由KW3261、KW2231和KW4391等5株菌與棒桿菌目（Corynebacteriales）棒狀桿菌科（Coryne‐bacteriaceae）的嗜甘氨酸棒桿菌（Corynebacterium glyciniphilum）組成。系統(tǒng)發(fā)育進化樹中最后一大支由變形菌門菌株構成，KW2371和KW2322分別與已公布的隸屬于腸桿菌目歐文菌科和腸桿菌科

（Enterobacteriaceae）的2株模式菌株聚為2小支。

綜上所述，從馬鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便中分離出的24株細菌菌株中，厚壁菌門（14株）、放線菌門（8株）和變形菌門（2株）菌株分別占總分離菌株的58.33%、33.33%和8.33%。14株厚壁菌門細菌中，有4株與琥珀葡萄球菌關系密切，其次分離到3株松鼠葡萄球菌、2株腐生葡萄球菌、1株雞葡萄球菌、1株空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius）、1株巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、1株暹羅芽孢桿菌（Bacil‐lus siamensis）和1株蒙氏腸球菌；8株放線菌門細菌中，有5株菌與嗜甘氨酸棒桿菌關系密切，其次為1株鼠李糖小短桿菌（Brachybacterium rhamnosum）、1株檸檬色短小桿菌（Curtobacterium citreum）、1株鹽生谷氨酸桿菌。變形菌門細菌主要與菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）（1株）及土生拉烏爾菌（Raoultella terrigena）（1株）密切相關。

2. 4 2種糞便中細菌的鑒定結果與數(shù)量比較

綜合各細菌菌株的培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色反應和16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育進化分析，共鑒定出3門6目11科12屬19種細菌，其中從新鮮糞便中分離出3門9科9屬14種細菌，從干糞便中分離出3門6科7屬11種細菌（圖4）。從2種糞便在稀釋涂布平板上的原始菌落統(tǒng)計數(shù)來看（表4），新鮮糞便和干糞便中的細菌菌落數(shù)量分別為1.31×107和7.13×106個/g，前者約為后者的1.8倍，表明2種類型糞便樣本中的可培養(yǎng)細菌種類差異明顯。在門分類水平上，2種糞便中厚壁菌門細菌均為優(yōu)勢門，新鮮糞便和干糞便中的相對豐度分別為86.26%、61.83%。屬分類水平上，新鮮糞便中腸球菌屬（Enterococcus）為優(yōu)勢屬，其相對豐度高達71.25%；而干糞便中葡萄球菌屬為優(yōu)勢屬，其相對豐度為58.56%。在種分類水平上，新鮮糞便中蒙氏腸球菌為優(yōu)勢種，其相對豐度高達71.25%；而干糞便中琥珀葡萄球菌和腐生葡萄球菌為優(yōu)勢種，2個種的相對豐度分別為29.45%和18.70%，表明新鮮糞便中的優(yōu)勢種類相對集中。

進一步分析馬鈴薯塊莖蛾幼蟲2種糞便樣本的細菌多樣性，結果顯示，新鮮糞便的D'=0.79、D=0.48、H'=1.23、J=0.47；干糞便的D'=0.63、D=0.83、H'= 2.02、J=0.84。從D'的角度看，新鮮糞便和干糞便中細菌群落物種D'分別為0.79和0.63，表明新鮮糞便中可培養(yǎng)細菌群落表現(xiàn)出較高的物種豐富度；從D、H'和J的角度看，新鮮糞便和干糞便中細菌群落物種D分別為0.48和0.83、H'分別為1.23和2.02、J分別為0.47和0.84，表明干糞便可培養(yǎng)細菌多樣性高于新鮮糞便，且細菌群落種類組成更為均勻，而新鮮糞便可培養(yǎng)細菌種類組成相對集中。

3 討論

本研究采用LB培養(yǎng)基對馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的糞便樣本進行細菌分離培養(yǎng)，旨在探究取食馬鈴薯薯塊的馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便中的細菌種類組成與多樣性。研究結果顯示，在屬分類水平上，新鮮和干糞便中共有12個細菌屬，但干糞便和新鮮糞便細菌種類組成存在明顯差異。具體而言，干糞便中分離得到7個細菌屬，新鮮糞便分離得到9個細菌屬，造成這種差異的主要原因可能是有些細菌對水分較敏感（馬馨怡等，2024），其隨著糞便的干燥失去活性而在培養(yǎng)基上無法培養(yǎng)；此外，在糞便含水量急劇減少過程中，微生物群落結構可能向有利于自身生存的方向發(fā)生改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯塊莖蛾幼蟲新鮮糞便和干糞便中厚壁菌門細菌相對豐度分別為86.26%、61.83%，遠高于放線菌門和變形菌門，表明厚壁菌門是馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便細菌組成的優(yōu)勢類群，與馬鈴薯塊莖蛾腸道細菌優(yōu)勢類群鑒定結果相似（鄭亞強等，2017）；此外，陳勃生等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，腸球菌屬是鱗翅目昆蟲腸道中優(yōu)勢菌屬，表明昆蟲糞便中的部分細菌很可能來自腸道，糞便細菌菌群組成能部分代表腸道的細菌菌群組成（ 李文紅等，2015）。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因與昆蟲腸道微生物的傳播途徑有關，部分微生物在昆蟲腸道內占有一定范圍并能長時間定居，而另一些過路群落可以隨著卵、菌胞、食物殘渣等排出體外（相輝和黃勇平，2007；Ohkuma and Brune，2010），從而在昆蟲糞便中被檢測到。

鄭亞強等（2017）從馬鈴薯塊莖蛾4齡幼蟲腸道中共分離到細菌8屬10種，而本研究從馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲糞便中分離到12屬19種細菌；在屬分類水平上，2個研究均分離到不動桿菌屬（Acineto‐bacte）和葡萄球菌屬；在種分類水平上，2個研究均分離到腐生葡萄球菌和松鼠葡萄球菌。產生差異的原因：一是可能與樣本來源和取樣方法不同有關；二是可能與馬鈴薯塊莖蛾的蟲源、齡期、薯塊品種和培養(yǎng)基種類有關。鄭亞強等（2017）的研究中，馬鈴薯塊莖蛾來源于云南省宣威市板橋鎮(zhèn)，采用合作88號馬鈴薯薯塊飼養(yǎng)，細菌樣本來源于馬鈴薯塊莖蛾腸道，所用的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，而本研究中的馬鈴薯塊莖蛾來源于云南省馬龍區(qū)月望鄉(xiāng)，采用麗薯6號馬鈴薯薯塊飼養(yǎng)，細菌樣本來源于馬鈴薯塊莖蛾的干糞便和新鮮糞便，所用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；三是細菌群落結構在“食物—腸道—糞便循環(huán)”模型傳遞過程中會發(fā)生變化。Qin等（2022）通過共現(xiàn)網(wǎng)絡分析與三元相圖分析研究家蠶幼蟲食物組、腸道組及糞便組中細菌群落結構關系，發(fā)現(xiàn)在屬分類水平上腸道組和糞便組中的微生物種群數(shù)量更多，且腸道組和糞便組的細菌群落結構關系更密切，但優(yōu)勢種群和豐度有所不同，幼蟲在爬行過程中會使糞便富集食物中的細菌，從而使糞便中可以分離到未經(jīng)過腸道的細菌種類。在糞便樣本收集過程中，盡管采取了嚴格消毒和滅菌措施以減少人為污染，但寄主植物和幼蟲體表微生物對糞便微生物群落結構的影響仍不可避免（Stavrinides et al.，2009）；此外，由于不同種細菌在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)可能相近，可能導致觀察者在對細菌表型特征進行主觀判斷時出現(xiàn)誤差（閆寒等，2019）。

在復雜多變的生態(tài)環(huán)境中，微生物的存在對寄主昆蟲的生命活動具有重要意義。據(jù)報道，蒙氏腸球菌對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌具有廣譜抗菌活性（Grau et al.，2017），蒙氏腸球菌可通過分泌抗菌肽（抗生素）的方式殺滅其他細菌，從而使蒙氏腸球菌成為昆蟲腸道菌群中的優(yōu)勢種群，保護宿主抵抗病原菌侵染（Shao et al.，2017）；此外，蒙氏腸球菌除了參與昆蟲細胞運動、跨膜轉運和生物膜形成外，還可參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝和脂質代謝等多種代謝途徑（Mazumdar et al.，2021；常呂恕等，2022）。本研究發(fā)現(xiàn)，新鮮糞便中以蒙氏腸球菌為優(yōu)勢種，占據(jù)明顯的生態(tài)位，推測糞便中的蒙氏腸球菌可能通過與其他細菌爭奪糞便中的養(yǎng)分及分泌抗生素的方式，幫助馬鈴薯塊莖蛾幼蟲抵抗糞便中其他有害病原菌的侵染。同時，本研究從干糞便和新鮮糞便中均分離到鹽生谷氨酸桿菌，有研究表明鹽生谷氨酸桿菌具有降解茄科植物毒素龍葵素和卡茄堿的功能（Wang et al.，2022a，2022b），推測馬鈴薯塊莖蛾幼蟲可能通過排泄的方式將鹽生谷氨酸桿菌釋放到環(huán)境中從而降低馬鈴薯薯塊中的龍葵素和卡茄堿含量。葡萄球菌屬的菌株能產生化學信息素（Doug‐las，2015），如豌豆蚜蜜露中的松鼠葡萄球菌分泌的利它素可提高天敵昆蟲食蚜蠅的捕食效率（Leroy et al.，2010），本研究中干糞便和新鮮糞便中均分離到的松鼠葡萄球菌是否同樣可分泌利它素來引誘馬鈴薯塊莖蛾自然天敵前來捕食有待明確。本研究從馬鈴薯塊莖蛾糞便中分離到12屬19種細菌，其對宿主生物學特性的影響有待進一步探究。

4 結論

馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便中共可培養(yǎng)出3門6目11科12屬19種細菌。其中新鮮糞便中有3門5目9科9屬14種細菌，以蒙氏腸球菌為優(yōu)勢種，占據(jù)了明顯的生態(tài)位；而干糞便中有3門5目6科7屬11種細菌，以琥珀葡萄球菌和腐生葡萄球菌為優(yōu)勢種。馬鈴薯塊莖蛾幼蟲糞便中的細菌種類豐富，新鮮糞便中可培養(yǎng)細菌種類組成相對集中且群落表現(xiàn)出較高的物種豐富度，干糞便則展現(xiàn)出更均勻的細菌群落種類組成。

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（責任編輯 麻小燕）